Dit protocol beschrijft extracellulaire van de actiepotentiaal reacties afgevuurd door labellar smaak neuronen in Drosophila.
De perifere smaak respons van insecten kan krachtig worden onderzocht met elektrofysiologische technieken. De hier beschreven methode kan de onderzoeker naar smaak reacties en kwantitatief te meten, als gevolg van de zintuiglijke input dat het zenuwstelsel van een insect ontvangt van smaak prikkels in zijn omgeving. Dit protocol beschrijft alle belangrijke stappen in het uitvoeren van deze techniek. De kritische stappen in het samenstellen van een elektrofysiologie rig, zoals de keuze van de benodigde apparatuur en een geschikte omgeving voor het opnemen, worden afgebakend. We beschrijven ook hoe voor te bereiden voor het opnemen door het maken van de juiste referentie en registrerende elektroden en tastant oplossingen. We beschrijven in detail de werkwijze voor het bereiden van de insecten door insertie van een glazen referentie-elektrode in de vlieg om de slurf immobiliseren. We tonen sporen van de elektrische impulsen afgevuurd door smaak neuronen in reactie op een suiker en een bittere stof. Aspecten van het protocol zijn tp technisch uitdagend en we hebben een uitgebreide beschrijving van een aantal gemeenschappelijke technische problemen die zich kunnen voordoen, zoals het ontbreken van signaal of overmatige ruis in het systeem en mogelijke oplossingen. De techniek heeft beperkingen, zoals het onvermogen om tijdelijk complexe stimuli leveren observeren achtergrond vuren onmiddellijk voorafgaand aan levering stimulus of gebruikt water oplosbare smaak verbindingen gemakkelijk. Ondanks deze beperkingen, deze techniek (inclusief kleine variaties waarnaar in het protocol) is een standaard, algemeen aanvaard voor het opnemen van Drosophila neuronale reacties op verbindingen proeven.
Het gevoel van smaak laat een insect tot een breed spectrum van oplosbare stoffen te detecteren en speelt een belangrijke rol in de acceptatie van een voedzame stof, of de afwijzing van een schadelijke of giftige een. Smaak is ook gedacht aan een rol spelen bij partnerkeuze, door de detectie van feromonen 1-5. Deze belangrijke en diverse functies hebben het insect smaak systeem een dwingende doelstelling van onderzoek naar hoe sensorische systemen vertalen omgevingsfactoren in relevante gedrags-uitgangen gemaakt.
De primaire eenheid van de Drosophila melanogaster smaak systeem is de smaak haar of sensillum. Moleculen voer de sensillum via een porie in de punt 2,6. Sensilla zijn te vinden op de lip, de benen, de vleugel marge, en de keelholte 6. Op de lip, is het aantal en de locatie van sensilla stereotiep. Er zijn drie klassen van morfologische sensilla basis van lengte: lange (L), tussenproduct (I) en korte (S ) Sensilla 7,8. Elke sensillum bevat ofwel twee (I-type) of vier (L-en S-type) gustatory receptor neuronen (GRNs) 9. Verschillende GRNs reageren op de verschillende categorieën van de smaak stimuli: bitter, suiker, zout en osmolariteit 7,10 en express verschillende subgroepen van smaak receptoren 8,11-13. Alleen I en S-type sensilla bevatten bitter-responsieve GRNs 8,10. De GRNs project om de subesophageal ganglion (SOG) en hun activering door smaakmoleculen wordt doorgegeven aan de hogere centrale zenuwstelsel voor het decoderen, waardoor een gedragsreactie 6. Het relatief kleine aantal neuronen en de ontvankelijkheid voor moleculaire en gedragsanalyse maken het Drosophila smaak systeem een uitstekend model voor het onderzoek naar smaak in het algemeen. Het relatieve gemak waarmee het systeem kan worden gemanipuleerd via genetische mutatie of de GAL4-UAS expressiesysteem dient ook als een waardevol instrument 14,15.
NHOUD "> Omdat deze sensilla uitsteken uit het oppervlak van de lip, zij zijn uitstekende doelwitten voor elektrofysiologie. het afvuren van de GRNs kan gevolgd worden met extracellulaire. Historisch de zijwand opnamemethode met een glazen elektrode ingebracht in de gebruik sensillum neuronale activiteit opnemen, 26 is gebruikt. Deze methode is technisch moeilijk uit te voeren, en het is lastig om vele van elk preparaat. Het uiteinde-opnamemethode, waarbij de reactie van de neuronen meet met een elektrode die tegelijkertijd levert tastant, sinds de voorkeursmethode 9,16 geworden. Het is gebruikt om de smaak stelsel van Drosophila melanogaster 8,10,17,18 en een aantal andere insectensoorten 19-23 onderzoeken. Het is sterk vergemakkelijkt door de ontwikkeling van de tastePROBE versterker, die een van de belangrijkste nadelen van de tip-opnamemethode overwonnen door te compenseren voorhet grote potentiaalverschil tussen de referentie-elektrode en het insect sensillum, waardoor de GRN actiepotentialen op te nemen zonder al te veel versterking of filtering 24. Een andere belangrijke ontwikkeling was het gebruik van tricholine citraat als de opname elektrolyt 25. TCC onderdrukt reacties van de osmolariteit-gevoelige GRN en niet het stimuleren van het zout-gevoelige GRN, waardoor reacties gegenereerd door bittere en suiker tastants veel gemakkelijker te analyseren 25.Hier beschrijven we hoe tip opname van Drosophila labellar sensilla momenteel wordt uitgevoerd in de Carlson laboratorium. Dit protocol zal uitleggen hoe je een geschikte elektrofysiologie rig, hoe de vlieg te bereiden, en hoe je smaak opnamen uit te voeren vast te stellen. Presenteren we ook enkele representatieve gegevens verkregen door het opnemen van deelverzamelingen van Drosophila sensilla, evenals enkele veelvoorkomende problemen en mogelijke oplossingen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van dezetechniek.
Labellar sensilla verschillen in het gemak van opname door verschillen in morfologie en anatomische structuur. Soms is een sensillum niet reageert op elke tastants, zelfs een die bekend staat om een positieve reactie uit te lokken. De frequentie waarmee dit gebeurt is afhankelijk sensillum type. L sensilla meest consistent reageren en zijn relatief gemakkelijk te bereiken vanwege hun lengte. In het algemeen, S sensilla consequent reageren, maar hun korte lengte en de positie op de lip goed contact maken uitdagend….
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een NRSA predoctoral subsidie 1F31DC012985 (RD) en door NIH subsidies aan JC
We willen graag Dr Linnea Weiss bedanken voor nuttig commentaar op het manuscript, dr. Ryan Joseph om hulp samenstellen cijfers, en Dr Frederic Marion-Poll voor nuttig technisch advies. We willen ook graag de behulpzame reacties van vier beoordelaars erkennen.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |