Denne protokol beskriver ekstracellulær registrering af action potentielle reaktioner affyret af labellar smag neuroner i Drosophila.
Den perifere smag reaktion insekter kan kraftigt undersøgt med elektrofysiologiske teknikker. Den her beskrevne metode tillader forskeren at måle gustatory svar direkte og kvantitativt, hvilket afspejler den sanseindtryk at insektet nervesystem modtager fra smag stimuli i omgivelserne. Denne protokol beskriver alle vigtige trin i udførelsen af denne teknik. De kritiske trin i at samle en elektrofysiologi rig, såsom udvælgelse af nødvendigt udstyr og et passende miljø til optagelse, der er afgrænset. Vi beskriver også, hvordan man kan forberede sig til optagelse ved at foretage relevante reference-og registreringselektroder, og tastant løsninger. Vi beskriver i detaljer den anvendte metode til at forberede insekt ved indsættelse af et glas referenceelektrode i fluen for at immobilisere snabel. Vi viser spor af de elektriske impulser, som opvarmes med smag neuroner som reaktion på en sukker-og en bitter forbindelse. Aspekter ved protokollen er technically udfordrende og vi inkluderer en omfattende beskrivelse af nogle fælles tekniske udfordringer, der kan opstå, såsom manglende signal eller overdreven støj i systemet, og mulige løsninger. Teknikken har begrænsninger, såsom manglende evne til at levere tidsligt komplekse stimuli, observere baggrund fyring umiddelbart før stimulus levering, eller brug vanduopløselige smag forbindelser bekvemt. På trods af disse begrænsninger, denne teknik (herunder mindre variationer der henvises til i protokollen) er en standard, bredt accepteret procedure for registrering af Drosophila neuronale reaktioner at smage forbindelser.
Smagssansen giver et insekt for at opdage en bred vifte af opløselige kemikalier og spiller en vigtig rolle for accepten af en nærende substans, eller afvisning af et farligt eller giftigt én. Taste menes også at spille en rolle i mate udvælgelse, gennem påvisning af feromoner 1-5. Disse vigtige og forskelligartede funktioner har gjort det insekt smag systemet en overbevisende mål for undersøgelse af, hvordan sansesystemer oversætte miljømæssige signaler i relevante adfærdsmæssige udgange.
Den primære enhed i Drosophila melanogaster smag system er smagen hår, eller sensillum. Molekyler indtaste sensillum via en pore på spidsen 2,6. Sensilla findes på labellum, benene, vingen margen og svælget 6.. På labellum, er antallet og placeringen af sensilla stereotype. Der er tre morfologiske klasser af sensilla baseret på længde: Den lange (L), mellemprodukt (I) og korte (S ) Sensilla 7,8. Hver sensillum indeholder enten to (I-type) eller fire (L-og S-type) gustatory receptor neuroner (GRNs) 9. Forskellige GRNs reagere på forskellige kategorier af smags stimuli: bitter, sukker, salt og osmolaritet 7,10 og udtrykke forskellige delgrupper i gustatoriske receptorer 8,11-13. Kun jeg og S-typen sensilla indeholde bitter-reagerende GRNs 8,10. Den GRNs projektet til subesophageal ganglion (SOG) og deres aktivering af smag molekyler videresendes til den højere centralnervesystemet til dekodning, hvilket resulterer i en adfærdsmæssig reaktion 6. Det relativt lille antal neuroner og modtagelighed for molekylære og adfærdsmæssige analyse gør Drosophila smag systemet en fremragende model til undersøgelse af gustatory i almindelighed. Den relative lethed, hvormed systemet kan manipuleres via genetisk mutation eller GAL4-UAS ekspressionssystem fungerer også som et værdifuldt redskab 14,15.
NDHOLDET "> Fordi disse sensilla stikker ud fra overfladen af labellum, de gør glimrende mål for elektrofysiologi. kan overvåges affyring af GRNs hjælp ekstracellulære optagelse. Historisk set sidevæg optagelse metode, som bruger et glas elektrode indsat i sensillum at optage neuronal aktivitet, 26 er blevet anvendt. denne metode er imidlertid teknisk udfordrende at udføre, og det er vanskeligt at optage langt fra hvert præparat. Spidsen-optagelse metode, der måler responsen af neuroner med en elektrode, samtidig leverer en tastant, da er blevet den foretrukne metode 9,16. Det er blevet anvendt til at undersøge smagen system Drosophila melanogaster 8,10,17,18 samt en række andre insektarter 19-23. Det har blevet lettet betydeligt af udviklingen af tastePROBE forstærker, der overvandt en af de store ulemper ved tip-optagelse metode ved at kompensere forden store potentielle forskel mellem reference elektrode og insekt sensillum, tillade GRN virkningspotentialer skal registreres uden overdreven forstærkning eller filtrering 24. En anden vigtig udvikling var brugen af tricholine citrat som optagelsen elektrolyt 25. TCC undertrykker svar fra osmolariteten-følsomme GRN og stimulerer ikke salt-følsomme GRN, hvilket gør svarene genereret af bitter og sukker tastants meget lettere at analysere 25.Her beskriver vi, hvordan spids indspilning af Drosophila labellar sensilla øjeblikket udføres i Carlson laboratoriet. Denne protokol vil forklare, hvordan man etablerer en passende elektrofysiologi rig, hvordan man forbereder fluen, og hvordan man udfører smag optagelser. Vi præsenterer også nogle repræsentative data opnået ved at optage fra delmængder af Drosophila sensilla, samt nogle almindelige problemer og mulige løsninger, der kan opstå ved brug af denneteknik.
Labellar sensilla varierer i den lette optagelse på grund af forskelle i morfologi og anatomiske organisation. Nogle gange kan en sensillum ikke reagerer på nogen tastants, endda en, der er kendt for at fremkalde en positiv reaktion. Den hyppighed, hvormed dette sker, varierer afhængigt af sensillum type. L sensilla er mest konsekvent lydhøre og er relativt nemt at få adgang på grund af deres længde. Generelt S sensilla konsekvent lydhør, men deres korte længde og placering på labellum god kontakt udfordrende….
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en NRSA predoctoral tilskud 1F31DC012985 (til RD) og NIH tilskud til JC
Vi vil gerne takke Dr. Linnea Weiss for nyttige kommentarer til manuskriptet, Dr. Ryan Joseph for hjælp kompilering figurer og Dr. Frederic Marion-Poll for hjælpsomme teknisk rådgivning. Vi vil også gerne anerkende de nyttige kommentarer fra fire anmeldere.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |