Summary
げっ歯類モデルでLAD結紮により誘導される心筋梗塞を治療するためbiograftの移植は、従来、2つの心臓切開手術を必要としてきた。死亡率を減少させ、細胞に関連する、固体およびゼラチン状バイオマトリックスを固定するための最適な条件を提供するために、最小侵襲性処置が開発されてきた。
Abstract
心臓細胞療法は、細胞に関連生体材料の関心の高まりと注入が、心筋細胞送達を最適化するための大きな課題となって得ています。左前下動脈（LAD）結紮からなる心筋梗塞のげっ歯類モデル（MI）は、一般的に開胸を介して行われています。胸骨切開を介して第心臓切開手術は、伝統的に、治療の心外膜の用途のために行われている。 LAD結紮モデルの記述なので、手術後の死亡率は、しかし第二の手術が重要で推移している、百分の35から13まで低下した。術後の回復を改善し、痛みおよび感染を減少させるために、低侵襲性外科手術手順が提示される。二つの開胸術は、LAD結紮のための初期のものと治療心外膜投与のための第1を実施した。固体またはゲルタイプのマトリックスに関連した細胞からなるBiograftsは梗塞AR上に塗布し、EA。 2および6週後に行っ心エコー検査によって確認されるようにLAD結紮の心臓機能の喪失をもたらした。ゴールドナーは、心臓切片で実施トリクローム染色は、経壁瘢痕形成を確認した。第一及び第二の手術は少なく、その10％の術後死亡率をもたらした。
Introduction
19 世紀末以来、心血管疾患は、先進国でナンバーワンの連続殺人犯を推移している。これらの中でも、冠動脈疾患、メイン病因を表す。心筋梗塞（MI）および急性期の結果は次第に慢性期および重症心不全に向かって発達不適応リモデリングが続く。最近の重要な技術的および治療 の進歩にもかかわらず、原因心不全の進行に罹患率と死亡率は依然として1を拡大しています。この文脈において、細胞療法は、心不全に向かって疾患の進行を停止させると、心筋の最近同定再生能を刺激するために新たな治療選択肢としてますます関心を集めている。実験的及び臨床的研究は、さまざまな細胞型の心臓移植後に得られる有益な効果の説得力のある証拠を提供した。主なアウトカムは改善されたカーディを含め交流収縮機能は、左心室リモデリングを減少させ、梗塞サイズを減少し、梗塞領域内の血管密度を増加させた。しかし、細胞注入後の低細胞数の保持は重要な欠点が残った。細胞送達2の改善するバイオマトリックスによる細胞の協会は最近、研究者や臨床関心を育んできた。
左冠動脈前下行枝（LAD）の連結は、経壁心筋梗塞および成熟瘢痕をもたらす小動物モデルにおける心筋梗塞のための参照方法です。 MIの慢性期に適用される細胞治療は、第二外科的介入を必要とします。胸骨正中切開は、通常、細胞またはbiograftsの心外膜注入の心筋内注入を可能にするために行われる。このような侵襲性外科手術手順は、死亡率、術後回復時間、痛み、感染症のリスクを高める。ここで紹介する低侵襲性のアプローチは、このようなバイアスを防ぐだけでなく、Oを提供するだけでなく治療適用のための心臓のptimalアクセス可能。 MIとゲル状のバイオマトリックスに関連する細胞の心外膜注入は左肋間開胸術を経由して拍動している心臓上で実行されます。
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Protocol
注：ルイス雌雄ラット、200〜220グラムは、標準的な実験室条件（12時間の明暗周期、 自由摂取させ 、 水や食料、IVCケージ）の下で飼育した。すべての動物は、動物保護に関するFELASAとスイス法の勧告に準拠して処理した。
1。細胞の調製：骨髄から間葉系幹細胞の単離
- 5分間の誘導チャンバ内でイソフルラン5％とO 2を5L /分でラットを麻酔。麻酔システムに接続されたノーズコーンに動物の鼻を置きます。鎮静を確認するために、足指や尾のピンチを実行します。
- 腰に足首から皮膚をカットしてはさみで足から皮膚を取り除きます。筋肉を外し、動物失血のための大腿動脈を切った。股関節を公開し、大腿骨頭を脱臼。これは、大腿骨頭に損傷を与えないことが重要である。 50ミリリットルのプラスチックチューブに滅菌PBS中の骨を置きます。
- すべてのムーを削除それらを壊すことなく骨からsclesや靭帯。注：骨エタノールで洗浄溶液または汚染の連鎖を避けるために無傷のままであることが重要である。 5分間、70％エタノール中で剥離した骨を洗い流す。
- 無菌層流フードの下では、はさみで骨の両方の先端をカット。骨端から滅菌PBSを注入することにより、骨髄をフラッシュします。 15ミリリットルチューブに骨髄を収集します。 300×gで遠心し7分。
- 上清を取り除きます。赤血球溶解バッファー3mlにペレットを一時停止します。 300×gで7分間再びスピンする前に室温で1分間、懸濁液をインキュベートする。 150ミリリットルの培養フラスコ中で、無菌細胞培養培地（395ミリリットルIMDM培地を5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを100mlのFBS）を添加し、細胞を播種する。
- 非付着細胞を除去するために二日目の媒体に変更します。
- 所望の細胞量が得られるまで2〜3週間おきに毎日培地交換を行います。
- 代わりに、種子によってbiograftを準備必要に応じて他の場所3記載の固体マトリックス上に細胞をる。
- 心臓移植の日には、細胞を調製または単に心外膜適用前にbiograftを収穫。
- のAccutase細胞剥離液を用いて細胞を収集します。細胞を数える。所望の細胞量を得るために計算された細胞懸濁液の体積を1.5 mlの遠心チューブを埋める。 300×gで7分間遠心分離し、上澄みを除去します。
- あるいは、滅菌PBSですすぎ、細胞培養培地からbiograftを採取し、血清を含まない新鮮な培地中で維持する。
まず開胸とLAD結紮
- ラットを計量。 37℃で加熱パッドをオンにします。 5-7分間の誘導室中の5％イソフルランおよび5 L /分、100％O 2でラットを麻酔。鎮静を確認するために、足指や尾のピンチを実行します。加熱パッド上にラットを置きます。
- 14を動物に挿管G静脈カテーテル。 2.5リットル/分の酸素、2.5％イソフルラン、2ミリリットルの一回換気量、および90呼吸/分の呼吸頻度のためにプログラムさ齧歯類ベンチレータに挿管カテーテルを接続します。
- 0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィン溶液を調製する。液の皮下に三分の一を注入。胸部の左側の部分を剃る。 1％ベタジン溶液で消毒。
- 第四肋間で胸骨に垂直に皮膚を切開。胸の筋肉（大胸、胸を昇順、および外腹斜胸筋）の3層を分離。 （リブ4と5の間）第四肋間を開きます。
- 肋骨を広げるためにと心を露出させ、小さなリトラクターを使用してください。慎重に心膜を開きます。アトリウム以下の7.0縫合糸4ミリメートルで冠状動脈（LAD）を左前の位置を確認し、連結する。
- 3.0縫合を使用して2針で肋間スペースを閉じます。胸骨から近位および遠位に2本の縫合糸を配置します。まず、T遠位縫合糸をighten。胸を膨らませると、任意の気胸を避けるために、2秒間の人工呼吸器の排気チューブをクランプします。第2の縫合糸を締めます。 （無縫合は必要ありません）が所定の場所に戻り、筋肉層を配置します。 5.0縫合で皮膚を閉じます。
- 1％ベタジン溶液で縫合糸を駆除。ブプレノルフィン液の残りを注入します。麻酔システムの電源をオフにします。挿管カテーテルを取り外します。
- 1〜2時間、暖かいランプの下にケージにラットを保管してください。ケージの中に温度計を保持し、過熱を避けるために、温かいランプとケージとの間の距離を制御します。 IVCユニットにラットを返します。 48時間皮下ブプレノルフィン0.05〜0.1ミリグラム/ kgのポスト-operativelyごとに6〜12時間後に注入する。
第二に開胸処理によって3。心外膜の管理
- 繰り返します2.1から2.3を繰り返します。
- 第五肋間で胸骨に垂直に皮膚を切開。 3層を分離胸の筋肉（大胸、昇順胸筋と外腹斜胸筋）のsの。 （リブ5と6の間）第五肋間を開きます。
- 肋骨を広げるためにと心を露出させ、小さなリトラクターを使用してください。いくつかの付着がある場合は、慎重に細かい鉗子でそれらを削除します。
- 合字下の淡い領域として表示される梗塞領域の位置を確認します。注：必要に応じて、より良い左心室を可視化するために頂点に挿入された縫合糸の10cmのピース（7.0）を使用します。心臓を露出させクランプによって緩く維持縫合糸に慎重に引き抜いてください。
- 以下の処置のいずれかを適用します。
- 心臓の表面にbiograftを配置します。 10分間室温で予め温めプレフィルドフィブリンシーラント注射器を使用してください。 25 Gルアーの針を用いてbiograft下のフィブリンシーラントの低下（50〜100μl）を適用します。 biograftが完全に密封されていることを確認します。
- あるいは、表面oをでピペットの先端で収集した細胞ペレットを適用する合字下の淡い領域に心F。細胞ペレット上にフィブリンシーラントの低下（50〜100μl）を適用します。
- 頂点から縫合糸の部分を削除します。
- 繰り返します2.6から2.8を繰り返します。
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Representative Results
すべての動物は、開胸した後1時間以内に回復した。創傷治癒は急速であった。いいえ感染や浮腫が認められなかった。
左ダブル開胸、心臓（ 図1）への最適なアクセスを可能にした。痛みと手術後の死亡率は低かった。動物は、手術から素早く回収した（ 図2）体重が増えた。カプランメイヤー生存率は、最初開胸96％であった。 104以上の4匹のラット二開胸経由治療適用後24時間以内に死亡した。動物は第二開胸が、無治療（偽）を受けた100％、MSCのための96％およびフィブリンシーラントグループ、または動物がMSCを受けた86パーセントまで変化カプランメイア生存パーセントは直接心筋（ 図3）内に注入した。
Mモード心エコー評価は2週間LAD結紮44±3％から短縮率（FS）の減少を示した掲示を行っ22±4％である。方法（ 図4）の再現性の証拠を提供した104の動物2週間後のLAD結紮に記録されたFSの周波数表現。変動係数（CV）は17％であった。さらに、ポストLAD結紮2および6週目に行っ心エコー検査は、駆出率（EF）の減少および拡張期および収縮期におけるLV容積の増加（ 図4及び図5）によって提案された心不全に向かって進行を示した。偽手術群における経壁梗塞の開発は、心臓断面のゴールドナー染色（ 図6）によって確認した。
図1（A）のリトラクターを使用することは開胸後の心臓へのアクセスを許可。LAD結紮2週間前に行われた縫合糸が見える（矢印）である。心外膜の治療用途は、心臓の最小の具象化を行った。 （B）細胞がフィブリンシーラントで固定したペレットを、梗塞領域の表面に維持した。
図2毎日術後フォローアップは2日間手術後の体重減少を示した。回復は、すべての動物の体重の利得を伴った。体重の変動は、治療の種類とは無関係だった。
生存率ポストLAD結紮（A）を表す図3カプランメイアグラフを介して後処理第開胸術（B）は、両方の手術動物の低損失をもたらしたことを示した。対照群には手術を受けていない健康な動物を表す。二週間最初開胸した後、動物はフィブリンシーラントで固定した細胞、または細胞が直接（MSC注入）心筋内注射し、単独のフィブリンシーラント、偽手術が、無治療（偽）のいずれかを受けた。
図4（A）代表Mモード心エコー画像が登録前の（健康）と、2週間後、LAD結紮（梗塞）。短縮率値（B）の度数分布記録された2週間後、LAD結紮た（n = 104）。
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図5ハート機能が2dimentionalエコー検査（複葉機シンプソンの方法）によって評価し、2および6週間のポストLAD結紮を記録した。動物は、2つの開胸術を持っていたが、治療を受けなかった。平均±SDとしてだけでなく、個別の値は、駆出率収縮期（A）LV容積（B）および拡張期（C）のために表現されます。統計的分析はペアのノンパラメトリックWilcoxon検定を用いて行った。
2週間（A）および6週間後（B）のポストLAD結紮で線維性瘢痕（緑）、生存心筋（赤）を示す染色図6代表ゴールドナー。
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Discussion
LADの永久的な連結は、不可逆的な心筋障害を引き起こす。最初の動物モデルは、1960 4に記載した。以来、それは、慢性MIのための標準および適切なモデルとして考えられてきた。その安定性と再現性は、MI 5のための治療法の実験的評価を可能にした。最初の説明の後の改善の手順は、35から13までパーセント6の手術死亡率を報告した。
予想されるように、LAD結紮2週間以内に観察障害、心機能を誘発した。心臓機能のさらなる低下は6週間まで記録し、経壁線維性瘢痕と関連していた。また、左室拡張を含むLVリモデリングは明らかに6週間結紮を投稿観測された。
第一および第二の手術の間に2週間の間隔を選択した。彼らは1週間perforする後にあまりにも豊富であったように、この状態では、第二開胸は、癒着が存在しないことによって促進された最適な条件でのミリアンペア秒の手術。また、2週間の治療用途のための最適な時間枠を表現し、虚血により誘発される炎症の初期の写真を回避し、拡張の密な線維性組織および進行を形成する前処理を施すことができた。
開胸が小動物にLAD結紮のために今日では標準的な外科処置であるが、胸骨正中切開は、通常、細胞療法用途7に対して実行される。治療適用のための提示第二肋間開胸は、新規、低侵襲的なアプローチです。それは骨を切断することなくして、筋肉を分割することにより、リブを通して心臓へのアクセスを許可します。接着の発生を最初開胸以下の小型、限られた瘢痕に還元され、これらは、治療適用の達成を妨げない。アプローチは、出血のリスクが非常に低い、速い術後の結果回復、低い死亡率、痛み、感染の危険性。この第二の最小限の外傷性の手順は、手術のために、行列固定のため20分まで20分続いた。迅速な手続きと心臓最小限に心臓組織の乾燥の限られた暴露。術後の超音波イメージングは、再現可能な測定分析のための良質の画像取得をもたらした。イメージングを損なう恐れのある血腫はなかった。
心のアクセシビリティ梗塞心筋の最適な可視性だけでなく、固体、ゲルタイプのbiografts 8-10含む心外膜の治療の適用のための心臓の良好な露光を可能にした。
フィブリンシーラントの使用は、いくつかの利点を提示する。 （ⅰ）固形パッチを修正するには、フィブリンシーラントの使用は、縫合糸より少ない外傷性だった。そのようなBioglue（Cryolife）などの他の接着剤と比較すると（ii）のフィブリンシーラントは、剛性構造と損なわれた心を形成し、そのBioglueよりも準拠していた収縮。 （iii）は、その重合時間は、適切な足場または細胞ペレットの位置決めのために最適であった。 （ⅳ）フィブリンシーラントは、固体パッチの優れた初期接着性を可能にした。パッチはしっかりと少なくとも4週間10のための心臓の表面に維持した。心外膜細胞送達のための足場として使用され、固定された細胞は、外科的処置の終わりまで、梗塞領域の表面に維持したとき、（v）のフィブリンシーラントは、プロセスに簡単でした。細胞の保持時間は、この研究の焦点外であり、さらなる調査を要求するであろうが、それは、マトリックスが移植された細胞11〜14の改善された心筋の保持を可能にすることが提案されている。心臓収縮の間に細胞外に洗うだけでなく、低酸素や炎症性環境、部分的に急速なクリアランスを説明することができる。細胞がマトリックスに関連付けられている場合、これらの欠点を軽減することが可能性があります。
の外科的取り扱いを懸念主な技術的な課題固体biograft。マトリックスは、剛性かつ非柔軟性である場合には、縫合糸で固定が好まれるべきである。次の重要なステップは、成功した手順のために考慮されるべきである。第一に、特に注意が肋骨を壊し回避するために、開胸時に与えられるべきである。第二に、接着剤の過剰注意深く他の組織の付着を回避するために除去されるべきである。それは梗塞サイズの変動性を減少させることができるように最終的に、標準化された合字の位置決めが重要です。 LADは4ミリメートルのアトリウムの下に連結されるとき経壁梗塞を得ることができる。
結論として、二重の開胸実験計画の最適化と動物の損失数の減少に有利に働くでしょう、したがって、低死亡率、治療アプリケーションの鼓動する心臓への十分なアクセス権を持つ安全な外科手術を表現します。
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Acknowledgments
著者らは、研究の最初の部分のための財政支援のための教授ヘンドリックTevaearaiと心臓血管外科に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
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