Ce protocole décrit l'enregistrement extracellulaire des réponses potentielles d'action tirés par les neurones gustatifs labellar chez la drosophile.
La réponse du périphérique goût des insectes peut être puissamment étudié avec des techniques électrophysiologiques. La méthode décrite ici permet au chercheur de mesurer les réponses gustatives directe et quantitative, reflétant l'entrée sensorielle que le système nerveux des insectes reçoit de stimuli du goût de son environnement. Ce protocole décrit les principales étapes de l'exécution de cette technique. Les étapes essentielles de l'assemblage d'un appareil de l'électrophysiologie, tels que la sélection de l'équipement nécessaire et un environnement approprié pour l'enregistrement, sont délimitées. Nous décrivons également comment se préparer à l'enregistrement en faisant électrodes de référence et d'enregistrement appropriés et des solutions exhausteur de goût. Nous décrivons en détail la méthode utilisée pour la préparation de l'insecte par insertion d'une électrode de référence de verre dans la volée pour immobiliser la trompe. On montre les traces des impulsions électriques alimentées par les neurones gustatifs en réponse à un sucre et d'un composé amer. Aspects du protocole sont techniquement difficile et nous incluons une description détaillée de certaines difficultés techniques communes que l'on peut rencontrer, comme l'absence de signal ou de bruit excessif dans le système, et les solutions possibles. La technique a ses limites, comme l'impossibilité de livrer stimuli temporellement complexes, observer fond de tir juste avant stimulus livraison, ou utiliser des composés de goût insolubles dans l'eau facilement. Malgré ces limites, cette technique (y compris les variations mineures mentionnées dans le protocole) est une procédure standard largement accepté pour l'enregistrement des réponses neuronales Drosophila goûter composés.
Le sens du goût permet un insecte de détecter une vaste gamme de produits chimiques solubles et joue un rôle important dans l'acceptation d'une substance nutritive, ou le rejet d'un être nocif ou toxique. Le goût est aussi pensé pour jouer un rôle dans le choix du conjoint, grâce à la détection des phéromones 1-5. Ces fonctions importantes et diversifiées ont rendu le système de goût insecte une cible irrésistible de l'enquête sur la façon dont les systèmes sensoriels traduisent les signaux environnementaux en sorties comportementales pertinentes.
L'unité principale du système de goût de Drosophila melanogaster est le poil de goût, ou sensille. Molécules entrent dans le sensille via un pore à son extrémité 2,6. Sensilles se trouvent sur le labelle, les jambes, le bord de l'aile, et le pharynx 6. Sur le labelle, le nombre et l'emplacement des sensilles est stéréotypés. Il existe trois classes morphologiques de sensilles fonction de la longueur: long (L), intermédiaire (I), et court (S ) Sensilles 7,8. Chaque sensille contient soit deux (de type I) ou quatre (L-et S-type) neurones récepteurs gustatifs (GRNS 9). Différents GRNS répondre aux différentes catégories de stimuli du goût: amer, le sucre, le sel et l'osmolarité 7,10 et expriment différents sous-ensembles de récepteurs gustatifs 8,11-13. Seulement I et de type S sensilles contiennent GRNS amères sensible 8,10. Le projet GRNS au ganglion subesophageal (SOG) et leur activation par des molécules de goût est relayé vers le système nerveux central supérieur pour le décodage, ce qui entraîne une réponse comportementale 6. Le nombre relativement faible de neurones et la susceptibilité à l'analyse moléculaire et comportementale rendre le système de goût Drosophila un excellent modèle pour l'étude des systèmes gustatives en général. La relative facilité avec laquelle le système peut être manipulé par une mutation génétique ou le système d'expression GAL4 UAS est aussi un outil précieux 14,15.
ontenu "> Parce que ces sensilla dépassent de la surface de la labellum, ils sont d'excellentes cibles pour l'électrophysiologie. L'allumage des GRNS peut être contrôlée en utilisant l'enregistrement extracellulaire. Historiquement, le procédé d'enregistrement de paroi latérale, qui utilise une électrode de verre inséré dans le sensille pour enregistrer l'activité neuronale, 26 a été la méthode d'enregistrement d'extrémité, qui mesure la réponse des neurones avec une électrode utilisée. Cependant, cette méthode est techniquement difficile à réaliser, et il est difficile d'enregistrer pendant longtemps à partir de chaque préparation. que délivre simultanément un exhausteur de goût, devenu depuis la méthode de choix 9,16. Il a été utilisé pour étudier le système de goût de Drosophila melanogaster 8,10,17,18 ainsi que d'un certain nombre d'autres espèces d'insectes 19-23. Elle a été grandement facilité par le développement de l'amplificateur tastePROBE, qui a surmonté l'un des principaux inconvénients de la méthode d'enregistrement de pointe en compensantla grande différence de potentiel entre l'électrode de référence et la sensille d'insecte, ce qui permet les potentiels d'action de GRN à être enregistrées sans amplification excessive ou de filtrage 24. Un autre développement important a été l'utilisation de tricholine citrate comme électrolyte enregistrement 25. STC supprime les réponses du GRN de l'osmolarité sensible et ne stimule pas la GRN sensible au sel, faire les réponses générées par tastants amères et le sucre beaucoup plus facile à analyser 25.Nous décrivons ici l'enregistrement de la drosophile labellar sensilles de pointe est actuellement effectué dans le laboratoire Carlson. Ce protocole explique comment établir une plate-forme appropriée de l'électrophysiologie, la façon de préparer la volée, et la façon d'effectuer des enregistrements de goût. Nous présentons également des données représentatives obtenues par l'enregistrement de sous-ensembles de la drosophile sensilles, ainsi que certains problèmes courants et les solutions possibles qui peuvent survenir lors de l'utilisation de cettetechnique.
Sensilla Labellar varient dans la facilité d'enregistrement en raison de différences de morphologie et de l'organisation anatomique. Parfois, un sensille ne répond pas à toutes les substances sapides, même celui qui est connu pour déclencher une réponse positive. La fréquence à laquelle cela se produit varie en fonction du type sensille. L sensilles sont les plus constamment réceptifs et sont relativement faciles d'accès en raison de leur longueur. En général, S sensilles sont toujours sensibles…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention de 1F31DC012985 prédoctorale NRSA (à RD) et par des subventions du NIH à JC
Nous tenons à remercier le Dr Weiss Linnea des commentaires utiles sur le manuscrit, le Dr Ryan Joseph pour aider les compiler les chiffres, et le Dr Frédéric Marion-Poll pour des conseils techniques utiles. Nous tenons également à remercier les précieux commentaires de quatre auteurs.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |