Summary
本文所描述的协议旨在解释和删节的复杂路线导致修饰的三磷酸核苷的方法的许多障碍。因此，该协议有利于激活这些构建模块两者的合成及其可用性的实际应用。
Abstract
传统的策略用于引入化学官能团是通过附加适当修改的亚磷酰胺前体到新生链中使用的固相合成的。然而，合成和限制期间使用，以相当短的序列的条件妨碍本方法的适用性。在另一方面，修饰的核苷三磷酸激活已用于轻度引入众多的官能团为核酸，一种策略，铺平了道路，在实际应用广泛的调色板使用修饰的核酸构建模块如功能性标记核酶和脱氧核酶的产生。其中一个主要的挑战在于导致这些核苷类似物的分离和鉴定方法的复杂性。
在这个视频文章中，我们提出的成分股合成一个详细的协议用磷（Ⅲ）为基础的试剂ë修饰的类似物。此外，其生化特性的程序泄露，并特别强调对引物延伸反应和TDT拖尾聚合。这个详细的协议将用于修饰的dNTP的各具特色及其在化学生物学进一步利用。
Introduction
5'-三磷酸核苷（（四）国家结核病防治规划）是一类参与无数的流程和功能，从作为能源的通用货币为细胞代谢的调节是重要的生物分子。他们除了在这些基本的生物转化作用，其修改的同行拥有先进的引入官能团成寡核苷酸一种多用途的，温和的平台，一种方法，很好地补充了自动固相合成，通常是应用1,2。实际上，所提供的（D）的NTPs可作为RNA和DNA聚合酶3基板，具有丰富的官能团，包括氨基酸4-13，硼酸14,15，nornbornene 16，金刚石状残留物17，侧链为有机催化18，胆汁酸19，甚至20的寡核苷酸可被引入到寡核苷酸。
_content“>除了较方便的载体核酸的官能化，改性的dNTPs可从事SELEX和体外选择的用于改性催化核酸21-30和核酸适体用于各种实际应用10的产生等相关的组合方法， 31-36。被修饰的dNTP的聚合而引入的附加 侧链被认为是增加的化学空间，可在一个选择的实验探讨和补充的核酸37的相当差的功能的军火库。然而，尽管这些有吸引力的特征和近期的进展，合成和分析方法的发展作出了，没有普遍适用的和高产的过程存在修饰的核苷三磷酸2,38的各具特色。目前这个协议的目的是摆脱光线进入（有时）复杂的程序，导致吨Ø合成和激活这些积木（ 图1B）的生化特性。特别强调将在所有合成的细节，往往是很难找到或不存在的实验部分，但尚未至关重要，为圆满完成合成途径导致纯（四）国家结核病防治规划的隔离（ 图1）给出。
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Protocol
1。修正的三磷酸核苷的合成
选择的合成方法如下路德维希和埃克斯坦发展，因为这种方法一般是可靠的，并导致极少数的副产物（ 图1A）39的程序。
- Coevaporate的适当3'-OAC-保护的核苷（一般为0.1毫摩尔）与两次无水吡啶（2ml）中，然后在真空下干燥过夜。在同一时间，干三丁基焦磷酸（0.13毫摩尔）在真空下过夜。
- 溶解核苷中的最小无水吡啶（0.2ml）中，并加入无水二恶烷（0.6毫升）作为助溶剂。最后，加入2 - 氯-1,3,2 - benzodioxaphosphorin -4 - 酮（0.11毫摩尔），并允许在室温下反应45分钟。
注意：值得注意的是，特别应注意与2 - 氯-1,3,2 - benzodioxaphosphorin -4 - 酮试剂。事实上，即使在惰性气体的标准大气储存此试剂这里是不足以防止其分解。因此，形成在该分解了的白色固体可以并且应该在使用前刮掉。 - 制备三丁基焦磷酸在干燥的DMF（0.17毫升）中的溶液和新鲜蒸馏的三丁胺（58微升;从未加分子筛）。加所得到的溶液至反应混合物中（出现白色沉淀，但很快消失），并允许在室温下反应45分钟。
- 制备碘溶液（0.16毫摩尔）在吡啶（0.98毫升）和H 2 O（20微升），并加入到以氧化Pα（III）的中间反应混合物中。允许所得到的深色溶液，以在室温下搅拌30分钟。
- 使用的NaS 2 O 3为10％的水溶液以淬灭过量的I 2。在真空下除去溶剂（旋转蒸发器的水浴的温度必须保持在低于30℃）。加入H 2 O的（5毫升），并允许英里夹具放置在室温下30分钟以水解环状三磷酸基团。
- 在这个阶段，保护基团通常被移除（ 即 3'-醋酸和组上的核碱基的侧链）。因此，添加NH 4 OH（在H 2 O的，将10毫升30％）的粗品，并搅拌1.5小时，在室温下，并在真空下除去溶剂。
- 加入2毫升H 2 O和分裂成2管。加12毫升的NaClO 4的丙酮，离心（1,000×g离心）处理30分钟2％的溶液。此过程重复一次。此沉淀允许在从三磷酸（这将沉淀）的合成中使用的溶剂和试剂的分离，从而简化了随后的RP-HPLC纯化基本上。
- 空气干燥后，油状残余物，记录粗制的31 P-NMR谱（按照标准方法，参见材料清单和图3）和溶解在4毫升H 2 O。
注意：该合成方法主要侧重于改性脱氧核苷三磷酸的生成，但一个非常类似的过程可以应用于它们的RNA的对应（通过简单地使用2'，3'-双-O-乙酰化的前体）。
2。修正的三磷酸核苷的高效液相色谱法分离纯化
- 制备三乙基碳酸氢铵（TEAB）的1M储备溶液：40
- 在≈将600ml蒸馏水，过滤的H 2 O的制备1摩尔的三乙胺（139毫升）中的溶液
- 气泡的CO 2（通过干冰和气体鼓泡器）转换成在剧烈搅拌下将溶液直到pH为7.6为止（这将需要至少10小时）。此储备溶液可以储存在冰箱中长达一个月。
- 净化：
- 准备从1个月股票两种缓冲溶液：在超纯水2升50毫米TEAB（洗脱液A）一次1升50mM的三乙胺碳酸氢盐在50％乙腈（洗脱液B）。既洗脱液在真空下搅拌20分钟脱气（特别注意，需要以不通过脱气过程中除去CO 2以改变pH值）。
- 通过在300微升蒸馏水H 2 O的溶解将10μl粗三磷酸的制备分析样品，并注入到装有半制备反相柱（C18）和用梯度测距HPLC系统由在40分钟内0-100％B， （ 图4）。根据三磷酸酯中的R 吨 （这通常是在色谱图上主峰）和磷酸（其中有一个略微较低的R t）的调节性HPLC方案。使用这些条件，并删除可能包含一些二磷酸早分数纯化粗品混合物。
- 结合所有包含该产物的级分并冷冻干燥（这是优选的，以蒸发在旋转蒸发器中以水解尽量减少不希望的diphosph吃了）。 Coevaporate几次用超纯水（从洗脱液除去残余三乙胺）。评估三磷酸通过NMR的纯度（包括1 H和31 P NMR）和MALDI-TOF由应用程序的标准协议（参见图5）。通过应用该协议获得典型的单产一般横亘在30-70％的范围内，根据在基板上。
3。引物延伸反应和TDT聚合
- 引物的5'-末端标记
- 拌30皮摩尔的适当引物（ 例如，P1，材料清单）与4微升10倍多核苷酸激酶（PNK）缓冲液，3微升的γ-[32 P]-ATP，1微升的PNK及ddh 2 O（对于将40μl的总反应体积）。在37℃下孵育反应混合物30分钟，然后加热去激活激酶（在70℃下10分钟）。
- 在标记反应准备一个G10葡聚糖凝胶柱通过将1毫升枪头硅烷化玻璃棉，与G10的解决方案（在DDH 2 O 10％，高压灭菌）填补了一角。降速洗三次，用500μl双蒸2 O和50μL双蒸2 O。最后一个洗通过G10运行反应混合物（以除去游离的放射性标记物）。
- 凝胶净化（页20％）的放射性标记引物和应用的美眉恢复和浸泡法（ 即洗脱，用500μl含有1％氯酸锂与 1 mm净重3（pH值为8）在72℃的水溶液中15分钟）。乙醇沉淀和G10脱盐洗脱寡核苷酸。
- 引物延伸反应
- 退火1的放射性标记的引物P1皮摩尔，10pmol的引物P1和10的模板T1（材料清单）的10倍反应缓冲液（由所用的聚合酶的供应商提供）皮摩尔通过放置吨宇部在热的（90-95℃）水中，并通过允许逐步向下冷却到室温（超过45分钟）。
- 把该管在冰上，并加入（依次）的dNTP混合物（含有两个修饰和天然核苷三磷酸，100μM的最终浓度）和DNA聚合酶1 U（放空（ 外 - ），Klenow酶，PWO或9°N 米 ），并完全与水（20微升的总反应体积）。孵化在酶的最佳工作温度（当排气阀（ 外如 60℃下进行30分钟- ）被使用）。
- 加20μl的终止溶液（甲酰胺（70％），乙二胺四乙酸（EDTA，50毫摩尔），溴酚蓝（0.1％），二甲苯蓝（0.1％）），加热该样品（95℃，5分钟），冷却下（0℃），并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳解决。通过磷屏可视化。
- 末端转移酶聚合
- 稀7皮摩尔的单链，未标记的引物P2（材料清单），1皮摩尔放射性标记引物在1微升末端转移酶缓冲液10倍。
- 把该管在冰上，并加入（依次）的dNTP混合物（在适当的浓度由10至200微米）和末端转移酶聚合酶（4 U）。在37℃下1小时。加入10μl终止液，加热样品（95℃，5分钟），冷却（0℃），并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE 15％）解决。通过磷屏可视化。
4。 PCR改性核苷三磷酸
- 混合的同时向前8皮摩尔和反向引物与0.5皮摩尔待扩增的模板。加10倍反应缓冲液和dNTP混合物（为200μM的终浓度），并把该管置于冰上。加入DNA聚合酶1 U和完整的与H 2 O达到20微升的最终体积。转移混合物放入PCR小瓶中，并进行30个PCR循环。
- 稀释6微升含6微升2倍蔗糖加样缓冲液中，并通过琼脂糖解决2％（溴化乙锭染色）电泳。通过磷屏可视化。
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Representative Results
修饰的核苷三磷酸是诱人合成的目标，因为它们允许轻便引入官能团的浩大到核酸41。然而，这些激活的构建块的分离和鉴定往往显露是艰巨的。因此，本文所示的结果被认为是提供一个帮手追随于上述合成和生物化学方法（ 图1B）中的各个步骤。
特别地， 图3示出了修改后的dNTP的典型粗31 P-NMR谱（在此特定情况下，dU的BPU TP（4）18，图2），其中可以观察到的磷中心的特征信号（ 即一个双峰在-5.02（Pγ），一个双重峰在-10.44（Pα）和三重峰在-20.55（Pβ）ppm的）。此外，Signals词干为二磷酸（两个二重峰在-4.84和-10.63 ppm）的磷酸（单峰在-0.18 ppm的）副产物随着更高的磷酸盐（信号在-21.02和-23.19 ppm的）总是在此阶段观察到。粗制混合物的第一型RP-HPLC分析显示在图4（用于dU的BPU TP（4）），其中主峰（R T = 30.78分钟）对应于5'-三磷酸，而主要副产品，其5 ' -二磷酸，会显示一个略低的保留时间（R T = 30.03分钟）。最后，进行彻底的RP-HPLC纯化后，改性的dNTP需要通过NMR和MALDI-TOF（ 图5）。两个1 H-NMR和31 P-NMR谱可用于评估修饰的dNTP的纯度是至关重要的，因为不希望的二-和单-磷酸盐的存在赋予独特的信号。
建立核苷的纯度后，IDE模拟和评估任一质量或通过UV-光谱原液的浓度，修饰的dNTP可以用在引物延伸反应，以通过各种聚合酶，以评估其底物的接受能力， 图6示出的引物延伸反应的结果杜T P TP（2），DA HS TP（6），和DC 瓦尔 TP（7）使用，也可以作为孤独的修改（泳道5-7），作为两个修饰的dNTP（泳道8-10）的组合，或一起伴随着孤独的天然三磷酸（11道）。
最后， 图7示出了具有不同的改性的dUTP类似物的代表末端转移酶介导的聚合反应。在这种情况下，dU的C P TP（1）和dU的FP TP（3）是用于末端转移酶的最佳底物（泳道1和4）由于拖尾的效率相媲美甚至超过了天然的dTTP（泳道6）中。相反，dU的BPU TP（4）（泳道5）是一种相当差的基材在此上下文中，因为小的多分散性较长尺寸的寡核苷酸可被观察到。
图1。 A）路德维希-埃克斯坦方法为（基合成）修饰的核苷三磷酸39 B）所有需要为他们的应用，如SELEX使用前修饰的dNTP的合成和生化特性的步骤的示意图。 点击这里查看更大的图像 。
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图2。 dU的C P TP（1），杜T P TP（2），杜FP TP（3），杜BPU TP（4），杜家TP（5），18 DA HS TP（：修改后的三磷酸核苷的化学结构6），和DC 瓦尔TP（7）13。 点击这里查看大图 。
图3 31 P-NMR谱（121 0.4兆赫，D 2 O BPU的dU TP的粗反应混合物）（4） 点击此处查看大图 。
图4。粗dU的BPU TP RP-HPLC图谱（4）：在40分钟0-100％洗脱液B，流速：3.5毫升/分钟（洗脱液A：50 mM的TEAB在H 2 O，洗脱液B：50 mM的TEAB H中2 O / CH 3 CN（1/1））。 点击这里查看大图 。
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图5。 ; 18家）1 H-NMR谱（300兆赫，D 2 O，128扫描一 ）31 P-NMR谱（121.4兆赫，D 2 O，128扫描）： 修改后的核苷三磷酸dU的家 TP（5）表征 ）; C）MALDI-TOF谱点此查看大图 。
图6。 。与各种碱基修饰的dNTP类似物 1巷引物延伸反应代表凝胶图像（第15页％）：底漆;泳道2：自然的dNTP没有的dUTP;泳道3：天然的dNTP没有的dATP;泳道4：天然的dNTP无dCTP标记;泳道5：dU的<EM> T P TP（2）;泳道6：大HS TP（6）;泳道7：DC 瓦尔 TP（7）;泳道8：DA HS TP（6）和杜T P TP（2）;泳道9：DA HS TP（6）和直流瓦尔 TP（7）;泳道10：dU的T P TP（2）和直流缬氨酸 TP（7）;泳道11：dU的T P TP（2），DA HS TP（6），和DC 瓦尔 TP（7）;泳道12：天然的dNTP 点击这里查看大图 。
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Discussion
列入修改成核酸是利益的许多实际应用，包括反义和反基因药物的开发42,43，标签和寡核苷酸41的功能标记，并在努力扩大遗传字母44-46。化学改变和官能团通过应用标准和自动化固相合成用的协议，通常引入的核酸。然而，亚磷积木需要抵御由这种方法，这反过来又施加了严重的限制上的化学官能团47的性质所施加的相当苛刻的条件。相反，修饰的三磷酸核苷的酶介导的聚合允许引入一个更广泛的官能团的，因为唯一的限制是，它们充当聚合酶1,2衬底。即使有一个明显的不足之根口头适用的方法，可靠和稳定的合成和分析的方法已经开发了用于修饰的dNTP的合成。此外，由于其固有的性质，改性三磷酸是相当敏感的，以不同的外部条件（ 例如 pH，温度），因此，它们的合成和表征的详细协议是非常有益的。
本文中所呈现的工作流程包括化学合成改性的dNTPs，RP-HPLC纯化，NMR分析和酶分析这些核苷类似物的生化表征。对于改性的dNTPs的成功合成和表征的最关键的步骤是将粗产物的分析（通过NMR），深入型HPLC纯化，将纯化的材料进行分析，并选择一个合适的DNA（RNA）聚合酶。
对于修改后的dNTP的合成，我们采用了路德维希和埃克开发的方法斯坦39，由于副产物较少，相对于其他的程序，虽然在一个稍微长的合成路线为代价而形成。此外，RP-HPLC纯化一定表示整个合成路线的关键步骤，因为这将允许在核苷二磷酸（dNDPs）的分离，往往强烈抑制DNA和RNA聚合酶48。实现合成和纯化后，需要将所得的三磷酸的纯度都用NMR和MALDI-TOF进行评估，以确保没有聚合酶抑制二磷酸存在。
在图6所示的掺入实验清楚地强调了这种方法的有效性。事实上，所有在这个代表性的例子采用的一种dNTP透露是为DNA聚合酶良好底物（在这种特殊情况下通风口（ 外 - ）），因为没有更快的运行对应较小的碎片乐队可以观察到。贝斯集成开发环境中，酶可以忍耐两个基板贴着羧酸残基（DU T P TP（3）和DC 缬氨酸 TP（7））和两个dNTPs浓度结果在寡核苷酸轴承不少于39额外的负电荷的聚合。另一个显着特点是，从修饰的dNTP的掺入导致的乐队往往比自然控制显示较慢的电泳迁移率（ 如比较泳道11和12）。因此，引物延伸反应代表了强大而简单的方式来评估修饰的dNTP的衬底接受。
此外，在3'-末端的单链寡核苷酸的核苷三磷酸的末端转移酶介导的聚合反应是一个诱人的策略的高度官能核酸49-52的生成。在图7所示的有代表性的例子清楚地表明了程序选择素克由该CO 2 +依赖性末端转移酶53的耐受性的功能。事实上，杜C P TP（1）和杜FP TP（3），所搭载的蛋白质氨基酸L-脯氨酸和二肽的α-苯丙-脯， 分别是用于末端转移酶的最佳底物，并引起了拖尾是比较有利的，以未改性的dTTP控制的效率，甚至在浓度低至10μM（泳道1和4）。令人惊讶的是，模拟dU的T P TP（2）其中的脯氨酸残基被连接到连接臂在反式相比，游离羧酸，不如衬底作为其顺式对应物自多分散的较长尺寸的寡核苷酸在较高仅观察到dNTP的浓度（> 100μM，泳道2）。此外，磺胺修饰的dNTP 5是温和的底末端转移酶和可比杜
最后，使用修饰的类似物的PCR条件下的聚合反应中描述的方法是相当类似的涉及天然的dNTP。然而，改性的dNTP与这些条件下，聚合酶的相容性是至关重要的高密度functionali的生成捷思核酸7，尤其是考虑到他们在体外筛选实验。
综上所述，该方法修饰的核苷三磷酸的合成与表征强调和建立这样的协议将在新型类似物的开发和各具特色一定的帮助。伴随地，这样的新颖的dNTPs的出现将促进官能化的寡核苷酸的生成;特别地，催化核酸。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由瑞士国家科学基金（批准N°PZ00P2_126430 / 1和PZ00P2_144595）的支持。 C. Leumann教授深表感谢提供实验室场地和设备，以及对他的一贯支持。苏克内希特女士是公认的富有成果的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 |
|||
| 5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 |
|||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
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