Este protocolo describe registro extracelular de los potenciales de acción respuestas disparados por las neuronas gustativas labellar en Drosophila.
La respuesta de sabor periférica de insectos puede ser poderosamente investigó con técnicas electrofisiológicas. El método aquí descrito permite al investigador para medir las respuestas gustativas directa y cuantitativa, lo que refleja la entrada sensorial que el sistema nervioso de los insectos recibe de estímulos de sabor en su entorno. Este protocolo describe todos los pasos clave en la realización de esta técnica. Los pasos críticos en el montaje de una plataforma de electrofisiología, como la selección de los equipos necesarios y un entorno adecuado para la grabación, se delinean. También describe cómo prepararse para la grabación haciendo electrodos de referencia y registro adecuados y soluciones saborizante. Se describe en detalle el método utilizado para preparar el insecto mediante la inserción de un electrodo de referencia de vidrio en la marcha con el fin de inmovilizar la trompa. Mostramos los rastros de los impulsos eléctricos disparados por las neuronas gustativas en respuesta a un azúcar y un compuesto amargo. Aspectos del protocolo son technically desafiante e incluimos una extensa descripción de algunos problemas técnicos comunes que se pueden encontrar, como la falta de señal o ruido excesivo en el sistema, y las posibles soluciones. La técnica tiene limitaciones, tales como la incapacidad para entregar estímulos temporalmente complejos, observar el fondo de disparar inmediatamente antes de la entrega a los estímulos, o utilizar compuestos de sabor insolubles en agua convenientemente. A pesar de estas limitaciones, esta técnica (incluyendo variaciones menores que se hace referencia en el protocolo) es un estándar, procedimiento ampliamente aceptado para la grabación de las respuestas neuronales de Drosophila para probar compuestos.
El sentido del gusto permite un insecto para detectar una amplia gama de productos químicos solubles y juega un papel importante en la aceptación de una sustancia nutritiva, o el rechazo de un ser nociva o tóxica. Sabor también se cree que desempeñan un papel en la selección de la pareja, a través de la detección de feromonas 1-5. Estas funciones importantes y diversos han hecho que el sistema del gusto del insecto un objetivo convincente de investigación sobre cómo los sistemas sensoriales traducen señales del medio ambiente en las salidas de comportamiento pertinentes.
La unidad principal del sistema del gusto Drosophila melanogaster es el pelo sabor o sensillum. Las moléculas entran en el sensillum a través de un poro en su punta de 2,6. Sensilla se encuentran en el labelo, las piernas, el margen de ala, y la faringe 6. En el labelo, el número y la ubicación de sensilla es estereotipado. Hay tres clases morfológicas de sensilla basados en longitud: la longitud (L), intermedio (I) y corto (S ) Sensilla 7,8. Cada sensillum contiene ya sea dos (de tipo I) o cuatro (L-y de tipo S) neuronas receptoras gustativas (GRNs) 9. Diferentes GRNs responden a diferentes categorías de estímulos sabor: amargo, el azúcar, la sal y la osmolaridad 7,10 y expresan diferentes subconjuntos de receptores gustativos 8,11-13. Sólo I y de tipo S sensilla contengo GRNs-amargas sensible 8,10. El proyecto GRNs al ganglio subesophageal (TG) y su activación por las moléculas de sabor se transmite al sistema nervioso central superior para la decodificación, lo que resulta en una respuesta de comportamiento 6. El relativamente pequeño número de neuronas y la susceptibilidad a un análisis molecular y de comportamiento hacen que el sistema del gusto Drosophila un excelente modelo para la investigación de los sistemas gustativos en general. La relativa facilidad con la que el sistema puede ser manipulado a través de mutación genética o el sistema de expresión de GAL4-UAS también sirve como una herramienta valiosa 14,15.
ONTENIDO "> Debido a que estos sensilla sobresalen de la superficie del labelo, que son excelentes objetivos para electrofisiología. El disparo de los GRNs se puede supervisar usando la grabación extracelular. Históricamente, el método de grabación de la pared lateral, que utiliza un electrodo de vidrio insertado en la sensillum para registrar la actividad neuronal, 26 se ha utilizado. Sin embargo, este método es técnicamente difícil de realizar, y que es difícil de grabar por mucho tiempo a partir de cada preparación. El método de la punta-de grabación, que mide la respuesta de las neuronas con un electrodo que proporciona simultáneamente un saborizante, se ha convertido ya que el método de elección 9,16. Se ha utilizado para investigar el sistema de sabor de Drosophila melanogaster 8,10,17,18, así como un número de otras especies de insectos 19-23. Tiene sido facilitado en gran medida por el desarrollo del amplificador tastePROBE, que superó uno de los principales inconvenientes del método de grabación de punta mediante la compensación dela gran diferencia de potencial entre el electrodo de referencia y el sensillum de insectos, permitiendo que los potenciales de acción GRN a grabarse sin excesiva amplificación o filtrado 24. Otro acontecimiento importante fue el uso de citrato de tricolina como electrolito grabación 25. TCC suprime las respuestas de la GRN-osmolaridad sensible y no estimula la GRN sensibles a la sal, por lo que las respuestas generadas por los sabores amargos y azúcar mucho más fáciles de analizar 25.Aquí se describe cómo grabar punta de Drosophila labellar sensilla se lleva a cabo actualmente en el laboratorio Carlson. Este protocolo le explicará cómo establecer una plataforma adecuada de electrofisiología, la forma de preparar la marcha, y cómo realizar grabaciones gustativas. También presentamos algunos datos representativos obtenidos mediante el registro de los subconjuntos de Drosophila sensilla, así como algunos problemas comunes y las posibles soluciones que se pueden encontrar cuando se utiliza estetécnica.
Sensilla Labellar varían en la facilidad de la grabación debido a las diferencias en la morfología y organización anatómica. A veces, un sensillum no responde a ningún estimulantes del gusto, incluso uno que se conoce para provocar una respuesta positiva. La frecuencia con la que ocurre esto varía dependiendo del tipo de sensillum. L sensilla son más consistentemente sensible y son relativamente fáciles de acceder debido a su longitud. En general, S sensilla son consistentemente sensible, pero su corta longitud…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por una beca predoctoral 1F31DC012985 NRSA (RD) y por el NIH subvenciones a JC
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Linnea Weiss por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, el doctor Ryan Joseph para ayudar a compilar las cifras, y el Dr. Frederic Marion-Poll de asesoramiento técnico útil. También nos gustaría agradecer los útiles comentarios de cuatro colaboradores.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |