Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

Summary

El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la proliferación y la diferenciación en un entorno de cultivo primario permite la identificación de los mecanismos de regulación conservados y divergentes a lo largo los linajes de vertebrados.

Abstract

Debido a la dificultad y el tiempo inherente implicado con estudiar el programa miogénico in vivo, los sistemas de cultivo primarios derivados de las células madre adultas residentes de músculo esquelético, las células precursoras miogénicas (PSM), han demostrado ser indispensable para nuestra comprensión del desarrollo del músculo esquelético de mamíferos y crecimiento. Particularmente entre los taxones basal de vertebrados, sin embargo, los datos son limitados describir los mecanismos moleculares que controlan la auto-renovación, la proliferación y diferenciación de los PSM. De particular interés son los posibles mecanismos que subyacen a la capacidad de los vertebrados basales a someterse considerable postlarvas miofibra hiperplasia esquelético (es decir, peces teleósteos) y la regeneración completa tras la pérdida apéndice (es decir urodelos anfibios). Además, el uso de mioblastos cultivados podría ayudar en la comprensión de la regeneración y la recapitulación del programa miogénico y las diferencias entre ellos. Aello, se describe en detalle un protocolo robusto y eficiente (y sus variaciones) para aislar y mantener PSM y su progenie, mioblastos y miotubos inmaduros, en cultivo celular como una plataforma para la comprensión de la evolución del programa miogénico, comenzando por el más vertebrados basales. Aprovechando la situación organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), informe sobre la aplicación de este protocolo para pequeños peces del clado ciprínidos Danioninae. A la par, este protocolo puede utilizarse para realizar un enfoque comparativo más amplio mediante el aislamiento de los PSM del ajolote mexicano (Ambystomamexicanum) e incluso roedores de laboratorio. Este protocolo se utiliza ampliamente en el estudio de la miogénesis en varias especies de peces, como la trucha arco iris, el salmón, el besugo y ^1-4.

Introduction

Entendimiento considerable de miogénesis mamíferos se ha obtenido a través de la recapitulación de este proceso en los dos cultivos de mioblastos de ratón primario (Mus musculus) y la línea celular derivada de ratón bien descrito, C2C12 ^5. A partir de la década de 1950 ^6, estas culturas han dado lugar a mucho progreso en la comprensión del programa murinemyogenic y, por extensión, la miogénesis en otros vertebrados. Además, una sola célula de las técnicas de miofibras de explantes han aumentado a cabo comprensión de las interacciones entre las células satélite y miofibras que rodean ^7-9. Los cultivos celulares son particularmente atractivos para las investigaciones de la miogénesis debido al corto tiempo de precursor de célula diferenciada ^10, relativa facilidad de la transfección para ARNi ^11-14, transgénico ^15,16 y sobreexpresión estudios ^14,17,18, la expansión in vitro seguida de trasplante in vivo ^18-20, e incluso un borradorarison de células precursoras miogénicas y sus agentes reguladores de todo taxa ^21,22. Mientras que las diferencias debido a la ambiente artificial del sistema de cultivo han sido descritos ^5,23, estos sistemas in vitro han demostrado ser indispensable para nuestra disección del programa intrincada que rige la formación de multinucleadas, myofibersfrom diferenciación terminal mononucleadas células progenitoras proliferativas conocidas como myosatellite células (MSC) entre los mamíferos.

Fuera de la clase de los mamíferos, sin embargo, la conservación y / o divergencia de los mecanismos que controlan la miogénesis, son poco conocidos, en gran parte debido a la dificultad en el cultivo de células precursoras miogénicas (PSM) y mioblastos de varios taxones. De hecho, cultivos de mioblastos primarios sólo se han descrito en tres aves ^24-26, un reptil ^27, un par de anfibios ^28-30, y algunos peces ^1,3,4,31-33. Continuas líneas de células miogénicas de VErtebrates distintas de roedores ^34-36 son aún más raros, con la única línea que no sean mamíferos miogénica de células que se deriva de la codorniz japonesa (Cortunix japonica), QM7 ^37. A pesar de muchos intentos de inmortalización, una línea celular miogénica teleósteos sigue siendo difícil de alcanzar y un protocolo para la transfección eficiente de estas células sólo se publicó este año ^15. Por lo tanto, los protocolos claros y bien optimizados para el cultivo de los PSM primarias y mioblastos a partir de una variedad de vertebrados son muy necesarias, no sólo para ampliar aún más nuestro conocimiento de la evolución del programa miogénico, pero para emplear el poder de la fisiología comparada a hacer avances en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético y trastornos humanos.

Mientras que la literatura contiene muchos informes de aislamiento MPC / mioblastos ^38-49, es común que los autores describen los protocolos para estos aislamientos en breves, a menudo incompletos, formatos. Además, los protocolos más instructivas reportorted se han desarrollado para los ratones ^50-53, y algunos de ellos dependen de la selección de anticuerpos ^54,55 o ^56,57 transgenes de fluorescencia, por lo que estos protocolos inutilizable o especie no roedora más íntimos poco prácticos utilizados por los biólogos musculares. Con poco conocido sobre piscine, anfibios y reptiles miogénesis, un protocolo detallado y minucioso, que se describe con la guía audiovisual y con una eficacia demostrada en especies alejadas, sería más útil para el campo.

Descrita por primera vez por Powell y sus colegas en 1989 ^58, el siguiente protocolo fue desarrollado inicialmente para aislar PSM y mioblastos de salmónidos (a saber, la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, y el salmón del Atlántico, Salmo salar) y algunos ciprínidos grandes (es decir, peces de colores, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau y Paboeuf optimizan una cultura de mioblastos primarios para la trucha arco iris ⁵⁹ y minoroptimizations made ese protocolo utilizable en varios pececillos pequeños del clado Danioninae (pez cebra, Danio rerio, y danio gigante, Devario aequipinnatus) ³² debido a las muchas herramientas genéticas disponibles para el trabajo de pez cebra y por lo tanto sus familiares cercanos. Peces teleósteos son organismos atractivos para el estudio debido a su estrategia de crecimiento divergente (al menos en la mayoría de las especies). Las grandes salmónidos, como la mayoría de los peces, crecen indeterminadamente, con potencial de crecimiento sin restricciones de una asíntota en la madurez, incluso en edad ^60-62 años. A diferencia de pez cebra, grandes danionins como el danio gigante ⁶³ y potenciales de crecimiento display danio bigotudos típicas de los peces teleósteos, por lo que su yuxtaposición directa en una plataforma ideal para la comprensión de si la elección del destino celular MPC juega un papel en la hiperplasia del músculo esquelético en comparación con la hipertrofia.

Asimismo, hemos demostrado que este protocolo se puede utilizar con ratones y ajolotes, con rendimiento relativamente alto de células y VIABíndices LIDAD. Salamandras urodele, como el ajolote mexicano (Ambystomamexicanum), poseen la notable capacidad de regenerar los tejidos, incluyendo las extremidades y la cola ^64-66 enteras. Esta característica hace que estos anfibios interesantes modelos de pérdida de músculo esquelético y el envejecimiento. Utilizando el protocolo descrito a continuación, un enfoque similar puede llevarse a cabo como se ha hecho en muchas especies de peces, proporcionando un contexto comparativo aún más amplia para tales estudios. Como muchos biólogos verdaderamente aprecian comparativos, los avances más significativos en la biología básica y la biomedicina traslacional se pueden hacer cuando se analizan los datos dentro del más amplio espectro (en este caso, todo el linaje de vertebrados).

Protocol

Declaración de Ética: Todo experimentación con animales vertebrados se describen en el presente documento fue aprobado previamente por el Comité de la Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Cuidado de Animales y el uso y está en consonancia con las directrices establecidas por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos. 1. Preparación para la Cultura Preparar el medio d…

Representative Results

Veinticuatro horas después de la siembra, las células precursoras miogénicas (PSM) deben ser visibles adjunto al sustrato de laminina (véanse las figuras 1a y 1d). Después de la siembra, las células (PSM) adoptan una forma de tipo huso, indicativo de este tipo de células (Figura 1) y son MyoD1 + (Figura 2). En las especies Danio, PSM parecen ser más compacto con procesos bipolares más pequeños que hacen PSM de especie Oncorhynchus…

Discussion

El programa miogénica, en el que las especies examinadas, se puede estudiar más fácilmente a través de un sistema in vitro. De hecho, después del aislamiento, las células precursoras miogénicas (PSM) en el pescado o células myosatellite (MSC) en mamíferos entran fácilmente este proceso altamente regulado que implica la proliferación, la retirada del ciclo celular, y la diferenciación terminal de los mioblastos y la fusión de los mioblastos en miotubos nacientes. La falta general de cepas transgéni…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.