في الثقافة المختبر أثبتت أنظمة لا غنى عنها في فهمنا لتكون العضل الفقاريات. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن تنمية العضلات والهيكل العظمي nonmammalian والنمو، لا سيما في الأصناف القاعدية. بروتوكول كفاءة وقوية لعزل الخلايا الجذعية البالغة من هذا النسيج، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، والحفاظ على التجديد الذاتي، والانتشار، وتمايز في إطار الثقافة الأولية يسمح لتحديد آليات تنظيمية والحفظ في جميع أنحاء متباينة الأنساب الفقاريات.
نظرا لصعوبة الكامنة والوقت الذي يتطلبه مع دراسة برنامج عضلي في الجسم الحي، ونظم الثقافة الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية البالغة من سكان العضلات والهيكل العظمي، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، وقد ثبت لا غنى عنها في فهمنا لتطوير الهيكل العظمي والعضلات في الثدييات و النمو. خاصة بين الأصناف القاعدية من الفقاريات، ولكن، من محدودية البيانات واصفا الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الذات، والانتشار، والتفريق بين البلدان المتوسطية الشريكة. ذات أهمية خاصة هي الآليات المحتملة التي تكمن وراء قدرة الفقاريات القاعدية للخضوع كبيرة postlarval الهيكل العظمي ليف عضلي تضخم (أي الأسماك مكتملة العظام) وتجديد كامل بعد فقدان أطرافهم (أي urodele البرمائيات). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام myoblasts مثقف مساعدة في فهم التجديد وخلاصة البرنامج عضلي والخلافات بينهما. إلىلهذه الغاية، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول قوية وفعالة (والاختلافات فيه) لعزل والمحافظة على البلدان المتوسطية الشريكة وذريتها، وmyoblasts myotubes غير ناضجة، في خلية ثقافة كمنصة لفهم تطور البرنامج عضلي، بدءا من أكثر الفقاريات القاعدية. الاستفادة من الوضع الكائن نموذج من الزرد (دانيو rerio)، ونحن تقريرا عن تطبيق هذا البروتوكول لأسماك صغيرة من كليد الكارب Danioninae. جنبا إلى جنب، وهذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحقيق المنهج المقارن أوسع من خلال عزل الدول المتوسطية الشريكة من قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum) وحتى القوارض المختبر. والآن تستخدم على نطاق واسع في دراسة هذا البروتوكول تكون العضل في العديد من أنواع الأسماك، بما في ذلك سمك السلمون المرقط قوس قزح، والسلمون، والشبوط 1-4.
لقد تم الحصول على فهم كبير من الثدييات تكون العضل من خلال خلاصة هذه العملية في كل من الماوس الأساسي (المصحف العضلة) myoblast الثقافات وخط الخلية المستمدة من الماوس موصوفة وصفا جيدا، C2C12 5. بدأت في 1950s 6، وقد أدت هذه الثقافات إلى الكثير من التقدم في فهم البرنامج murinemyogenic، وبالتالي، تكون العضل في الفقاريات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، زادت خلية واحدة تقنيات ليف عضلي ازدراع من فهم التفاعلات بين الخلايا الأقمار الصناعية وmyofibers المحيطة 7-9. الثقافات الخليوي وجاذبية خاصة للتحقيقات من تكون العضل بسبب الوقت القصير من السلائف لخلايا متمايزة 10، السهولة النسبية لترنسفكأيشن لرني 11-14، 15،16 المعدلة وراثيا و overexpression الدراسات 14،17،18، التوسع في المختبر تليها زرع في الجسم الحي 18-20، وحتى شركاتاريسون الخلايا السلائف عضلي وكلاء ينظم لهم عبر الأصناف 21،22. بينما الاختلافات نظرا للبيئة اصطناعية للنظام الثقافة وقد وصفت 5،23، وقد أثبتت هذه النظم في المختبر ليكون لا غنى عنه لدينا تشريح برنامج معقدة تنظم تشكيل متعددة النوى، mononucleated myofibersfrom متباينة عضال الخلايا الاصلية التكاثري المعروفة باسم myosatellite الخلايا (اللجان الدائمة) بين الثدييات.
خارج من فئة الثدييات، ومع ذلك، فهم الحفظ و / أو اختلاف في آليات السيطرة تكون العضل سيئة، إلى حد كبير بسبب صعوبة في زراعة الخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) وmyoblasts من مختلف الأصناف. في الواقع، لقد فقط وصفت الثقافات myoblast الأولية في ثلاثة طيور 24-26، واحدة من الزواحف 27، عدد قليل من البرمائيات 28-30، وبعض الأسماك 1،3،4،31-33. خطوط الخلايا عضلي مستمر من هاءrtebrates غيرها من القوارض 34-36، بل هي أكثر نادرة، مع الخط فقط غير الثدييات عضلي خلية مشتق من السمان الياباني (Cortunix تفرضه اليابان)، QM7 37. على الرغم من العديد من المحاولات في تخليد، لا يزال خط خلية عضلي مكتملة العظام بعيد المنال، وبروتوكول للترنسفكأيشن كفاءة هذه الخلايا تم نشره فقط هذا العام 15. وبالتالي، فإن هناك حاجة بروتوكولات واضحة جدا وجيدا الأمثل لزراعة البلدان المتوسطية الشريكة الابتدائية وmyoblasts من مجموعة متنوعة من الفقاريات بكثير ليس فقط لتوسيع معرفتنا لتطور البرنامج عضلي، ولكن لتوظيف قوة علم وظائف الأعضاء المقارن لتحقيق اختراقات في علاج أمراض العضلات والهيكل العظمي البشري والاضطرابات.
في حين أن الأدب يحتوي على العديد من التقارير MPC / myoblast العزلة 38-49، فإنه من الشائع للكتاب لوصف بروتوكولات لمثل هذه العزلة في سطور، غالبا ما تكون ناقصة، والأشكال. علاوة على ذلك، معظم بروتوكولات المفيد الريبوrted تم تطويرها للفئران 50-53، وبعض هذه تعتمد على اختيار الأجسام المضادة 54،55 أو 56،57 الجينات المحورة مضان، مما يجعل هذه البروتوكولات غير صالحة للاستعمال أو الأنواع غير القوارض اعمق غير عملي يستخدمها علماء البيولوجيا العضلات. مع المعروفة قليلا عن السمكية، البرمائيات، والزواحف تكون العضل، بروتوكول مفصلة وشاملة، وصفت مع التوجيه السمعي البصري وبكفاءة تظاهروا في الأنواع بعيدة الصلة، ستكون مفيدة للغاية في الميدان.
وصف لأول مرة من قبل باول وزملاؤه في عام 1989 58، وقد وضعت البروتوكول التالية في البداية إلى عزل الدول المتوسطية الشريكة وmyoblasts من أسماك السلمون (وهي تراوت قوس قزح، هينوكس mykiss، وسمك السلمون الأطلسي، سالموسالار) وبعض الكارب أكبر (أي ذهبية، Carassiusauratusauratus) . في عام 2000، وFauconneau Paboeuf الأمثل ثقافة myoblast الأولية لتراوت قوس قزح 59، وminoroptimizations أماهدي هذا البروتوكول للاستعمال في عدة البلم أصغر من كليد Danioninae (الزرد، دانيو rerio، ودانيو العملاق، Devario aequipinnatus) 32 وذلك بسبب العديد من الأدوات الجينية المتاحة للعمل الزرد وبالتالي الأقارب المقربين. الأسماك مكتملة العظام هي كائنات جذابة للدراسة نظرا لاستراتيجيتهم النمو المتباينة (على الأقل في معظم الأنواع). السلمون كبيرة، مثل معظم الأسماك، وتنمو indeterminately، مع إمكانات النمو لا يعوقها على الخط المقارب عند الاستحقاق، حتى في سن الشيخوخة 60-62. خلافا الزرد، danionins كبيرة مثل دانيو العملاق 63 وإمكانات النمو العرض دانيو شاربان نموذجية من الأسماك مكتملة العظام، مما يجعل تجاور بهم مباشرة إلى منصة مثالية لفهم ما إذا كان اختيار مصير الخلية لجنة السياسة النقدية تلعب دورا في تضخم العضلات والهيكل العظمي مقابل تضخم.
وبالمثل، لقد أثبتنا أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الفئران وقنافذ البحر، مع العائد خلية عالية نسبيا وviabمؤشرات ility. السلمندر Urodele، مثل قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum)، وتمتلك قدرة ملحوظة على تجديد الأنسجة، بما في ذلك الأطراف وذيول 64-66 بأكمله. هذه الخاصية تجعل هذه البرمائيات نماذج مثيرة للاهتمام من تلف العضلات والهيكل العظمي والشيخوخة. باستخدام بروتوكول موضح أدناه، نهجا مماثلا يمكن القيام بها كما حدث في العديد من أنواع الأسماك، وتوفير سياق المقارنة أوسع لمثل هذه الدراسات. كما العديد من علماء الأحياء المقارن حقا نقدر، ويمكن إجراء التقدم الأكثر وضوحا في مجال البيولوجيا الأساسية ومتعدية الطب الحيوي عندما يتم تحليل البيانات ضمن أوسع نطاق (هنا، ونسب الفقاريات بأكمله).
برنامج عضلي، في أيهما الأنواع التي تم فحصها، يمكن دراسة معظم بسهولة من خلال نظام في المختبر. في الواقع، بناء على العزلة، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) في الأسماك أو خلايا myosatellite (اللجان الدائمة) في الثدييات تدخل بسهولة هذه العملية تنطوي على درج…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أعرب العديد بفضل الدكاترة. جوسيب بلاناس وخوان كاستيو للخبرات المهنية في تطوير وتطبيق هذا البروتوكول إلى ثقافة الأسماك الصغيرة والبرمائيات. الشكر أيضا نظرا لعدد لا يحصى من الأفراد الذين ساعدوا بلا كلل مع تشريح والتفكك من الأنسجة العضلية من العديد من الأسماك (سواء في الأنواع والعدد)، بما في ذلك الشحن ماثيو، Delci كريستنسن، زاكاري فاولر، بروك فرانزين، ناثان FROEHLICH، كيرا مارشال، بن ماير، إيثان Remily، وSinibaldo روميرو. وأيد هذا العمل من قبل جامعة ألاباما في برمنغهام قسم البيولوجيا الأموال البدء، مركز البحوث البروتياز المعاهد الوطنية للصحة منح # 2P20 RR015566، المعاهد الوطنية للصحة NIAMS غرانت # R03AR055350، وNDSU تقدم إلى الأمام جبهة الخلاص الوطني جرانت # HRD-0811239 لPRB. وقدم الدعم أيضا من قبل مركز بحوث السمنة UAB التغذية الجائزة # P30DK056336، المعاهد الوطنية للصحة NIDDK. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين والقيام ليس بالضرورةتمثل وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.
Table 1. Detailed Reagent Information | ||||
Reagent | Company (Preferred v. Alternate) | Catalog Number (Preferred v. Alternate) | Quantity per Culture | |
γ-irradiated poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg | |
DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L | |
Laminin | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g | |
HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g | |
Antibiotic/Antimycotic | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17-20 mL | |
Gentamicin Sulfate | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2-3 mL | |
Donor Equine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL | |
Fetal Bovine Sera | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL | |
Collagenase (Type IV) | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g | |
Trypsin (from Pancreas) | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g | |
Table 2. Consumables, Tools and Equipment | ||||
Consumable | Tools | Equipment | ||
Cell Culture Plates | Forceps (Coarse) | Serological Pipettor | ||
Sterile 50 mL Conical Tubes | Forceps (Fine) | pH Meter | ||
Laboratory Tape | Scalpel Handles | Chilling Incubator (Echotherm) | ||
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems | Scalpel Blades (#10, #11) | Laminar Flow Hood | ||
Water-repellant Autoclave Paper | Surgical Scissors | Vacuum Manifold | ||
Serological Pipettes | Glass Petri Dishes | Microosmolality Meter | ||
12-16 G Cannulas with Luer Locks | ||||
Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Poly-L-lysine* | Laminin** | |
6 well | 9.5 | 1.6 mL | 1 | |
24 well | 1.9 | 0.32 | 0.2 | |
48 well | 0.95 | 0.16 | 0.1 | |
96 well | 0.32 | 0.06 | 0.03 | |
*0.1 mg/mL concentration | ** 0.020 mg/mL concentration | |||
Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture | ||||
Reagent | Isolation | Wash | Dissociation | Complete |
Base Medium | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL | 178.00 mL |
PSF* | 5.00 mL | 4.00 mL | 3.00 mL | 2.00 mL |
Gentamicin Sulfate** | 0.75 mL | 0.60 mL | – | – |
Donor Equine Serum | 75.00 mL | – | – | – |
Fetal Bovine Serum*** | – | – | – | 20.00 mL |
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized | ||||
Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes | ||||
Plate Size | cm^2 per Well | Dilution | Plating Volume | |
6 well | 9.5 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 1 mL | |
24 well | 1.9 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 250 μL | |
48 well | 0.95 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 150 μL | |
96 well | 0.32 | 1.5-2.0×10^6 cells/mL | 50-100 μL | |
Table 6. Average number of cells per g tissue | ||||
Species | Average # cells/g tissue | |||
Danio rerio | 6,400,000 | |||
Danio dangila | 1,783,000 | |||
Devario aequipinnatus | 1,797,000 | |||
Oncorhynchus mykiss | 66,800 | |||
Table 7. Recommended Incubation Temperatures | ||||
Species | Temperature | |||
Danio/ Devario spp. | 26 – 28 °C | |||
Oncorhynchus/Salmo spp. | 10* – 18 °C | |||
Ambystoma mexicanum | 18°C | |||
* Lower temperatures support lower proliferation rates. |