Utarbeidelse av Primary Myogenic Precursor Cell / myoblast kulturer fra Basal virveldyr Lineages

Summary

In vitro kultur systemer har vist seg uunnværlig for vår forståelse av virveldyr myogenese. Imidlertid gjenstår mye å lære om nonmammalian skjelettmuskelutvikling og vekst, spesielt i basal taxa. En effektiv og robust protokoll for å isolere de voksne stamceller i dette vevet, myogenisk forløper celler (MPCs), og opprettholde sin selv-fornyelse, proliferasjon og differensiering i en primærkultur innstilling muliggjør identifisering av konserverte og divergerende reguleringsmekanismer i hele virveldyr linjene.

Abstract

På grunn av den iboende vanskeligheter og tid involvert med å studere myogenisk program in vivo, primærkultursystemer som stammer fra de fastboende voksne stamceller av skjelettmuskulatur, de myogeniske forløper celler (MPCS), har vist seg uunnværlig for vår forståelse av pattedyr skjelettmuskelutvikling og vekst. Særlig blant den basale taxa av Vertebrata, men data er begrenset beskriver de molekylære mekanismene som kontrollerer selvfornyelse, spredning og differensiering av MPCs. Av spesiell interesse er potensielle mekanismer som ligger til grunn for evnen til basale virveldyr å gjennomgå betydelig postlarval skjelett myofiber hyperplasia (dvs. beinfisk) og full regenerering følgende vedheng tap (dvs. urodele amfibier). I tillegg kan bruk av dyrkede myoblaster hjelp i forståelsen av regenereringen, og gjentagelse av de myogenic program, og forskjellene mellom dem. Ådette for øye, vi beskriver i detalj en robust og effektiv protokoll (og varianter der) for å isolere og vedlikeholde MPCs og deres avkom, myoblasts og umodne myotubes, i cellekultur som en plattform for å forstå utviklingen av myogenisk programmet, som begynner med den mer basal virveldyr. Utnytte modellorganisme status for sebrafisk (Danio rerio), rapporterer vi om anvendelsen av denne protokoll til små fiskene i cyprinid clade Danioninae. I tandem, kan denne protokollen brukes til å realisere en bredere komparativ tilnærming ved å isolere MPCs fra den meksikanske Axolotl (Ambystomamexicanum) og til og med laboratorie gnagere. Denne protokollen er nå mye brukt i å studere myogenese i flere fiskearter, inkludert regnbueørret, laks, og sea bream ^1-4.

Introduction

Betydelig forståelse av pattedyr myogenese er innhentet gjennom reprisen av denne prosessen i både primær mus (Mus musculus) myoblast kulturer og godt beskrevet mus-avledet cellelinje, C2C12 ^fem. Starten i 1950 ^6, har disse kulturene førte til mye fremme i forståelsen av murinemyogenic programmet, og i forlengelsen, myogenese i andre virveldyr. I tillegg har enkeltcelle myofiber eksplantering teknikker økt ut forståelse av interaksjonen mellom satellittceller og omkringliggende myofibers ^7-9. Cellekulturer er spesielt attraktivt for undersøkelser av myogenese grunn av den korte tiden fra forløperen til differensiert celle ^10, relativt enkelt transfeksjon for RNAi ^11-14, transgene ^15,16 og overekspresjon studier ^14,17,18, in vitro ekspansjon etterfulgt av in vivo transplantasjon ^18-20, og til og med kompArison av myogeniske forløper celler og deres regulerings agenter over taxa ^21,22. Mens forskjeller på grunn av kunstig miljø av kulturen systemet har blitt beskrevet ^5,23, har disse in vitro-systemer vist seg å være uunnværlig for vår disseksjon av den intrikate program som styrer dannelsen av multinucleated, terminalt differensiert myofibersfrom mononukleærerte proliferative stamceller kalles myosatellite celler (MSCS) blant pattedyr.

Utenfor av klassen Mammalia, men bevaring og / eller divergens av mekanismene som styrer myogenese er dårlig forstått, hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med dyrking myogeniske forløper celler (MPCS) og myoblasts fra ulike taxa. Faktisk har primærinnsidere myoblast kulturer bare blitt beskrevet i tre fugler ^24-26, en reptil ^27, noen amfibier ^28-30, og noen fisker ^1,3,4,31-33. Kontinuerlige myogeniske cellelinjer fra veandre enn gnagere ^34-36 rtebrates er enda mer sjeldne, med den eneste ikke-pattedyr myogenic cellelinje som blir avledet fra japansk vaktel (Cortunix japonica), QM7 ^37. Til tross for mange forsøk på immortalization, er fortsatt en bein myogenic cellelinje unnvikende og en protokoll for effektiv transfeksjon av disse cellene ble kun utgitt i år ^15. Dermed er klare og godt optimalisert protokoller for dyrking primære MPCs og myoblasts fra en rekke virveldyr veldig mye nødvendig å ikke bare ytterligere utvide vår kunnskap om utviklingen av myogenisk program, men å ansette kraften i sammenlignende fysiologi å gjøre gjennombrudd i ved behandling av human skjelettmuskelsykdommer og lidelser.

Mens litteraturen inneholder mange rapporter om MPC / myoblast isolasjon ^38-49, er det vanlig for forfattere å beskrive protokoller for slike isoleringer i korte, ofte ufullstendige, formater. Videre, de mest lærerike protokollene reported har blitt utviklet for mus ^50-53, og noen av disse er avhengige av antistoff utvalg ^54,55 eller fluorescens transgener ^56,57, noe som gjør disse protokollene ubrukelig eller upraktisk innerste ikke-gnagerarter benyttes av muskel biologer. Med lite kjent om piscine, amfibier, og reptil myogenese, en detaljert og grundig protokoll, beskrevet med audiovisuelle veiledning og med demonstrert effektivitet i fjernt beslektede arter, ville være mest nyttig til feltet.

Først beskrevet av Powell og kolleger i 1989 ^58, ble følgende protokoll opprinnelig utviklet for å isolere MPCs og myoblasts fra laksefisk (nemlig regnbueørret, Oncorhynchus mykiss, og atlantisk laks, Salmo salar) og noen større karpefisker (dvs. gullfisk, Carassiusauratusauratus) . I 2000, Fauconneau og Paboeuf optimalisert en primær myoblast kultur for regnbueørret ^59, og minoroptimizations made at protokollen utilizable i flere mindre ørekyt i Danioninae clade (sebrafisk, Danio rerio, og gigantiske Danio, Devario aequipinnatus) ³² på grunn av de mange genetiske verktøy tilgjengelig for sebrafisk arbeid og dermed dets nære slektninger. Beinfisk er attraktive organismer for studien på grunn av deres avvikende vekststrategi (i hvert fall i de fleste arter). Store laksefisk, som de fleste fisker, vokse indeterminately, med vekstpotensial ubundet av en asymptote ved forfall, selv i høy alder ^60-62. I motsetning til sebrafisk, store danionins som den store Danio ⁶³ og barte Danio skjerm vekstpotensialer typisk for beinfisk, noe som gjør deres direkte sidestilling en ideell plattform for forståelse om MPC celle skjebne valg spiller en rolle i skjelettmuskulatur hyperplasi versus hypertrofi.

Likeledes har vi vist at denne protokollen kan brukes med mus og axolotls, med relativt høy celleutbytte og viability indekser. Urodele salamandere, for eksempel meksikanske Axolotl (Ambystomamexicanum), har bemerkelsesverdig evne til å regenerere vev, inkludert hele lemmer og haler ^64-66. Denne egenskapen gjør disse amfibier interessante modeller av skjelettmuskelsvinn og aldring. Ved hjelp av protokollen beskrevet nedenfor, kan en lignende tilnærming foretas som har blitt gjort i mange fiskearter, noe som gir et enda bredere komparativ kontekst for slike studier. Som mange virkelig komparative biologer setter pris på, de mest meningsfulle fremskritt innen grunnleggende biologi og translasjonell biomedisin kan gjøres når data analyseres innenfor det bredeste spekteret (her, hele virveldyr avstamning).

Protocol

Etikk Uttalelse: All eksperimentering involverer virveldyr som er beskrevet her ble godkjent på forhånd av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Alabama i Birmingham og er i samsvar med retningslinjer fastsatt av Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health i USA Department of Health and Human Services. En. Forberedelse til Kultur Klargjør basismedium som følger: 9 mM NaHCO3 (1,51 g per 2 L), 20 mM HEPES (9.53 g p…

Representative Results

Tjuefire timer etter såing, myogeniske forløper celler (MPCS) skal være synlig festet til laminin grunnen (se figur 1a og 1d). Etter såing, celler (MPCS) innta en spindel-lignende form, en indikasjon på denne celletype (figur 1) og er MyoD1 + (figur 2). I Danio artene, MPCs synes å være mer kompakt med mindre bipolare prosesser enn gjør MPCs fra Oncorhynchus og Salmo arter. Men over fire dager med kultur, MPCs fra alle…

Discussion

Den myogenic program, i hvilken undersøkte arter, kan lettest undersøkt ved en in vitro-system. Faktisk, på isolasjon, myogeniske forløper celler (MPCS) i fisk eller myosatellite celler (MSCS) i pattedyr lett inn i denne svært regulert prosess som involverer spredning, cellesyklus tilbaketrekking, og terminal differensiering av myoblasts og sammensmeltingen av disse myoblasts inn gryende myotubes. Den generelle mangelen på transgene genet reporter stammer av piscine arter (med mulig unntak av sebrafisk <s…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.