Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utarbeidelse av Primary Myogenic Precursor Cell / myoblast kulturer fra Basal virveldyr Lineages

Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51354
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

Summary

In vitro kultur systemer har vist seg uunnværlig for vår forståelse av virveldyr myogenese. Imidlertid gjenstår mye å lære om nonmammalian skjelettmuskelutvikling og vekst, spesielt i basal taxa. En effektiv og robust protokoll for å isolere de voksne stamceller i dette vevet, myogenisk forløper celler (MPCs), og opprettholde sin selv-fornyelse, proliferasjon og differensiering i en primærkultur innstilling muliggjør identifisering av konserverte og divergerende reguleringsmekanismer i hele virveldyr linjene.

Abstract

På grunn av den iboende vanskeligheter og tid involvert med å studere myogenisk program in vivo, primærkultursystemer som stammer fra de fastboende voksne stamceller av skjelettmuskulatur, de myogeniske forløper celler (MPCS), har vist seg uunnværlig for vår forståelse av pattedyr skjelettmuskelutvikling og vekst. Særlig blant den basale taxa av Vertebrata, men data er begrenset beskriver de molekylære mekanismene som kontrollerer selvfornyelse, spredning og differensiering av MPCs. Av spesiell interesse er potensielle mekanismer som ligger til grunn for evnen til basale virveldyr å gjennomgå betydelig postlarval skjelett myofiber hyperplasia (dvs. beinfisk) og full regenerering følgende vedheng tap (dvs. urodele amfibier). I tillegg kan bruk av dyrkede myoblaster hjelp i forståelsen av regenereringen, og gjentagelse av de myogenic program, og forskjellene mellom dem. Ådette for øye, vi beskriver i detalj en robust og effektiv protokoll (og varianter der) for å isolere og vedlikeholde MPCs og deres avkom, myoblasts og umodne myotubes, i cellekultur som en plattform for å forstå utviklingen av myogenisk programmet, som begynner med den mer basal virveldyr. Utnytte modellorganisme status for sebrafisk (Danio rerio), rapporterer vi om anvendelsen av denne protokoll til små fiskene i cyprinid clade Danioninae. I tandem, kan denne protokollen brukes til å realisere en bredere komparativ tilnærming ved å isolere MPCs fra den meksikanske Axolotl (Ambystomamexicanum) og til og med laboratorie gnagere. Denne protokollen er nå mye brukt i å studere myogenese i flere fiskearter, inkludert regnbueørret, laks, og sea bream 1-4.

Introduction

Betydelig forståelse av pattedyr myogenese er innhentet gjennom reprisen av denne prosessen i både primær mus (Mus musculus) myoblast kulturer og godt beskrevet mus-avledet cellelinje, C2C12 fem. Starten i 1950 6, har disse kulturene førte til mye fremme i forståelsen av murinemyogenic programmet, og i forlengelsen, myogenese i andre virveldyr. I tillegg har enkeltcelle myofiber eksplantering teknikker økt ut forståelse av interaksjonen mellom satellittceller og omkringliggende myofibers 7-9. Cellekulturer er spesielt attraktivt for undersøkelser av myogenese grunn av den korte tiden fra forløperen til differensiert celle 10, relativt enkelt transfeksjon for RNAi 11-14, transgene 15,16 og overekspresjon studier 14,17,18, in vitro ekspansjon etterfulgt av in vivo transplantasjon 18-20, og til og med kompArison av myogeniske forløper celler og deres regulerings agenter over taxa 21,22. Mens forskjeller på grunn av kunstig miljø av kulturen systemet har blitt beskrevet 5,23, har disse in vitro-systemer vist seg å være uunnværlig for vår disseksjon av den intrikate program som styrer dannelsen av multinucleated, terminalt differensiert myofibersfrom mononukleærerte proliferative stamceller kalles myosatellite celler (MSCS) blant pattedyr.

Utenfor av klassen Mammalia, men bevaring og / eller divergens av mekanismene som styrer myogenese er dårlig forstått, hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med dyrking myogeniske forløper celler (MPCS) og myoblasts fra ulike taxa. Faktisk har primærinnsidere myoblast kulturer bare blitt beskrevet i tre fugler 24-26, en reptil 27, noen amfibier 28-30, og noen fisker 1,3,4,31-33. Kontinuerlige myogeniske cellelinjer fra veandre enn gnagere 34-36 rtebrates er enda mer sjeldne, med den eneste ikke-pattedyr myogenic cellelinje som blir avledet fra japansk vaktel (Cortunix japonica), QM7 37. Til tross for mange forsøk på immortalization, er fortsatt en bein myogenic cellelinje unnvikende og en protokoll for effektiv transfeksjon av disse cellene ble kun utgitt i år 15. Dermed er klare og godt optimalisert protokoller for dyrking primære MPCs og myoblasts fra en rekke virveldyr veldig mye nødvendig å ikke bare ytterligere utvide vår kunnskap om utviklingen av myogenisk program, men å ansette kraften i sammenlignende fysiologi å gjøre gjennombrudd i ved behandling av human skjelettmuskelsykdommer og lidelser.

Mens litteraturen inneholder mange rapporter om MPC / myoblast isolasjon 38-49, er det vanlig for forfattere å beskrive protokoller for slike isoleringer i korte, ofte ufullstendige, formater. Videre, de mest lærerike protokollene reported har blitt utviklet for mus 50-53, og noen av disse er avhengige av antistoff utvalg 54,55 eller fluorescens transgener 56,57, noe som gjør disse protokollene ubrukelig eller upraktisk innerste ikke-gnagerarter benyttes av muskel biologer. Med lite kjent om piscine, amfibier, og reptil myogenese, en detaljert og grundig protokoll, beskrevet med audiovisuelle veiledning og med demonstrert effektivitet i fjernt beslektede arter, ville være mest nyttig til feltet.

Først beskrevet av Powell og kolleger i 1989 58, ble følgende protokoll opprinnelig utviklet for å isolere MPCs og myoblasts fra laksefisk (nemlig regnbueørret, Oncorhynchus mykiss, og atlantisk laks, Salmo salar) og noen større karpefisker (dvs. gullfisk, Carassiusauratusauratus) . I 2000, Fauconneau og Paboeuf optimalisert en primær myoblast kultur for regnbueørret 59, og minoroptimizations made at protokollen utilizable i flere mindre ørekyt i Danioninae clade (sebrafisk, Danio rerio, og gigantiske Danio, Devario aequipinnatus) 32 på grunn av de mange genetiske verktøy tilgjengelig for sebrafisk arbeid og dermed dets nære slektninger. Beinfisk er attraktive organismer for studien på grunn av deres avvikende vekststrategi (i hvert fall i de fleste arter). Store laksefisk, som de fleste fisker, vokse indeterminately, med vekstpotensial ubundet av en asymptote ved forfall, selv i høy alder 60-62. I motsetning til sebrafisk, store danionins som den store Danio 63 og barte Danio skjerm vekstpotensialer typisk for beinfisk, noe som gjør deres direkte sidestilling en ideell plattform for forståelse om MPC celle skjebne valg spiller en rolle i skjelettmuskulatur hyperplasi versus hypertrofi.

Likeledes har vi vist at denne protokollen kan brukes med mus og axolotls, med relativt høy celleutbytte og viability indekser. Urodele salamandere, for eksempel meksikanske Axolotl (Ambystomamexicanum), har bemerkelsesverdig evne til å regenerere vev, inkludert hele lemmer og haler 64-66. Denne egenskapen gjør disse amfibier interessante modeller av skjelettmuskelsvinn og aldring. Ved hjelp av protokollen beskrevet nedenfor, kan en lignende tilnærming foretas som har blitt gjort i mange fiskearter, noe som gir et enda bredere komparativ kontekst for slike studier. Som mange virkelig komparative biologer setter pris på, de mest meningsfulle fremskritt innen grunnleggende biologi og translasjonell biomedisin kan gjøres når data analyseres innenfor det bredeste spekteret (her, hele virveldyr avstamning).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk Uttalelse: All eksperimentering involverer virveldyr som er beskrevet her ble godkjent på forhånd av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Alabama i Birmingham og er i samsvar med retningslinjer fastsatt av Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health i USA Department of Health and Human Services.

En. Forberedelse til Kultur

  1. Klargjør basismedium som følger: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9.53 g per 2 L) i DMEM (13,48 g / l, 26.96 g per 2 L).
    1. Bestem pH og juster til 7,40 med HCl eller NaOH.
    2. Bestem osmolalitet og justere til ~ 300 mOsm med NaCl (hvis nødvendig).
    3. Filter sterilisere med (2) 1 L vakuum sterilisering systemer og oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys i opptil 2-3 måneder.
      MERK: Se tabell 1 og 2 for fullstendig reagens, verktøy, consumdringer, og utstyrsinformasjon.
  2. Forbered poly-L-lysin-behandlede plater ved å oppløse 5 mg av γ-bestrålte poly-L-lysin (> 300 000 mw) i 50 ml ultrarent sterilt vann. Bland forsiktig ved å vende i 10 minutter ved romtemperatur, noe som sikrer fullstendig oppløsning av lysin polymerer.
  3. Pipetter den nødvendige mengden av poly-L-lysin-løsning til hver brønn, i henhold til den platetypen (tabell 3). Tillat platene stå i laminær strømningshette i 5 minutter.
  4. Deretter fjerner poly-L-lysin-oppløsning og vaskes to ganger med sterilt vann. Tillat plater lufttørke i laminær hette for 20 minutter.
  5. Innhent 1 mg av laminin (Engelbreth-Holm-sverm opprinnelse) og oppløses i 50 ml av basismedium til en endelig konsentrasjon på 20 pg / ml. Påfør laminin løsning på poly-L-lysin-behandlede cellekulturplater ved 2 pg / cm 2. (Se tabell 3 for ulike plate størrelser)
  6. Virvle løsningen for å sikre full vel dekning. Forsegl plater med laboratoriebånd som legges i inkubator i 24 timer. Inkubatoren skal settes til riktig temperatur for arter som blir brukt (se tabell 7), og ingen ekstra gasser må legges til inkubatoren.
    MERK: Laminin må få lov til å følge plater for 24 timer før såing celler. Unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i dårlig eller ingen mobil tilslutning.
  7. Forbered medier som beskrevet i tabell 4. Complete media er best fremstilt i dag i bruk.
  8. I forberedelsene til vev isolasjon, montere følgende elementer og autoklav: 300-500 ml begerglass (s); glass petriskåler; skalpell håndterer; tang (fin og grov); disseksjon saks; og flere ark med vannavstøtende autoklav papir.
    MERK: For hver person som bistår med disseksjon prosessen, (2) skalpellskaft, (1) tang (type avhengig av personlige preferanser), (1) disseksjon saks, og (5-10) ark med vannavstøtende autoklav papir ertilstrekkelig.
  9. I tillegg til de autoklaveres elementene ovenfor, sammen 70% etanol, en vektbalanse, sterile 50 ml koniske rør (antallet avhenger av størrelsen av kultur), og is.

2. Tissue Dissection

  1. Før du begynner, må du sørge for at et tilstrekkelig lager av fisk er tilgjengelig.
    MERK: I en alder av fisk som skal brukes er av avgjørende betydning. Mens fisk av to forskjellige arter kan være av lignende vekter, vil en yngre fisk av en art har flere MPCs enn en eldre fisk av en annen art. Som en generell regel, yngre fisk, spesielt når du arbeider med laksefisk, er best. For danionins, kan fisken like gammel som ett år utnyttes optimalt, mens laksefisk i alderen 4-6 måneder eller yngre (opp til 15 g) er optimale.
  2. For hver 5 g vev som skal dissekert, alikvoter 25 ml isoleringsmedium inn i et sterilt 50 ml konisk rør.
  3. Vei opp, ta opp massen, og nummeret på røret (e). Plasser rørene på is.
  4. Avlive 2-3 fiski en tid med full neddykkelse i> 300 mg / L sodium bicarbonate-bufret Tricaine methanesulfonate. Tillat opercular bevegelsen til å opphøre på> 5 minutter, og deretter dyppes fisk i 70% etanol (inneholdt i den sterile begre) i 30 sekunder.
  5. Fjern fisk fra 70% etanol og plasser på vannavstøtende autoklav papir. Rett bak opercula, bruke en skalpell til å gjøre en overfladisk, grunt snitt. Fjern skjell og huden ved å ta tak i huden på nevnte snitt og dra mot halen av fisk.
  6. Etter hud fjerning, avgiftsdirektoratet epaxial, farts glycolytic "hvite" muskel av fisk fra begge sider (for å unngå sakte oksidativt 'røde' muskel som ligger nær sidelinjen) og plasser i isolasjon medium. Kast den resterende del av fisken som kreves av institusjon.
    MERK: Selv om det er fullt mulig å kultur MPCs stammer fra rød muskel, har nesten hver publikasjon hjelp teleost MPCs benyttet celler isolert fra epaxial myotome.
  7. Gjenta trinn 2,4 til 2,6 inntil en tilstrekkelig mengde av muskel er oppnådd. Under disseksjon, sikre at sammenslåtte muskelvev forblir på isen for å opprettholde celle levedyktighet.

Tre. Mechanical Dissosiasjon

  1. Hell en tube på 25 ml / 5 g muskelvev til et glasspetriskål. Ved hjelp av to skalpell håndtak med vedlagt # 10 skalpellblader, kjøttdeig vev til en slurry eller puré konsistens. En "back-og-tilbake" bevegelse for å trekke de skalpellblader forbi hverandre fungerer best.
    MERK: Mens vev homogenizers kan virke hensiktsmessig, vil antall levedyktige celler bli dramatisk redusert, om ikke avskaffet.
  2. Ved hjelp av en 25 ml serologisk pipette og serologisk pipette, fjerne slemmet vev og erstatte i den opprinnelige konisk tube.
  3. Gjenta trinn 03.01 til 03.02 frem til alle vev i alle rør er mekanisk dissosiert.
  4. Sentrifuger vevet i 5 minutter ved 300 xg og 10 ° C.
  5. Føllgrunn sentrifugering, kast 25 ml av media supernatant med en 25 ml serologisk pipette, vakuum vifte, eller ved forsiktig dekantering.
  6. Tilsett 25 ml av vaskemedium til hvert rør, resuspender vev, og recentrifuge som ovenfor.
  7. Vask to ganger med vaskemedium, fjerning av supernatanten hver gang.

4. Enzymatisk Dissosiasjon

  1. Under trinn 3.4, forberede kollagenase-løsning ved å kombinere 0,22 g av type IV kollagenase og 44 ml av basismedium (eller i tilstrekkelig mengde på 0,11 g/0.22 ml).
  2. Rør inn et beger i 10-15 minutter ved 4 ° C. Filter sterilisere med en 50 ml sprøyte og en 0.45 mikrometer sprøytefilter.
    MERK: Mer enn ett sprøytefilter kan være nødvendig, avhengig av collagenase preparatet. Kollagenase innhentet fra andre enn Worthington Biokjemisk leverandører utgjør mer problemer under filtrering. Kollagenase blir brukt til å dissosiere peptidbindinger i kollagen som utgjør endomysium. Dettefordøyelsen vil fjerne den beskyttende barriere av myofibers.
  3. For hver g av muskelvev, resuspender vevet i en 0,2% kollagenase-løsning. Til 5 g av muskelvev, tilsett 10 ml kollagenase-løsning og 15 ml av basismedium.
  4. Tilsett 10 pl av PSF pr ml collagenase-løsning / basemedium (for eksempel 250 pl til 25 ml). Sikre at vevet er godt suspendert, da dette vil påvirke effektiviteten av den enzymatiske fordøyelse.
  5. Inkuber muskelvev in collagenase i 60 minutter ved 18 ° C med forsiktig gynger. Avhengig av graden av mekanisk dissosiasjon og arter, kan kollagenase fordøyelse bli forlenget til 90 minutter, selv om dette kan påvirke cellenes levedyktighet.
  6. Etter collagenase fordøyelse, sentrifuger koniske rør ved 300 xg i 5 minutter ved 12 ° C. Kast supernatanten og resuspender vev i 25 ml vaskemedium.
  7. Recentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 126; C. Gjenta med vasking medium en gang.
  8. Etter vasking to ganger i vev, resuspender muskelvev i 25 ml vaskemedium og Trituratet med en 10 ml serologisk pipette inntil vev / medium homogenat passerer inn og ut av pipetten med relativ letthet. 5-10 Triturations er vanligvis tilstrekkelig.
    1. Gjenta fremgangsmåten med en 5 ml serologisk pipette og deretter en 16 gauge metall kanyle festet til en sprøyte.
  9. Sentrifuger koniske rør ved 300 xg i 5 minutter ved 12 ° C. Dekanter supernatanten.
  10. Under den ovennevnte 5 minutters sentrifugering, forberede trypsin-slutningsoppløsningen ved å kombinere 0,25 g av trypsin med 5 ml av basismedium.
  11. Omrør ved 4 ° C i 10-15 minutter og filter sterilisere med en 20 ml sprøyte og 0,45 um sprøytefilter.
  12. Hent koniske rør og tilsett 100 ul trypsin-løsning og 4,9 ml av dissosiasjon medium for hver 1 g av muskelvev til hvert rør. For EXAmple, tilsett 500 pl trypsin-løsning og 24,5 ml av dissosiasjon medium til 5 g av muskelvev.
    MERK: Trypsin er en serin protease som vil skille myogeniske forløper celler fra basal lamina.
  13. Resuspender vev i trypsin / dissosiasjon middels godt. Inkuber i 20 minutter ved 18 ° C.
  14. Etter den første trypsin inkubasjon centrifuge koniske rør ved 300 x g i 1 min ved 12 ° C.
  15. Nøytraliser trypsin ved å kombinere supernatantene med isolasjonsmedium i en konsentrasjon fra 1 volum av supernatant til 4 volumer av isoleringsmediet. Lagres ved 4 ° C i løpet av andre trypsin fordøyelsen.
  16. Til den gjenværende pellet av vev, gjenta trinn 4,12 til 4,15, ved å kombinere supernatanten følgende trinnet 4.15 med supernatanten / isoleringsmedium fra den første trypsin fordøyelsen.
  17. Alternativt: kollagenaseklassene og trypsin digestions kan kombineres for å maksimere celleutbytter. <ol>
  18. For å gjøre dette, Triturer kollagenase fordøye ved hjelp av en metall-kanyle (6 i lengde-og 16 gauge fungerer best) festet til en 20 ml sprøyte til homogenatet lett passerer gjennom kanylen.
  19. Til homogenatet, tilsett 500 ul trypsin-løsning (fremstilt i trinn 4.10) og inkuberes ved 18 ° C i 20 minutter.
  20. Etter inkubering sentrifuge koniske rør ved 300 x g i 1 minutt ved 12 ° C.
  21. Nøytraliser trypsin ved å kombinere supernatantene med isolasjonsmedium i en konsentrasjon fra 1 volum av supernatant til 4 volumer av isoleringsmediet.
  22. Lagres ved 4 ° C i løpet av andre trypsin fordøyelsen.
  23. Fortsett med trinn 4,18 som med standardprotokollen.
  • Tilsett den endelige supernatant / isolasjon medium blandingen i 50 ml koniske rør og sentrifuger ved 300 xg i 10 minutter ved 12 ° C.
  • Fjern Supernatantene ta vare for ikke å forstyrre cellenpellets. Pipetter 2 ml fullstendig medium til hvert rør, oppløsende hver cellepellet.
  • Kombiner celler suspendert i komplett medium i en 50 ml konisk tube.
  • Skyll hvert rør med 1 ml fullstendig medium, og kombinerer med bassenget av celler resuspendert tidligere.
  • Triturer med en metall-kanyle og sprøyte på 5-10 ganger.
  • Filter cellesuspensjon gjennom en 100 mikrometer celle sil, skylling med komplett medium.
  • Filtrer cellesuspensjonen gjennom et 40 mikrometer celle sil.
  • Legg tilstrekkelig komplett medium til 50 ml og sentrifuger ved 300 xg i 10 minutter ved 15 ° C.

    • 5. Telle, fortynning, og Seeding av celler

    1. Etter den siste sentrifugering i trinn 4.25, fjern supernatanten ved forsiktig dekantering eller med en serologisk pipette. Resuspender cellepelleten i 5 ml fullstendig medium.
    2. Med celler fullt resuspendert, fjerne 20 mL; Av cellesuspensjonen, og plasser i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    3. Tilsett 5 mL av Trypan blått fargestoff og vent 5 minutter. Ved hjelp av en hemocytometer, bestemme antall levedyktige celler.
    4. Ved bestemmelse, fortynn cellene til den nødvendige konsentrasjon. Teleost MPCs er best seedet på 150,000-200,000 celler per cm 2. For en seks-brønns plating strategi, fortynne celler til 1,5 x 10 6 til 2,0 x 10 6 per ml støtter tilstrekkelig spredning og differensiering.
    5. Hent poly-L-lysin-behandlede, laminin-belagte plater og frø-celler. (Se tabell 5 for platespesifikke fortynninger og pletteringsvolumer.) NB: Tabell 6 viser gjennomsnittlig antall celler isolert per gram av muskelvev isolert fra teleost forskjellige arter. Regnbueørret (O. mykiss) utviser færre MPCs per gram muskelvev enn gjør sebrafisk (D. rerio) og vil dermed kreve mer fisk å isolere fra for riktig seeding.
    6. Tett plater med laboratorie tape og plasser i chilling inkubator ved riktig temperatur. MPCs fra alle arter som er oppført her (lagre for mus) kan inkuberes under normale atmosfæriske forhold uten karbondioksid (CO 2) tilskudd. (Se tabell 7).
    7. ALTERNATIVT: Noen laboratorier har vedtatt en protokoll som krever slik MPCs å følge den kulturen grunnen i 40 minutter.
      1. Skyll plater med vaske media for å fjerne eventuelle løst festet og ikke-heftende celler. Advarsel: Dette trinnet er svært viktig å unngå "uspesifikk" heft av andre celler (f.eks fibroblaster) til kultur grunnen.
      2. Legg komplette media og sted celler i kuvøse og omsorg for som beskrevet nedenfor.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tjuefire timer etter såing, myogeniske forløper celler (MPCS) skal være synlig festet til laminin grunnen (se figur 1a og 1d). Etter såing, celler (MPCS) innta en spindel-lignende form, en indikasjon på denne celletype (figur 1) og er MyoD1 + (figur 2). I Danio artene, MPCs synes å være mer kompakt med mindre bipolare prosesser enn gjør MPCs fra Oncorhynchus og Salmo arter. Men over fire dager med kultur, MPCs fra alle piscine arter undersøkt vedta lignende morfologi og ser tydelig ut som myoblasts (Tall 1b og 1e). Komplett media bør fjernes, og MPCs bør vaskes to ganger med vask medium. Myofibroblasts kan forurense myogeniske kulturer og er lett gjenkjennelig fra MPCS / myoblasts av deres stjernelignende morfologi (versus nåleform av myoblast). Vasking av platene i sterktmproves fjerning av slike fibroblaster.

    I de artene som er beskrevet her (se tabell 7), daglige medie endringer gir de beste resultatene. MPCs og avkom (myoblasts og begynnende myotubes) bør vaskes en gang eller to før tillegg av friske komplett medier. Alternativt, kan medie endringer reduseres til hver annen dag etter at cellene har nådd den endelige myoblast fasen (ca. dag 4 i kultur). Myotubes bør danne innen 2-3 dager (Tall 1c og 1f) og bli myogenin + (figur 2), spesielt når dyrket i differensiering medium (se nedenfor). Mens perioder på uker til måneder har blitt rapportert i flere pattedyr-arter, har piscine MPCs og myoblaster ikke ut til å tåle slike perioder. Cellene sprer for de første seks dagene av kultur (figur 3), med påfølgende differensiering mellom dager 7 og 9-11 kultur. Etterpå celler Senescence eller enpoptose.

    Myogenisk natur MPCs og deres avkom isolert ved hjelp av denne protokollen har blitt bestemt 3,32,33 basert på genuttrykk. I motsetning til pattedyr kultur-systemer, er spredning av MPCs og myoblast avkom relativt lav i de første dagene av kultur (i forhold til systemer som benytter primære murine myoblasts eller C2C12), med rask økning oppdaget som cellene danner umodne myotubes under dager 6-9 av kultur i Danio artene 32. Rapporter fra regnbueørret har utnyttet en differensiering medium (vanlig i pattedyr myoblast kulturer, men ikke nødvendig i piscine systemer) og indikere at spredning indeksene nedgang som forventet med myotube formasjon 33. I våre hender, kan de resulterende myotubes forbli i kultur for opp til 9-11 dager (Danio arter) og 11-13 dager (Oncorhynchus arter) før mobilnettet senescence eller apoptose skjer.

    Reagens Company (Preferred v. Alternativ) Katalognummer (Preferred v. Alternativ) Antall per Kultur
    γ-bestrålte poly-L-lysin Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (høy glukose) Sigma-Aldrich (Cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Natriumbikarbonat (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1,51 g
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9,53 g
    Antibiotika / Anti-fungal Thermo Scientific (SIgma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 ml
    Gentamicin sulfat Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 ml
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 ml
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 ml
    Kollagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0,44 g
    Trypsin (fra Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g

    Tabell 1 Detaljert reagenslisten med foretrukne produsent og katalognummer..

    Konsum Verktøy Utstyr
    Cell Kultur Plates Tang (Grov) Serologisk Pipettor
    Sterile 50 ml koniske rør Tang (Fin) pH Meter
    Laboratory Tape Skalpell Handles Chilling Inkubator (Echotherm)
    0,2 mikrometer Vakuum Sterilisering Systems Skalpellblader (# 10, # 11) Laminar Flow Hood
    Vannavstøtende Autoclave Paper Kirurgisk saks Vacuum Manifold
    Serologiske pipetter Glass petriskåler Microosmolality Meter
    12-16 G kanyler med Luer Låser

    Tabell 2. Forbruksvarer, verktøy og utstyr som trengs for cellekultur.

    Plate Størrelse cm 2 per Vel Poly-L-lysin * Laminin **
    6 godt 9.5 1,6 ml 1
    24 godt 1.9 0,32 0,2
    48 godt 0,95 0,16 0,1
    96 godt 0,32 0,06 0,03
    * 0,1 mg / ml konsentrasjon ** 0.020 mg / ml konsentrasjon

    Tabell 3. Optimalisert volumer for belegg celledyrkingsplater med poly-L-lysin og laminin.

    Reagens Isolasjon Vask Dissosiasjon Komplett
    Base Medium 419,25 ml 395,40 ml 297,00 ml 178,00 ml
    PSF * 5,00 ml 4,00 ml 3,00 ml 2,00 ml
    Gentamicin sulfat ** 0,75 ml 0,60 ml - -
    Donor Equine Serum 75,00 ml - - -
    Fetal Bovine Serum *** - - - 20,00 ml
    * PSF: penicillin / streptomycin / Fungizone cocktail (100x); ** 50 mg / ml konsentrasjon; *** Karakterisert

    Tabell 4 Ulike medie forberedelsene til isolasjon og kultur av myogeniske forløper celler (MPCS)..

    <td> 9,5
    Plate Størrelse cm 2 per Vel Fortynning Plating Volume
    6 godt 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 1 ml
    24 godt 1.9 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 250 mL
    48 godt 0,95 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 150 mL
    96 godt 0,32 1,5 - 2,0 x 10 6 celler / ml 50-100 mL

    Tabell 5. Anbefalte fortynninger og plating volumer av cellekultur plate vel størrelse.

    Arter Gjennomsnittlig # celler / g vev
    Danio rerio 6400000
    Danio dangila 1783000
    Devario aequipinnatus 1797000
    Oncorhynchus mykiss 66800

    . Tabell 6 Gjennomsnittlig antall myogeniske forløper celler isolert fra 1 gram av muskelvev fra ulike teleost arter: Danio rerio (sebrafisk), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (giganten Danio), og Oncorhynchus mykiss (Regnbueørret).

    Arter Temperatur
    Danio / Devario spp.. 26 - 28 ° C
    Oncorhynchus / Salmo spp. 10 * - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * Lavere temperaturer støtter lavere spredning priser.

    Tabell 7. Anbefalt inkubasjonstemperaturer for piscine og amfibier myogenisk precursor celler (MPCS).

    Figur 1
    Figur 1. Representative lyse feltet bilder av MPCs (lengst til venstre), myoblasts (i midten), og tidlig myotubes (lengst til høyre) fra to arter, regnbueørret (Oncorhynchus mykiss, øverst) og sebrafisk (Danio rerio, nederst).

    Fig. 2
    Figur 2. Representant immunocytochemical farging av MPCs (a, c) og myotubes (B, D) isolert og kultivert fra giganten Danio (Devario aequipinnatus, øverst) og regnbueørret (Oncorhynchus mykiss, nederst). I kultur, myoblasts er MyoD1 + positive (a, c)som visualiseres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige MyoD1 + antistoffer (Danio: C-20, Santa Cruz Bioteknologi; ørret: NB100-80899, Novus Biologicals). I tillegg, som myoblasts differensiere, uttrykker de myogenin (b, d) som visualiseres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige myogenin antistoffer (Danio: M-225; ørret: SC-567, begge fra Santa Cruz Bioteknologi).

    Figur 3
    Figur 3. Representative celleproliferasjon data ved hjelp av BrdU å måle celleproliferasjon priser over tid i kultur. Data innhentet fra MPCs isolerte og dyrket fra giganten Danio 67.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den myogenic program, i hvilken undersøkte arter, kan lettest undersøkt ved en in vitro-system. Faktisk, på isolasjon, myogeniske forløper celler (MPCS) i fisk eller myosatellite celler (MSCS) i pattedyr lett inn i denne svært regulert prosess som involverer spredning, cellesyklus tilbaketrekking, og terminal differensiering av myoblasts og sammensmeltingen av disse myoblasts inn gryende myotubes. Den generelle mangelen på transgene genet reporter stammer av piscine arter (med mulig unntak av sebrafisk 67 og regnbueørret 69) begrenser in vivo arbeidet med MPC / MSC aktivisering, spredning og differensiering, og dermed in vitro system som presenteres her er en attraktiv plattform for studier i fiskearter.

    Vellykket kultur av MPC / MSCS, uansett arten, er svært avhengig av a) grundig hensyn til sterilitet; b) grundig mekanisk dissosiasjon av skjelettmuskulatur tproblemet; og c) optimalisering av enzymatisk oppslutning. I løpet av de første trinnene av muskelvev isolasjon, må det utvises stor forsiktighet for å sikre at den nødvendige mengden av vev er fjernet uten forurensning. Det er av største betydning at fisk (eller noen dyr blir utnyttet, for den saks skyld) er riktig desinfiseres i 70% etanol og for tilstrekkelig tid. I våre hender, fungerer 30 sekunder best; kortere perioder kan resultere i forurensning og lengre, tap av vev integritet og cellelevedyktighet. Etanol kan benyttes som et bindemiddel, slik at forsiktighet må utvises for ikke å tørke fisk før disseksjon. Disseksjon kan gjøres utenfor en laminær cellekultur hette; men vi anbefaler at denne prosessen gjøres innen en hette for å minimalisere eventuelle bakterier eller sopp forurensning.

    Mens den mekaniske dissosiasjon beskrevet ovenfor kan virke råolje og / eller langtekkelig i begynnelsen, er det avgjørende å isoleringsprosedyren. To store skalpellblader, trakk forbihverandre i en glidende bevegelse (som vist i videoprotokoll), gir de beste resultater. Når ferdig, bør konsistensen av homogenatet være at en oppslemming eller puré, og lett samles med en bred-boring serologisk pipette (dvs. 25 ml). Bare, jo bedre den mekaniske dissosiasjon, jo høyere MPC / MSC utbytte og jo bedre den resulterende kultur. Dårlig dissosiasjon vil hindre enzymatisk fordøyelse og redusere celle yield. Selv om det kan være fristende å vurdere, bruk av elektriske vev homogenizers senker dramatisk celleviabilitet til tross for sin åpenbare bekvemmelighet, i hvert fall med piscine MPCs.

    Som med alle protokoller, er optimalisering av fremgangsmåten beskrevet ovenfor ofte nødvendig. Dette har vist seg sant i vårt arbeid med flere danionin arter. Resultater fra vårt laboratorium tyder på at mindre danionins (f.eks sebrafisk) gi mer MPCs per gram av skjelettmuskulatur enn gjøre større arter (f.eks GImaur eller barte Danio). Dette er imidlertid bare realiseres dersom en høyere konsentrasjon av kollagenase (0,3%) brukes sammen med vev fra mindre arter. I våre hender, er en konsentrasjon på 0,2% hensiktsmessig for laksearter (f.eks regnbueørret, cutthroat ørret [Oncorhynchusclarki], Chinook laks [Oncorhynchustschawytscha]), de større danionins, Axolotl (Ambystomamexicanum) lem og hale, og selv mus skjelettmuskulatur. Likeledes må man sørge for å velge riktig collagenase. I vår erfaring, bevarer type IV collage celleviabilitet langt bedre enn kollagenaser anbefalt for fibrøs vev som bein og muskler (dvs. collage type II) 70. Mens fordøyelse kan være mer fullstendig i en kortere tidsperiode, blir cellemembran-reseptoren integritet sannsynlig kompromittert av økt tryptiske aktiviteten i disse preparater. Med hensyn til trypsin, har vårt laboratorium alltid utnyttet cruder trypsin forberedelse purified fra svin bukspyttkjertelen, snarere enn den "renere" forberedelser tilgjengelige. I vår kultur aktiviteter med ulike arter, har vi merket lite gunstig effekt av varierende trypsin konsentrasjoner.

    Trituration er kritisk til denne protokollen. Det begge dissosierer den fibrøse matrise i skjelettmuskulatur og øker overflatearealet for tryptisk fordøyelse samtidig manuelt å forstyrre den strukturelle integriteten til myofibers. Når du utfører de Triturations, suksessivt bruker mindre bore pipetter og kanyler er mye enklere enn å bruke kanylen og sprøyten straks. Fortsetter direkte til Triturations med en kanyle og sprøyte kan resultere i plugget kanyler og / eller for stort trykk blir anvendt på cellene. Bruk av trypcin uten tilstrekkelig trituration vil dramatisk redusere celleutbytte.

    Når de er isolert, er kulturen prosessen ganske enkelt. De fleste publikasjoner hittil har benyttet en protokoll viddh ett medium for både spredning og differensiering 33,71-75, inkludert vår egen; har imidlertid flere nyere artikler skrevet av flere franske etterforskere beskrevet en to mediene protokoll, med separate baserte medier og serum innhold for spredning og differensiering 33. Dette 'nyere' protokoll nærmere etterligner de som brukes i kulturen i murine MSC og myoblastsand ser ut til å forbedre spredning av tidlig stadium myoblasts 33 og kan være mer hensiktsmessig å kontrollere spredning og / eller differensiering av celler. Imidlertid, uten omfattende karakterisering av genekspresjon, er det vanskelig å fastslå hvorvidt en slik "spredning" media sparer også en mer "myoblast-lignende tilstand enn det tradisjonelle ett medium metodikk. Tidligere publikasjoner som beskriver genuttrykk, enten på karakterutskriften eller proteinnivå, rapportert ved bruk av tradisjonelle medier protokoll 3. Alternativt kan et enkelt medium (DMEM beskrevet heri) kan bli supplert med forskjellige konsentrasjoner av føtalt bovint serum (FBS): 10% for spredning og 2% for differensiering.

    Mens etterforskere ansette pattedyrcellekultur-systemer kan bli aklimatisert til å bruke karbondioksid atmosfærer for dyrking av disse cellene, den iboende forskjeller mellom terrestriske og akvatiske gassutveksling samtale for en annen tilnærming når dyrkning piscine eller vann-begrenset urodele celler, inkludert MPCs. Medier som er beskrevet her, er bufret med en piperazin-avledet, zwitterioniske organiske forbindelser [HEPES: 4 - (2-hydroksyetyl) piperazin-1-etansulfonsyre] og natriumbikarbonat (NaHCO3). Således er en inkubator med gassinjeksjon ikke nødvendig eller påkrevet for kultur av disse cellene. Enda viktigere, bør slike inkubatorer ha evnen til å avkjøle i stedet for varme, som temperaturer som trengs for å kultur piscine og urodele MPCs varierer mellom 18-26 ° C. Videre kan laksefisk MPCs være cultured ved lavere temperaturer, hvis nødvendig, ytterligere understreker behovet for en kjøle inkubator. I tillegg har vi funnet (som har andre forskere, som kommunisert tidligere) at tetningen av kulturplater er nødvendig for å bevare cellulære levedyktighet. Bare innpakning grensesnittet mellom kultur lokket og plate med standard laboratorie tape er tilstrekkelig til å realisere dette målet.

    Mens aging av både primær MPCs / MSCS / myoblasts er vanlig i pattedyrcellekultur, ser det ikke ut til å være mulig med piscine celler, i hvert fall før sent Mb stadiet (rundt dag 6 av kultur). Derfor må riktig antall celler tilstrekkelig til å støtte spredning og for å nå målene i forsøket bli seedet på initiering av kulturen. Videre, hvis det er mindre enn forventet celleutbytte er oppnådd, er det ikke mulig å spre cellene og deretter replate avkommet senere. Vi har tilskrevet dette karakteristisk for den økte avhengigheten på extracellular matrix (ECM) av piscine MPC / myoblasts. Alternativt er det mulig at dette er en gjenstand av laminin underlaget og dermed ytterligere empirisk bestemmelse av ECM-komponenter som er nødvendige for piscine MPC / Mb spredning og differensiering er berettiget. Vi konstaterer imidlertid at flere av våre samarbeidspartnere har fjernet sent stadium myoblasts (~ dag seks av kultur) fra kultur grunnen og replated disse cellene (JM Froehlich og PR Biga, personlig meddelelse).

    Ved hjelp av denne protokoll eller en som ligner på det, eksperimenter med RT-PCR 3,71-74,76-78, Western blot 32,79-81, immunocytochemistry 32,33, spredning analyser 32,33,59, genet transfeksjon 15, morfometrisk analyse 78, toksikologi screening 82, og kromatin immunoprecipitation (chips; JM Froehlich og PR Biga, upubliserte resultater) er blitt gjort. Men ytterligere beskrivelser av tilleggs i vitro protokoller, nemlig de som involverer aging og klonal formering, er veldig mye som trengs. Faktisk, den Rodgers laboratoriet 15 gjort betydelige fremskritt i kulturen piscine MPCS / myoblasts ved å optimalisere en protokoll for å indusere transfeksjon av regnbueørret myoblasts. Basert på denne metoden, videre undersøkelser som involverer RNAi eller overekspresjon av skjelettmuskelspesifikke mål, spesielt de antatt å være involvert med livslang vekst baner av teleost fisker, er ikke bare mulig, men kan føre til betydelige fremskritt i akvakultur og biomedisinske områder av vitenskap.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Det er ingenting å avsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne ønsker å utvide mange takk til legene. Josep Planas og Juan Castillo for sin faglige kompetanse i utvikling og anvendelse av denne kulturen protokollen til små fisk og amfibier. En takk også til de utallige personer som har utrettelig bistått med disseksjon og dissosiasjon av muskelvev fra mange fisk (både i arter og antall), inkludert Matthew Lade, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, og Sinibaldo Romero. Dette arbeidet ble støttet av University of Alabama i Birmingham Institutt for Biologi oppstart midler, Senter for Protease Forskning NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350, og NDSU Advance FORWARD NSF Grant # HRD-0811239 til PRB. Støtte ble også gitt av UAB Ernæring Fedme Research Center award # P30DK056336, NIH NIDDK. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvisrepresenterer de offisielle visningene av NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345 (2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    Tags

    Grunnleggende Protocol myogenese sebrafisk myoblast cellekultur gigantiske Danio barte Danio myotubes spredning differensiering Danioninae Axolotl
    Utarbeidelse av Primary Myogenic Precursor Cell / myoblast kulturer fra Basal virveldyr Lineages
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Froehlich, J. M., Seiliez, I.,… More

    Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter