Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Published: April 30, 2014 doi: 10.3791/51354
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

Summary

בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ההתחדשות העצמית שלהם, שגשוג, ובידול בהגדרת תרבות העיקרית מאפשר זיהוי של מנגנוני פיקוח שימור ומסתעפים לאורך שושלות חוליות.

Abstract

בשל הקושי המובנה והזמן כרוך בלימוד תכנית myogenic in vivo, מערכות התרבות עיקריות נובעות מתאי גזע בוגרים תושב שרירי שלד, התאים המבשר myogenic (MPCs), הוכיחו הכרחיות להבנה של התפתחות שרירי שלד שלנו ושל יונקים צמיחה. במיוחד בקרב המינים הבסיסיים של Vertebrata, עם זאת, הנתונים הם מוגבלים המתאר את המנגנונים המולקולריים שליטה החידוש העצמי, שגשוג, והתמיינות של MPCs. עניין מיוחד הם מנגנונים אפשריים העומדים בבסיס היכולת של בעלי חוליות הבזליים לעבור היפרפלזיה ניכרת postlarval שלד myofiber (חוליות דגים כלומר) והתחדשות מלאה הבאות אובדן סרח (כלומר urodele דו חיים). בנוסף, השימוש בmyoblasts התרבותית יכול לסייע בהבנה של התחדשות והשחזור של תכנית myogenic וההבדלים ביניהם. אללצורך זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול חזק ויעיל (ווריאציות בו) לבידוד ושמירה על MPCs וצאצאיהם, myoblasts וmyotubes לא בוגר, בתרבית תאים כפלטפורמה להבנת האבולוציה של תכנית myogenic, החל יותר בעלי חוליות בסיס. וניצול של מעמדו אורגניזם המודל של דג הזברה (Danio rerio), אנו מדווחים על היישום של פרוטוקול זה לדגים קטנים של clade cyprinid Danioninae. במקביל, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי להבין גישה השוואתית רחבה יותר על ידי בידוד MPCs מהאמביסטומה המקסיקנית (Ambystomamexicanum) ואפילו המכרסמים מעבדה. פרוטוקול זה הוא כיום בשימוש נרחב בלימוד myogenesis בכמה מיני דגים, ביניהם פורל קשת, דגי סלמון והדניס 1-4.

Introduction

הבנה ניכרת של myogenesis יונקים הושגה באמצעות המחזר של תהליך זה בשתי תרבויות וההיצמדות למנגנון עכבר עיקרי (מאסכאלאס) ושורת תאי שמקורם בעכבר היטב תאר, C2C12 5. החל משנת 1950s 6, תרבויות אלה הביאו להתקדמות רבה בהבנה של תכנית murinemyogenic, ובהרחבה, myogenesis בחוליות אחרות. בנוסף, טכניקות myofiber explant תא בודד הגבירו את ההבנה של יחסי גומלין בין תאי לווין וmyofibers סביב 7-9. בתרביות תאים הן אטרקטיביות במיוחד לחקירות של myogenesis בשל הזמן הקצר ממבשרת לתא מובחן 10, קלות היחסית של transfection לRNAi 14,17,18 התרחבות 11-14, 15,16 וביטוי יתר מהונדס לימודים, במבחנה ואחרי השתלת in vivo 18-20, ואפילו compאריסון לתאי myogenic מבשר וסוכני הוויסות שלהם על פני מיני 21,22. בעוד הבדלים בשל הסביבה המלאכותית של מערכת התרבות תוארו 5,23, במבחנה מערכות אלה הוכיחו להיות הכרחיים לנתיחה של התכנית המורכבת המסדירה את הקמתה של multinucleated, myofibersfrom הבדיל סופני mononucleated תאי שגשוג המכונים myosatellite תאים (MSCs) בקרב היונקים.

מחוץ לכיתת היונקים, לעומת זאת, השימור ו / או הסטייה של מנגנוני השליטה myogenesis הם הבינו היטב, במידה רבה בשל הקושי בתאי culturing myogenic מבשר (MPCs) וmyoblasts ממינים שונים. אכן, תרבויות והיצמדות למנגנון עיקריות שרק תוארו בשלוש ציפורים 24-26, זוחל אחד 27, כמה דו חיים 28-30, וכמה דגים 1,3,4,31-33. שורות תאי myogenic רציפים מvertebrates האחר מאשר המכרסמים 34-36 הם אפילו יותר נדירים, עם הקו רק שאינו יונקים myogenic התא שנגזר משליו יפני (japonica Cortunix), QM7 37. למרות ניסיונות רבים בהנצחה, שורת תאי myogenic חוליות נותרת חמקמקה ופרוטוקול עבור transfection יעיל של תאים אלה יצא לאור השנה 15 בלבד. לפיכך, פרוטוקולים ברורים ומותאמים היטב לculturing MPCs וmyoblasts עיקריים ממגוון רחב של בעלי חוליות יש צורך מאוד לא רק להרחיב עוד יותר את הידע של האבולוציה של תכנית myogenic שלנו, אבל כדי להעסיק את כוחה של פיזיולוגיה השוואתית לבצע פריצות דרך ב לטיפול במחלות אנושיות שלד שרירים והפרעות.

בעוד שהספרות מכילה דיווחים רבים של בידוד MPC / היצמדות למנגנון 38-49, מקובל עבור סופרים לתאר את הפרוטוקולים לבידודים כגון בקצרה, לעתים קרובות לא שלמים, פורמטים. יתר על כן, הפרוטוקולים המאלף ביותר ריפוrted פותחו עבור עכברי 50-53, וחלק מאלה מסתמך על בחירת נוגדן 54,55 או transgenes הקרינה 56,57, מה שהופך את הפרוטוקולים הללו לבלתי שמישות או מינים שאינם מכרסמים מעשיים כמוסים מנוצלים על ידי ביולוגים שריר. עם מעט ידוע על piscine, דו חיים, הזוחלים וmyogenesis, פרוטוקול מפורט ויסודי, שתוארה עם הדרכה קולית וויזואלית וביעילות הפגינה במינים שאינם קרובים, יהיה מועיל ביותר בתחום.

תואר לראשונה על ידי פאוול ועמיתיו בשנת 1989 58, הפרוטוקול הבא פותח בתחילה כדי לבודד MPCs וmyoblasts מדגי salmonid (כלומר, פורל קשת, Oncorhynchus mykiss, וסלמון האטלנטי, סאלאר Salmo) וחלק cyprinids גדול יותר (כלומר, דג זהב, Carassiusauratusauratus) . ב2000, Fauconneau וPaboeuf מותאם תרבות והיצמדות למנגנון עיקרי לפורל קשת 59, ואמא minoroptimizationsדה שהפרוטוקול לניצול בכמה דגיגים קטנים יותר של clade Danioninae (דג הזברה, rerio Danio, וDanio הענק, Devario aequipinnatus) 32 בשל כלים גנטיים הרבים הזמינים לעבודת דג הזברה ובכך קרובי משפחתה הקרובים. דגי חוליות הם אורגניזמים אטרקטיביים למחקר בשל אסטרטגיית הצמיחה מסתעפת (לפחות ברוב המינים). salmonids הגדול, כמו רוב הדגים, גדל אבד את הכיוון, עם פוטנציאל צמיחה בלתי מוגבל על ידי אסימפטוטה במועד הפירעון, גם בגיל המבוגר 60-62. שלא כמו דג הזברה, danionins הגדול כגון Danio הענק 63 ופוטנציאל צמיחת תצוגת Danio משופם טיפוסי של דגי חוליות, מה שהופך את צירופם הישיר פלטפורמה אידיאלית להבנה אם בחירת גורל תא MPC משחקת תפקיד בהיפרפלזיה שרירי שלד לעומת היפרטרופיה.

כמו כן, אנו מראים כי פרוטוקול זה יכול לשמש גם עם עכברים וaxolotls, עם תשואת תא גבוהה יחסית וviabמדדי ility. סלמנדרות Urodele, כגון האמביסטומה המקסיקנית (Ambystomamexicanum), להחזיק את היכולת יוצאת דופן כדי לחדש רקמות, כוללים גפיים וזנבות 64-66 כולו. מאפיין זה הופך את הדגמים מעניינים דו חיים אלה של בזבוז שריר שלד ואת הזדקנות. באמצעות הפרוטוקול המתואר להלן, בגישה דומה יכולה להתבצע כפי שנעשה במינים דגים רבים, מתן הקשר השוואתי רחב עוד יותר ללימודים כאלה. ביולוגים באמת השוואתיים כפי שרבים מעריכים, ההתקדמות המשמעותית ביותר בביולוגיה בסיסית ויו translational יכולה להתבצע כאשר הנתונים מנותחים בתוך הספקטרום הרחב ביותר (כאן, כל שושלת החוליות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים בעלי חוליות שתוארו במסמך זה אושר מראש על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם, והוא עולה בקנה אחד עם הנחיות שנקבעו על ידי משרד המעבדה צער בעלי חיים, המכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב מחלקת בריאות ושירותי אנוש.

1. הכנה לתרבות

  1. הכן את מדיום הבסיס כדלקמן: 9 מ"מ NaHCO 3 (1.51 גרם לכל 2 ליטר), 20 HEPES מ"מ (9.53 גרם לכל 2 ליטר) בDMEM (13.48 גר '/ ליטר; 26.96 גרם לכל 2 ליטר).
    1. קביעת ה-pH ולהתאים ל7.40 עם HCl או NaOH.
    2. לקבוע osmolality ולהתאים ל~ 300 mOsm עם NaCl (במידת צורך).
    3. סנן לעקר באמצעות (2) מערכות עיקור ואקום 1 ליטר ולאחסן ב 4 ° C מוגנים מפני אור עד 2-3 חודשים.
      הערה: ראה לוחות 1 ו -2 למגיב שלם, כלים, consum, ומידע ציוד ables.
  2. הכן-טופלו יזין L פולי צלחות על ידי המסת 5 מ"ג של פולי-L-ליזין-מוקרן γ (> MW 300,000) ב50 מיליליטר של מים סטריליים ultrapure. מערבבים בעדינות על ידי היפוך ל10 דקות בטמפרטורת חדר, מה שמבטיח פירוק מלא של פולימרים ליזין.
  3. פיפטה את הסכום הדרוש של-L-ליזין פולי פתרון לכל טוב, בהתאם לסוג הצלחת (לוח 3). לאפשר צלחות לעמוד במכסת מנוע לזרום למינרית במשך 5 דקות.
  4. בשלב הבא, תסיר-L-ליזין פולי פתרון ולשטוף פעמיים עם מים סטריליים. לאפשר צלחות לייבוש באוויר במכסת מנוע לזרום למינרית ל20 דקות.
  5. השג 1 מ"ג של laminin (מקור Engelbreth-Holm-נחיל) ולפזר ב50 מיליליטר של מדיום בסיס לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מיליליטר. החל פתרון laminin לצלחות תרבית תאי פולי-L-ליזין שטופלה ב2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר. (ראה טבלה 3 עבור גדלים שונים צלחת)
  6. מערבולת בעדינות את הפתרון כדי להבטיח פוll גם כיסוי. לאטום צלחות עם קלטת מעבדה ומקום בחממה ל24 שעות. החממה צריכה להיות מוגדרת לטמפרטורה המתאימה למינים בשימוש (ראה לוח 7), ולא גזים נוספים צריכים להוסיף לחממה.
    הערה: יש לאפשר Laminin לדבוק צלחות ל24 שעות לפני זריעת תאים. הימנעות מלעשות זאת תגרום לעניים כדי לא נצמדים בתא.
  7. הכן תקשורת כפי שמתואר בטבלה 4. תקשורת שלמה מוכנה הכי טובה היום של שימוש.
  8. כהכנה לבידוד רקמות, להרכיב את הפריטים וחיטוי הבאים: כוס 300-500 מיליליטר (ים); כלים מזכוכית פטרי; אזמל ידיות; מלקחיים (עדין וגס); מספריים לנתיחה; וכמה גיליונות של נייר החיטוי דוחה מים.
    הערה: לכל אדם לסייע בתהליך הנתיחה, (2) ידיות אזמל, (1) מלקחיים (סוג בהתאם להעדפה אישית), (1) מספריים לנתיחה, ו( 5-10) גיליונות נייר החיטוי מים דוחה הםמספיק.
  9. בנוסף לפריטי autoclaved לעיל, להרכיב 70% אתנול, איזון משקל, צינורות חרוטי 50 מיליליטר סטרילי (מספר תלוי בגודל של תרבות), וקרח.

2. Dissection רקמות

  1. לפני שמתחילים, להבטיח כי מלאי מספיק דגים זמין.
    הערה: הגיל של הדג לשמש הוא בעל חשיבות קריטית. בעוד דגים משני מינים שונים יכולים להיות של משקולות דומות, דגים צעירים של מין אחד יהיה להחזיק יותר מ MPCs דגים ישנים של מינים אחר. ככלל, דגים צעירים, במיוחד כשעובדים עם salmonids, הם הטובים ביותר. לdanionins, דגים ישנים כמו שנה אחת יכולים להיות מנוצלים בצורה אופטימלית, תוך salmonids גיל 4-6 חודשים או צעירים יותר (עד 15 ז) הם אופטימליים.
  2. עבור כל 5 גרם של רקמה להיות גזור, aliquot 25 מיליליטר של מדיום בידוד לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי.
  3. שוקל, מסת שיא, ומספר צינור (ות). מניחים צינורות על קרח.
  4. להרדים 2-3 דגיםבכל פעם על ידי טבילה ב> 300 methanesulfonate tricaine מ"ג / ליטר סודיום ביקרבונט שנאגרו. לאפשר תנועת opercular להפסיק ל> 5 דקות ולאחר מכן submerse דגים ב70% אתנול (הכלול בכוסות סטריליות) ל30 שניות.
  5. הסר את הדגים מ70% אתנול ומניח על נייר החיטוי דוחה מים. ישירות מאחורי opercula, השתמש באזמל כדי לעשות חתך שטחי, רדוד. להסיר את הקשקשים ועור ידי אחיזה בעור בחתך הנ"ל ולמשוך לכיוון זנב של דג.
  6. בעקבות הסרת עור, בלו epaxial, שריר מהיר glycolytic 'לבן' של הדג משני הצדדים (הימנעות השריר האיטי חמצוני 'האדום' הממוקם בסמוך לקו הרוחב) והמקום במדיום בידוד. מחק את שארית הדגים כנדרש על ידי מוסד.
    תאים למרות שזה בהחלט אפשרי לMPCs התרבות שמקורם בשרירים אדומים, כמעט בכל פרסום באמצעות החוליות MPCs ניצל מבודדים ממ 'epaxial: הערהyotome.
  7. חזור על שלבים 2.4-2.6 עד כמות מספקת של שריר מתקבלת. במהלך נתיחה, להבטיח כי רקמת שריר ונקוותה נשארת על קרח כדי לשמור על כדאיות תא.

3. ניתוק מכאני

  1. יוצקים צינור אחד 25 מיליליטר / 5 גרם של רקמת שריר לתוך צלחת פטרי זכוכית. באמצעות שני אזמל ידיות עם מצורפים להבי אזמל מס '10, רקמת בשר טחון לעקביות תרחיף או פירה. תנועת "חזרה-and-הלאה" של משיכת להבי אזמל על פנים זה עובדת הכי טוב.
    הערה: בעוד homogenizers רקמות אולי נראה מתאים, מספר תאי קיימא יהיה מופחת באופן משמעותי, אם לא בוטל.
  2. בעזרת פיפטה סרולוגיות 25 מיליליטר וpipettor סרולוגיות, להסיר את רקמת slurried ולהחליף בצינור חרוטי המקורי.
  3. חזור על שלבים 3.1-3.2 עד שכל הרקמה בכל הצינורות כבר ניתקה באופן מכאני.
  4. רקמת צנטריפוגה במשך 5 דקות על XG 300 ו10 ° C.
  5. Follבשל צנטריפוגה, לבטל 25 מיליליטר של supernatant תקשורת עם טפטפת 25 מיליליטר סרולוגיות, aspirator ואקום, או באמצעות אחסון זהיר.
  6. הוסף 25 מיליליטר של מדיום לשטוף לכל רקמת הצינור, resuspend, וrecentrifuge כאמור לעיל.
  7. שטוף פעמיים עם מדיום שטיפה, הסרת supernatant בכל פעם.

4. אנזימתי דיסוציאציה

  1. במהלך שלב 3.4, להכין פתרון collagenase ידי שילוב 0.22 גרם של collagenase סוג ד 'ו44 מיליליטר של מדיום בסיס (או כמות מספקת ב0.11 g/0.22 מיליליטר).
  2. מערבבים בכוס של 10-15 דקות ב 4 ° C. סנן לעקר עם מזרק 50 מיליליטר ומסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך מסנן מזרק יותר מאחד, תלוי בהכנת collagenase. Collagenase מתקבל מספקים אחרים מאשר וורטינגטון ביוכימית מהווה יותר קושי בסינון. Collagenase משמש לניתק קשרים פפטידיים בקולגן, המהווה את endomysium. זהעיכול יסיר כי מחסום ההגנה של myofibers.
  3. עבור כל גרם של רקמת שריר, רקמת resuspend בפתרון collagenase 0.2%. עבור 5 גרם של רקמת שריר, להוסיף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase ו15 מיליליטר של מדיום בסיס.
  4. הוסף 10 μl של כוחות הביטחון הפלסטיניים לכל מיליליטר של פתרון בינוני collagenase / בסיס (למשל 250 μl ל25 מיליליטר). ודא שרקמה מושעה גם, כפי שזה ישפיע על היעילות של עיכול אנזימטי.
  5. דגירה רקמת שריר בcollagenase ל60 דקות במעלות צלזיוס 18 עם נדנדה עדינה. בהתאם למידה של ניתוק ומינים מכאניים, עיכול collagenase ניתן להאריך עד 90 דקות, אם כי זה עשוי להשפיע על כדאיות תא.
  6. בעקבות צינורות עיכול collagenase, חרוטי צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב12 ° C. בטל supernatant ורקמות resuspend ב 25 מיליליטר של מדיום לשטוף.
  7. Recentrifuge בx גרם 300 במשך 5 דקות ב126; ג חזור על פעולה עם מדיום שטיפה בפעם שנייה.
  8. לאחר רקמת הכביסה פעמיים, רקמת שריר resuspend ב 25 מיליליטר של מדיום לשטוף וtriturate עם טפטפת סרולוגיות 10 מיליליטר עד הרקמה / homogenate הבינוני עוברת בתוך ומחוץ לפיפטה בקלות יחסית. 5-10 triturations הוא בדרך כלל מספיק.
    1. חזור על פעולה עם טפטפת 5 מיליליטר סרולוגיות ולאחר מכן צינורית מתכת 16 מד מצורפת מזרק.
  9. צינורות חרוטי צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב12 ° C. למזוג supernatant.
  10. במהלך צנטריפוגה 5 דקות לעיל, להכין את פתרון עיכול טריפסין על ידי שילוב של 0.25 גרם של טריפסין עם 5 מיליליטר של מדיום בסיס.
  11. מערבבים על 4 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות ולסנן לעקר עם מזרק 20 מיליליטר ו0.45 מסנן מזרק מיקרומטר.
  12. אחזר צינורות חרוטי ולהוסיף של פתרון טריפסין 100 μl ו4.9 מיליליטר של מדיום ניתוק לכל 1 גרם של רקמת שריר לכל צינור. לexample, להוסיף 500 μl של פתרון טריפסין ו24.5 מיליליטר של מדיום ניתוק עד 5 גרם של רקמת שריר.
    הערה: טריפסין הוא פרוטאז סרין שיפריד בין תאים מבשר myogenic מlamina הבסיס.
  13. רקמת resuspend בטריפסין / דיסוציאציה בינונית היטב. דגירה במשך 20 דקות ב18 ° C.
  14. לאחר הדגירה הראשונה טריפסין, צינורות חרוטי צנטריפוגות ב XG 300 1 דקות ב12 ° C.
  15. לנטרל את טריפסין על ידי שילוב של supernatants עם מדיום בידוד בריכוז של 1 נפח של supernatant ל4 כרכים של מדיום בידוד. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במהלך עיכול טריפסין השני.
  16. לגלולה הנותרת של רקמות, חזור על שלבים 4.12-4.15, המשלבים את supernatant הבא צעד 4.15 עם מדיום supernatant / בידוד מעיכול טריפסין הראשון.
  17. לחלופין: digestions collagenase וטריפסין עשוי להיות משולב על מנת למקסם את תשואות תא. <ol>
  18. כדי לעשות זאת, triturate collagenase לעכל באמצעות צינורית מתכת (6 באורך ו16 מד עובד הכי טוב) מצורפת מזרק 20 מיליליטר עד homogenate עובר בקלות דרך הצינורית.
  19. לhomogenate, להוסיף 500 μl של פתרון טריפסין (מוכן בשלב 4.10) ו לדגור על 18 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  20. בעקבות צינורות דגירה, חרוטי צנטריפוגות ב XG 300 למשך 1 דקה ב12 ° C.
  21. לנטרל את טריפסין על ידי שילוב של supernatants עם מדיום בידוד בריכוז של 1 נפח של supernatant ל4 כרכים של מדיום בידוד.
  22. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במהלך עיכול טריפסין השני.
  23. להמשיך עם צעד 4.18 כמו בפרוטוקול הסטנדרטי.
  • מחלק את התערובת בינונית supernatant / בידוד הסופי ל50 צינורות חרוטי מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב12 ° C.
  • הסר את supernatants נזהר שלא להפריע לתאכדורים. פיפטה 2 מיליליטר של מדיום מלא לכל צינור, מתמוסס כל תא גלולה.
  • שלב את התאים תלויים במדיום מלא בצינור חרוטי 50 מיליליטר אחד.
  • יש לשטוף את כל צינור עם 1 מיליליטר של מדיום שלם, שילוב עם המאגר של תאי resuspended בעבר.
  • Triturate עם צינורית מתכת ומזרק 5-10 פעמים.
  • סנן השעיה תא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר, שטיפה עם מדיום שלם.
  • סנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
  • הוסף בינוני מלאים מספיק כדי 50 מיליליטר ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות ב15 ° C.

    • 5. ספירה, דילול, וזריעה של תאים

    1. בעקבות צנטריפוגה הסופית בשלב 4.25, להסיר supernatant באמצעות אחסון זהיר או עם טפטפת סרולוגיות. Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של מדיום שלם.
    2. עם תאי resuspended באופן מלא, להסיר 20 μl; של ההשעיה התא והמקום בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
    3. הוסף 5 μl של צבע הכחול Trypan ולהמתין 5 דקות. באמצעות hemocytometer, לקבוע את מספר תאי קיימא.
    4. עם הנחישות, לדלל תאים לריכוז הדרוש. חוליות MPCs הם זורעים הטובים ביותר ב150,000-200,000 תאים לכל 2 סנטימטר. לאסטרטגיה שש היטב ציפוי, דילול תאים ל1.5 x 10 6-2.0 x 10 6 לכל מיליליטר תומך ריבוי והתמיינות מספיקים.
    5. אחזר-L-פולי טופלו ליזין, צלחות מצופים laminin ותאי זרע. (ראה טבלה 5 לדילולי צלחת ספציפית וכרכי ציפוי.) הערה: טבלה 6 מתארת ​​מספר ממוצע של תאים מבודדים לגרם של רקמת שריר מבודדת מבעלי חוליות שונים. פורל הקשת (א 'mykiss) מפגין פחות MPCs לגרם של רקמת שריר מאשר דג הזברה (ד rerio) ובכך דורש יותר דגים לבודד מזריעה ראויה.
    6. לאטום צלחות עם קלטת מעבדה ומקום בחממה מצמררת בטמפרטורה המתאימה. MPCs מכל המינים המופיעים ברשימה (פרט לעכברים) ניתן מודגרות בתנאים אטמוספריים רגילים ללא פחמן דו חמצני (CO 2) תוספת. (ראה לוח 7).
    7. לחלופין: מעבדות מסוימות אימצו פרוטוקול שקורא למאפשרים MPCs לדבוק במצע התרבות ל40 דקות.
      1. לאחר מכן לשטוף צלחות עם תקשורת כביסה כדי להסיר את כל תאים באופן רופף מצורפים ולא חסיד. אזהרה: שלב זה הוא חשוב מאוד כדי להימנע מהידבקות "הלא ספציפית" של תאים אחרים (למשל fibroblasts) למצע התרבות.
      2. הוסף מדיה שלמה ותאי מקום בחממה ולטפל כפי שיפורט להלן.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    עשרים וארבע שעות שלאחר זריעה, תאים מבשר myogenic (MPCs) צריכה להיות גלויות מחובר לתשתית laminin (ראה איורים 1 א ו1D). בעקבות זריעה, תאים (MPCs) לאמץ צורה כמו ציר, מעידה על סוג תא זה (איור 1) והם MyoD1 (איור 2) +. במיני Danio, MPCs להיראות קומפקטי עם תהליכים דו קוטביים קטנים יותר מאשר לעשות MPCs ממינים Oncorhynchus וSalmo. עם זאת, במהלך ארבעה ימים של תרבות, MPCs מכל מיני piscine בדק לאמץ מורפולוגיות דומות ונראים בבירור כמו myoblasts (1b דמויות ו1E). תקשורת מלאה יש להסיר, וMPCs יש לשטוף פעמיים עם מדיום שטיפה. Myofibroblasts יכול לזהם תרבויות myogenic וניתן להבחין בקלות מMPCs / myoblasts ידי המורפולוגיה כמו הכוכבים שלהם (לעומת צורת הכישור של ההיצמדות למנגנון). שטיפת הצלחות מאוד improves הסרת fibroblasts כזה.

    במינים שתוארו כאן (ראה לוח 7), שינויים בתקשורת יומיים לייצר את התוצאות הטובות ביותר. MPCs וצאצאים (myoblasts וmyotubes המתהווה) יש לשטוף פעם או פעמיים לפני התוספת של מדיה מלאה טרי. לחלופין, ניתן להפחית שינויי תקשורת בכל יום אחר לאחר שהתאים הגיעו לשלב הסופי וההיצמדות למנגנון (כ 4 יום של תרבות). Myotubes צריך להקים בתוך 2-3 ימים (1c דמויות ו1F) ולהיות myogenin (איור 2) +, במיוחד כאשר בתרבית בינונית בידול (ראה להלן). בעוד תקופות של שבועות עד חודשים דווחו בכמה מיני יונקים, MPCs piscine וmyoblasts אינו מופיעים לסבול כגון תקופות של זמן. תאים להתרבות בשישה הימים הראשונים של התרבות (איור 3), עם בידול שלאחר מכן בין ימים 7 ו 9-11 של התרבות. לאחר מכן, תאי הזדקנות או poptose.

    טבע myogenic של MPCs וצאצאיהם מבודדים באמצעות פרוטוקול זה נקבע 3,32,33 מבוסס על ביטוי גנים. שלא כמו מערכות תרבות של יונקים, ריבוי MPCs והצאצאים והיצמדות למנגנון הוא יחסית נמוך בימים הראשונים של התרבות (בהשוואה למערכות ניצול myoblasts העכברית ראשונית או C2C12), עם גידול מהיר שזוהה כתאי טופס myotubes בשלה בימים 6-9 בתרבות במינים Danio 32. דיווחים מפורל הקשת ניצלו את מדיום התמיינות (נפוצים בתרבויות והיצמדות למנגנון של יונקים, אבל לא חובה במערכות piscine) ומצביעים על כך שמדדי ההתפשטות להקטין כצפוי עם myotube היווצרות 33. בידיים שלנו, myotubes התוצאה יכול להישאר בתרבות של עד 9-11 ימים (מיני Danio) ו11-13 ימים (מיני Oncorhynchus) לפני הזדקנות או אפופטוזיס סלולריים מתרחש.

    = "0">
    מגיב חברה (מועדף נ חלופי) מספר קטלוגי (מועדף נ חלופי) כמות לתרבות
    פולי-L-ליזין מוקרן-γ סיגמא אולדריץ (Biomedicals מגה פיקסל) P5899 (ICN19454405) 5 מ"ג
    DMEM (גלוקוז גבוהה) סיגמא אולדריץ (Cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (סיגמא אולדריץ) CB-40,232 (L2020) 1 מ"ג
    סודיום ביקרבונט (NaHCO 3) פישר סיינטיפיק (סיגמא אולדריץ) BP328-500 (S5761) 1.51 גרם
    HEPES (C 8 H 18 N 2 O 4 S) פישר סיינטיפיק (סיגמא אולדריץ) BP310-1 (H6147) 9.53 גרם
    אנטיביוטיקה / antimycotic Thermo Scientific (Sigma אולדריץ) SV3007901 (A5955) 17-20 מיליליטר
    גנטמיצין סולפט Lonza (סיגמא אולדריץ) BW17-519Z (G1397) 2-3 מיליליטר
    תורם סוסים סרה Thermo Scientific (סיגמא אולדריץ) SH3007403 (H1270) 75 מיליליטר
    שור עוברי סרה Thermo Scientific (סיגמא אולדריץ) SH3007103 (F2442) 25 מיליליטר
    Collagenase (סוג ד ') וורטינגטון (סיגמא אולדריץ) LS004189 (C9891) 0.44 גרם
    טריפסין (מלבלב) Biomedicals מגה פיקסל (סיגמא אולדריץ) ICN15357125 (T5266) 1 גרם

    טבלת 1. רשימה מגיב מפורטת עם יצרן מועדף ומספר קטלוג.

    מתכלה כלי עבודה ציוד
    צלחות תרבית תאים מלקחיים (גס) Pipettor סרולוגיות
    מיליליטר 50 סטרילי צינורות חרוטי מלקחיים (פיין) ה-pH מטר
    קלטת מעבדה ידיות אזמל חממה מצמררת (Echotherm)
    0.2 מערכות עיקור מיקרומטר אבק להבי אזמל (# 10, 11 #) הזרימה למינרית הוד
    דוחה המים החיטוי נייר מספריים כירורגי סעפת ואקום
    פיפטות סרולוגיות צלחות פטרי זכוכית Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas עם Luer מנעולים

    טבלת 2. מתכלה, כלים והציוד דרושים לתרבית תאים.

    g = "0">
    גודל צלחת 2 סנטימטר לכל טוב פולי-L-ליזין * Laminin **
    6 כן 9.5 1.6 מיליליטר 1
    24 גם 1.9 0.32 0.2
    48 גם 0.95 0.16 0.1
    96 גם 0.32 0.06 0.03
    * ריכוז 0.1 מ"ג / מיליליטר ** ריכוז 0.020 מ"ג / מיליליטר

    לוח 3. אופטימלי כרכים לציפוי צלחות תרבית תאים עם פולי-L-ליזין וlaminin.

    מגיב בדידות לשטוף דיסוציאציה מלא
    בסיס בינוני 419.25 מיליליטר 395.40 מיליליטר 297.00 מיליליטר 178.00 מיליליטר
    * כוחות הביטחון הפלסטיניים 5.00 מיליליטר 4.00 מיליליטר 3.00 מיליליטר 2.00 מיליליטר
    גנטמיצין סולפט ** 0.75 מיליליטר 0.60 מיליליטר - -
    תורם סוסים סרום 75.00 מיליליטר - - -
    בסרום שור עוברי *** - - - 20.00 מיליליטר
    * כוחות הביטחון הפלסטיניים: פניצילין / סטרפטומיצין / קוקטייל fungizone (100x); ** 50 ריכוז מ"ג / מיליליטר; מאופיין ***

    לוח 4. הכנות מדיה שונות לבידוד והתרבות של תאי myogenic מבשר (MPCs).

    <td> 9.5
    גודל צלחת 2 סנטימטר לכל טוב מהילה נפח ציפוי
    6 כן 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר 1 מיליליטר
    24 גם 1.9 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר 250 μl
    48 גם 0.95 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר 150 μl
    96 גם 0.32 1.5-2.0 x 10 6 תאים / מיליליטר 50-100 μl

    לוח 5. דילולים מומלצים וכרכי ציפוי לפי גודל גם צלחת תרבית תאים.

    מין רקמת תאים # / g ממוצע
    rerio Danio 6,400,000
    dangila Danio 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800

    . לוח 6 מספר ממוצע של תאים מבשר myogenic מבודד מ1 גרם של רקמת שריר מבעלי חוליות שונות: Danio rerio (דג הזברה), Daniodangila (moustacheddanio), Devario aequipinnatus (Danio הענק), וmykiss Oncorhynchus (פורל קשת).

    מין טמפרטורה
    spp Danio / Devario. 26-28 ° C
    spp Oncorhynchus / Salmo. 10 * - 18 ° C
    Ambystoma mexicanum 18 ° C
    * טמפרטורות נמוכות תומכות בשיעורי תפוצה נמוכים יותר.

    טמפרטורות דגירה לוח 7. מומלץ לpiscine וp myogenic דוחיתאי recursor (MPCs).

    איור 1
    איור 1. נציג תמונות בהירות תחום MPCs (השמאלי ביותר), myoblasts (באמצע), וmyotubes המוקדם (הימני ביותר) משני מינים, פורל קשת (Oncorhynchus mykiss, למעלה) ודג הזברה (Danio rerio, למטה).

    איור 2
    איור 2. מכתים immunocytochemical נציג MPCs (א, ג) וmyotubes (ב, ד) מבודד ומתורבת מDanio הענק (Devario aequipinnatus, למעלה) ופורל קשת (Oncorhynchus mykiss, למטה). בתרבות, myoblasts הן MyoD1 + חיובי (א, ג)כדמיין באמצעות + נוגדני MyoD1 זמינים מסחרי (Danio: 20-C, סנטה קרוז ביוטכנולוגיה; פורל: NB100-80,899, ביולוגיים נובוס). בנוסף, כmyoblasts להבדיל, שהם מבטאים myogenin (ב, ד) כדמיין באמצעות נוגדני myogenin זמינים מסחרי (Danio: M-225; פורל: SC-567; שניהם מסנטה קרוז ביוטכנולוגיה).

    איור 3
    איור 3. נתוני התפשטות תאים מייצגים באמצעות BrdU למדוד שיעורי התפשטות תאים לאורך זמן בתרבות. נתונים שהתקבלו מMPCs המבודד ומתורבת מDanio הענק 67.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    תכנית myogenic, במבין מינים שנבדקו, ניתן ללמוד אותם בקלות באמצעות מערכת במבחנה. ואכן, על בידוד, תאים מבשר myogenic (MPCs) בדגים או תאי myosatellite (MSCs) ביונקים בקלות להיכנס לתהליך המוסדר הזה מאוד מעורב ההתפשטות, נסיגת מחזור התא, ובידול מסוף של myoblasts וההיתוך של myoblasts אלה לmyotubes המתהווה. המחסור הכללי של זנים מהונדסים גנטי כתב של מיני piscine (עם החריגה האפשרית של דג הזברה 67 ופורל קשת 69) מגביל בעבודת vivo של הפעלת MPC / MSC, שגשוג, והתמיינות, ולכן מבחנה המערכת שבהוצגה כאן היא פלטפורמה אטרקטיבית ללימודים במינים דגים.

    התרבות המוצלחת של MPC / MSCs, לא משנה המין, תלויה מאוד ב) תשומת לב קפדנית לעקרות; ב) ניתוק מכאני יסודי של t שרירי שלדנושא; וג) אופטימיזציה של עיכול אנזימטי. במהלך השלבים הראשוניים של בידוד רקמת שריר, יש לנקוט בזהירות רבה כדי להבטיח כי הכמות הנחוצה של רקמה הוא נכרת ללא זיהום. זה הוא בעל חשיבות עליונה, כי דגים (או כל בעלי חיים מנוצלים, לצורך העניין) הם חיטוי כראוי ב70% אתנול ובמשך זמן מספיק. בידיים שלנו, 30 שניות עובדת הכי טובות; תקופות קצרות של זמן עלולות לגרום לזיהום ועוד, אובדן שלמות רקמות וכדאיויות תא. אתנול יכול לשמש כמקבע, ולכן יש להקפיד שלא ליבש את הדג לפני הנתיחה. נתיחה ניתן לעשות זאת מחוץ למכסת מנוע בתרבית תא זרימה למינרית; עם זאת, אנו ממליצים שתהליך זה ייעשה תוך מכסה המנוע כדי למזער את זיהום חיידקים או פטרייתי פוטנציאלית.

    בעוד שהניתוק המכני שתואר לעיל אולי נראה גולמי ו / או מייגע בהתחלה, זה הוא קריטי להליך הבידוד. שני להבי אזמל גדולים, עבר משךאחד את השני בתנועת החלקה (כפי שמוצגת בפרוטוקול וידאו), מייצר את התוצאות הטובות ביותר. סיים פעם אחת, את העקביות של homogenate צריכה להיות זה של תרחיף או פירה, ולאסוף בקלות עם טפטפת רחב נשא סרולוגיות (כלומר 25 מיליליטר). כל שעליך לעשות, טוב יותר את הניתוק המכני, גבוה יותר MPC תשואת MSC / וטובה יותר את התרבות וכתוצאה מכך. דיסוציאציה עניים יפריע עיכול אנזימטי ולהקטין תשואת תא. למרות שזה עשוי להיות מפתה לחשוב, השימוש בhomogenizers רקמות חשמלי באופן דרמטי מוריד את כדאיויות תא למרות הנוחות הברורה שלה, לפחות עם MPCs piscine.

    כמו בכל הפרוטוקולים, אופטימיזציה של ההליך שפורט לעיל היא לעתים קרובות יש צורך. זה הוכיח עצמו אמיתי בעבודה שלנו עם כמה מיני danionin. תוצאות מהמעבדה שלנו מצביעות על כך שdanionins הקטן יותר (לדוגמא: דג הזברה) יניב יותר MPCs לגרם של שרירי שלד מאשר מינים גדולים יותר (למשל במערכת העיכולDanio נמלה או המשופם). עם זאת, זה יתממש רק אם ריכוז גבוה יותר של collagenase (0.3%) נמצא בשימוש עם רקמות ממינים קטנים יותר. בידיים שלנו, ריכוז של .0.2% מתאים למיני salmonid (למשל פורל קשת;, פורל הרצחני [Oncorhynchusclarki] סלמון Chinook [Oncorhynchustschawytscha]), danionins הגדול יותר, האמביסטומה איבר (Ambystomamexicanum) וזנב, ואפילו עכבר שרירי שלד. כמו כן, יש להקפיד לבחור את collagenase המתאים. מניסיוננו, collagenase הסוג IV משמר כדאיות תא הרבה יותר טוב מאשר collagenases המומלץ לסיבי רקמות כגון עצמות ושרירים (סוג כלומר collagenase השני) 70. בעוד עיכול עשוי להיות שלם יותר בתקופת זמן קצרה יותר, יושרת קולט קרום תא היא סביר נפרצה על ידי פעילות מוגברת tryptic בהכנות אלה. עם כל הכבוד לטריפסין, המעבדה שלנו תמיד מנוצל פור הכנת טריפסין הגס יותרified מלבלב חזירי, ולא את ההכנות 'טהורה' זמינות. בפעילויות התרבות שלנו עם מינים שונים, יש לנו לב השפעה חיובית קטנה של ריכוזי טריפסין שונים.

    טחינה דקה היא קריטית לפרוטוקול זה. זה גם מנתק את המטריצה ​​של סיבי שריר שלד ומגדיל את פני שטח לעיכול tryptic כל תוך הפגיעה בשלמות המבנית של myofibers באופן ידני. בעת ביצוע triturations, ברציפות באמצעות טפטפות שעמם קטנה יותר וקנולה להרבה יותר קל מאשר באמצעות הצינורית ומזרק מייד. שתמשיך ישירות לtriturations עם צינורית ומזרק יכול לגרום קנולה פקוקות ו / או לחץ מוגזם מוחל על תאים. החלת עיכול tryptic בלי טחינה דקה נאותה יהיה להפחית באופן דרמטי תשואות תא.

    ברגע שבודד, תהליך התרבות הוא פשוט למדי. רוב הפרסומים עד כה מנוצלים שנינות פרוטוקולתקשורת h אחד עבור שניהם ריבוי והתמיינות 33,71-75, כוללים שלנו; עם זאת, יותר מאמרים האחרונים שנכתבו על ידי כמה חוקרים צרפתים תארו פרוטוקול שתי תקשורת, עם תקשורת מבוססת נפרדת ותוכן בסרום לריבוי והתמיינות 33. פרוטוקול 'חדש' זה מחקה באופן הדוק יותר אלה המשמשים בתרבות של MSCs וmyoblastsand העכבריים מופיע כדי לשפר את ההתפשטות של myoblasts השלב מוקדם 33 ועשויים להיות מתאים יותר כדי לשלוט בהפצה ו / או התמיינות של תאים. עם זאת, ללא אפיון מקיף של ביטוי גנים, קשה להגיע למסקנה האם תקשורת "התפשטות" כאלה גם חוסכת למדינה יותר "כמו היצמדות למנגנון-'מ עושה את המתודולוגיה מדיה אחד המסורתית. פרסומים קודמים המתארים ביטוי גנים, בין אם בתמליל או ברמת חלבון, דיווחו על שימוש בפרוטוקול תקשורת אחד המסורתי 3. לחלופין, תקשורת יחידה (DMEM מתואר כאן) ניתן להשלים עם ריכוזים שונים של סרום שור העובר (FBS): 10% עבור הפצה ו -2% לבידול.

    בעוד חוקרי העסקת מערכות תרבית תאים של יונקים ניתן הסתגלו לשימוש באטמוספרות פחמן דו חמצני לגידול של תאים אלה, את ההבדלים המהותיים בין שיחת חילוף גזים יבשתית וימית לגישה שונה, כאשר culturing piscine או תאי urodele-מרותק מים, כולל MPCs. מדיה המפורטים כאן נאגרה עם נגזרות piperazine, תרכובת אורגנית [HEPES: 4 - חומצת piperazine-1-ethanesulfonic (2-Hydroxyethyl)] zwitterionic וסודיום ביקרבונט (NaHCO 3). לפיכך, חממה עם הזרקת גז אין צורך או חובה לתרבות של תאים אלה. יותר מכך, חממות כזה צריכה להחזיק את היכולת לקרר ולא חום, כמו הטמפרטורות הדרושות לpiscine התרבות וMPCs urodele נעים בין 18-26 ° C. יתר על כן, MPCs salmonid יכול להיות גultured בטמפרטורות נמוכות יותר במידת צורך, המדגיש את הצורך בחממת קירור נוסף. בנוסף, מצאנו (כמו שיש לי חוקרים אחרים, כפי שנמסר בעבר) האיטום של צלחות תרבות הוא הכרחי כדי לשמר את הכדאיות סלולרית. פשוט עוטף את הממשק בין המכסה התרבות והצלחת עם קלטת מעבדה סטנדרטית הוא מספיק כדי להגשים מטרה זו.

    בעוד passaging של שתי MPCs / MSCs / myoblasts העיקרית הוא נפוץ בתרבית תאים של יונקים, זה לא נראה אפשרי עם תאי piscine, לפחות לפני שלב Mb המאוחר (סביב יום 6 של תרבות). לכן, המספר המתאים של תאים מספיקים כדי לתמוך בריבוי ולהגיע למטרות של הניסוי חייב להיות זרע בייזום של התרבות. יתר על כן, אם פחות מהצפוי תשואות תא מתקבלות, לא ניתן להפיץ תאים ולאחר מכן replate הצאצאים מאוחר יותר. יש לנו לייחס את המאפיין הזה להסתמכות המוגברת על extracelמטריקס lular (ECM) של MPC / myoblasts piscine. לחלופין, אפשר כי מדובר בחפץ של מצע laminin ובכך נוסף אמפירי קביעת רכיבי ECM הכרחיים להתפשטות MPC piscine / Mb ובידול הוא מוצדק. אנחנו לציין, עם זאת, שכמה ממשתפי הפעולה שלנו הוסרו בהצלחה myoblasts בשלב מאוחר (~ יום 6 של תרבות) מתשתית התרבות וreplated תאים אלה (JM Froehlich ויחסי הציבור Biga, תקשורת אישית).

    שימוש בפרוטוקול זה או דומה לו, ניסויים מעורבים RT-PCR 3,71-74,76-78, כתם מערבי 32,79-81, immunocytochemistry 32,33, מבחני התפשטות 32,33,59, transfection גן 15, morphometric ניתוח 78, סינון הרעלים 82, וimmunoprecipitation הכרומטין (שבב; JM Froehlich ויחסי הציבור Biga, תוצאות לא פורסמו) כבר נעשו. עם זאת, תיאורים נוספים של נוסף בvitפרוטוקולי ro, כלומר אלה הקשורים passaging והתפשטות משובט, יש צורך מאוד. ואכן, המעבדה רוג'רס 15 עשתה התקדמות משמעותית בתרבות של MPCs / myoblasts piscine על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול לגרימת transfection של myoblasts דג הטרוטה. המבוסס על מתודולוגיה זו, חקירות נוספות מעורבים RNAi או ביטוי יתר של מטרות שרירים ספציפיים לשלד, במיוחד אלה הניחו להיות מעורבים עם מסלולי צמיחה לכל החיים של דגי חוליות, הם לא רק אפשריות, אלא עשויים להוביל להתקדמות משמעותית בחקלאות הימית ובשדות ביו של מדע.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין מה לחשוף.

    Acknowledgments

    המחברים מבקשים להאריך הרבה תודות לבני זוג. פפ Planas וחואן קסטיו למומחיותם המקצועית בפיתוח והיישום של פרוטוקול תרבות זו לדגים קטנים ודו חיים. תודה גם לאינספור אנשים שיש להם ללא לאות בסיוע עם הנתיחה והניתוק של רקמת שריר מדגים רבים (שניהם במין ומספר), ובם מתיו טעינה, Delci כריסטנסן, זכריה פאולר, ברוק פרנזן, נתן Froehlich, קירה מרשל, בן מאיר, איתן Remily, וSinibaldo רומרו. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם מחלקת כספים הזנק ביולוגיה, המרכז לפרוטאז NIH מענק המחקר # 2P20 RR015566, NIH NIAMS גרנט # R03AR055350, וNDSU Advance קדימה NSF גרנט # HRD-0,811,239 לPRB. תמיכה הייתה גם מסופקת על ידי P30DK056336 # הפרס UAB התזונה השמנת יתר מרכז המחקר, NIH NIDDK. תכניו הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם בהכרחמייצג את הדעות הרשמיות של NIH.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table 1. Detailed Reagent Information
    Reagent Company (Preferred v. Alternate) Catalog Number (Preferred v. Alternate) Quantity per Culture
    γ-irradiated poly-L-lysine Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) P5899 (ICN19454405) 5 mg
    DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich (cellgro) MT-50-003-PB (D7777) 2 L
    Laminin BD Biosciences (Sigma-Aldrich) CB-40232 (L2020) 1 mg
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP328-500 (S5761) 1.51 g
    HEPES (C8H18N2O4S) Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) BP310-1 (H6147) 9.53 g
    Antibiotic/Antimycotic Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SV3007901 (A5955) 17-20 mL
    Gentamicin Sulfate Lonza (Sigma-Aldrich) BW17-519Z (G1397) 2-3 mL
    Donor Equine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007403 (H1270) 75 mL
    Fetal Bovine Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) SH3007103 (F2442) 25 mL
    Collagenase (Type IV) Worthington (Sigma-Aldrich) LS004189 (C9891) 0.44 g
    Trypsin (from Pancreas) MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) ICN15357125 (T5266) 1 g
    Table 2. Consumables, Tools and Equipment
    Consumable Tools Equipment
    Cell Culture Plates Forceps (Coarse) Serological Pipettor
    Sterile 50 mL Conical Tubes Forceps (Fine) pH Meter
    Laboratory Tape Scalpel Handles Chilling Incubator (Echotherm)
    0.2 μm Vacuum Sterilization Systems Scalpel Blades (#10, #11) Laminar Flow Hood
    Water-repellant Autoclave Paper Surgical Scissors Vacuum Manifold
    Serological Pipettes Glass Petri Dishes Microosmolality Meter
    12-16 G Cannulas with Luer Locks
    Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
    Plate Size cm^2 per Well Poly-L-lysine* Laminin**
    6 well 9.5 1.6 mL 1
    24 well 1.9 0.32 0.2
    48 well 0.95 0.16 0.1
    96 well 0.32 0.06 0.03
    *0.1 mg/mL concentration ** 0.020 mg/mL concentration
    Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
    Reagent Isolation Wash Dissociation
    Base Medium 419.25 mL 395.40 mL 297.00 mL
    Gentamicin Sulfate** 0.75 mL 0.60 mL -
    Donor Equine Serum 75.00 mL - -
    Fetal Bovine Serum*** - - -
    * PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
    Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
    Plate Size cm^2 per Well Dilution Plating Volume
    6 well 9.5 1.5-2.0x10^6 cells/mL 1 mL
    24 well 1.9 1.5-2.0x10^6 cells/mL 250 μL
    48 well 0.95 1.5-2.0x10^6 cells/mL 150 μL
    96 well 0.32 1.5-2.0x10^6 cells/mL 50-100 μL
    Table 6. Average number of cells per g tissue
    Species Average # cells/g tissue
    Danio rerio 6,400,000
    Danio dangila 1,783,000
    Devario aequipinnatus 1,797,000
    Oncorhynchus mykiss 66,800
    Table 7. Recommended Incubation Temperatures
    Species Temperature
    Danio/ Devario spp. 26 - 28 °C
    Oncorhynchus/Salmo spp. 10* - 18 °C
    Ambystoma mexicanum 18°C
    * Lower temperatures support lower proliferation rates.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345 (2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    Tags

    יסוד פרוטוקול גיליון 86 myogenesis דג הזברה היצמדות למנגנון תרבית תאים Danio הענק Danio המשופם myotubes התפשטות התמיינות Danioninae האמביסטומה
    הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Froehlich, J. M., Seiliez, I.,… More

    Froehlich, J. M., Seiliez, I., Gabillard, J. C., Biga, P. R. Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages. J. Vis. Exp. (86), e51354, doi:10.3791/51354 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter