Summary
àbiograft植入治疗心肌梗死的啮齿动物模型由法援署结扎诱发了常规需要两个开放式心脏手术。为了降低死亡率，并提供用于治疗与细胞相关的固体和胶状biomatrices固定最佳条件，微创手术已得到了发展。
Abstract
心脏细胞疗法已经获得了越来越多的关注与细胞相关的生物材料和植入已成为一个主要的问题，优化心肌细胞传递。心肌梗死的啮齿动物模型（MI）由左前降支（LAD）结扎已普遍被通过开胸进行的;在传统上一直进行用于治疗心外膜应用程序通过胸骨第二心脏直视手术。由于LAD结扎模型的描述，手术后的死亡率已经从35-13％下降，但第二次手术依然是至关重要的。为了改善手术后的恢复，减少疼痛和感染，微创手术过程给出。两个开胸被执行，初始一个用于LAD结扎，而第二个用于治疗心外膜给药。 Biografts包括与固体或凝胶型的矩阵相关联的单元的方式进行涂敷在梗塞芳EA。 LAD结扎导致心脏功能的丧失证实了2周，6周后进行超声心动图。 Goldner对心脏切片进行三色染色证实透瘢痕形成。第一和第二次手术产生了小于10％，术后死亡率。
Introduction
自19 世纪结束时，心血管疾病一直留在工业化国家的头号连环杀手。其中，冠状动脉疾病代表了主要病因。急性期会导致心肌梗死（MI），随后是不适应的重塑是逐步走向慢性期和严重的心脏衰竭的发展。尽管最近显著技术和治疗的进步，发病率和死亡率因心脏衰竭的进展仍在增长1。在这种情况下，细胞疗法已经获得了越来越多的关注作为一种新的治疗方案，以阻止疾病朝向心脏衰竭的恶化和刺激心肌的最近确定的再生能力。实验和临床研究已经提供的各种细胞类型的心脏移植后获得的有益效果令人信服的证据。主要成果包括改进CARDI交流收缩功能降低，左心室重塑，减少梗塞面积，并在梗死区血管密度增加。然而，细胞注射后低细胞数量保持仍然是一个重要的缺点。细胞与生物基质，以改善电池交付2协会最近促成研究者和临床利益。
左冠状动脉前降支（LAD）结扎是心肌梗死的小动物模型，导致透梗死和成熟的疤痕的参考方法。在心肌梗死慢性期应用细胞治疗还需要第二个手术干预。正中胸骨切开术通常执行，使心肌内注射细胞或biografts的心外膜植入。这种微创外科手术增加的死亡率，手术后的恢复时间，疼痛和感染的风险。这里介绍的微创手术方法不仅可以防止这样的偏见，但也提供了Ô心脏的治疗应用ptimal访问。心肌梗死和凝胶型生物基质相关的细胞外膜植入是通过左肋间开胸手术在跳动的心脏进行。
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Protocol
注：刘易斯雄性和雌性大鼠，200〜220克的安置标准实验室条件下（12小时光照和黑暗周期， 随意的水和食物，IVC笼）下。所有动物均符合FELASA和瑞士法律对动物保护的建议处理。
1，细胞的制备：从骨髓间充质干细胞分离
- 麻醉大鼠用异氟烷5％和O 2的5升/分钟的感应腔室5分钟。将动物的口鼻部到鼻锥相连的麻醉系统。执行脚趾或尾巴捏确认镇静。
- 通过切割皮肤从脚踝到臀部除去从腿部的皮肤用剪刀。取出肌肉，减少经股动脉动物放血。显露髋关节脱位和股骨头。不损坏股骨头是很重要的。把骨头无菌PBS在50毫升的塑料管。
- 移除所有亩scles和韧带从骨子里不破坏它们。注意：它是重要的骨保持完整，以避免冲洗溶液或污染，用乙醇联动。漂洗在70％乙醇中剥离骨头5分钟。
- 在无菌层流罩，切骨头用剪刀的两个技巧。冲洗骨髓从骨端注入无菌PBS中。骨髓采集到15毫升管。离心7分钟300×克。
- 除去上清液。暂停在3ml红细胞裂解缓冲液沉淀。再次纺丝在300×g下7分钟前孵育悬浮液在室温下放置1分钟。在150 ml培养瓶中，加入无菌细胞培养液（395毫升IMDM培养基中，加入5ml青霉素/链霉素100毫升FBS）和种子细胞。
- 改变介质的第二天，除去非粘附细胞。
- 直到获得所需的细胞量为2-3周进行中的变化，每隔一天。
- 另外，准备biograft种子根据需要和其它地方描述的3荷兰国际集团的细胞在固体基质中。
- 心脏移植的当天，制备细胞或刚心外膜应用之前收获biograft。
- 收集使用的Accutase细胞脱离液细胞。计数细胞。填1.5ml的离心管中以计算得到所需的细胞数量的细胞悬浮液的体积。离心机在300 XG 7分钟，除去上清液。
- 或者，收获来自细胞培养基的biograft，冲洗用无菌PBS中，并保持在新鲜培养基中无血清。
2，第一次开胸结扎LAD
- 称取鼠。打开加热垫在37℃。麻醉，用5％异氟醚和5升/分钟100％O 2的大鼠中的感应腔室为5-7分钟。执行脚趾或尾巴捏确认镇静。放置在加热垫的老鼠。
- 插管的动物有14ğ静脉导管。插管导管连接到编程为2.5升/分钟的氧气，2.5％异氟醚，2毫升潮气量，以及90次/分钟的呼吸频率啮齿动物呼吸机。
- 准备在0.1毫克/公斤丁丙诺啡的解决方案。注入皮下的溶液的三分之一。剃胸廓的左侧部分。消毒，用1％的聚维酮碘溶液。
- 切开皮肤垂直于胸骨在第四肋间。分出3层胸肌肉（胸大肌，胸升和腹外斜肌胸大肌）。打开第四肋间（肋4和5之间）。
- 用小拉钩传播肋骨和暴露的心脏。小心地打开心包。找到并结扎冠状动脉左前降支（LAD）与7.0缝线4毫米中庭下方。
- 使用3.0缝合两针封闭肋间。从胸骨近端和远端放置两个缝合。首先，Tighten远端缝合。用镊子将呼吸机的排气管2秒，以抬高胸部，避免气胸。收紧第二缝合。肌肉层放置回原位（不需要任何缝线）。关闭皮肤用5.0缝合。
- 消毒用1％的聚维酮碘溶液的缝合。注射丁丙诺啡溶液的剩余部分。关闭麻醉系统。移除插管导管。
- 请在笼子里的老鼠在一个温暖的灯为1-2小时。保持温度计在笼和控制，以避免过度加热的暖灯和轿厢之间的距离。返回在大鼠下腔静脉单元。注入皮下丁丙诺啡0.05-0.1毫克/公斤后-operatively每6-12小时48小时。
在通过治疗3。心外膜政府当局二次开胸
- 重复步骤2.1-2.3。
- 切开皮肤垂直于胸骨在第五肋间。分离出3层胸肌肉S（胸大肌，胸升和腹外斜肌胸大肌）。打开第五肋间（肋5与6之间）。
- 用小拉钩传播肋骨和暴露的心脏。如果有一些坚持，小心地用细镊子取出。
- 找到出现结扎下方的浅区的梗死面积。注：必要时，可使用10厘米长的缝合（7.0）的先端，以更好地可视化的左心室。轻轻拉至通过夹具松散地保持着，露出心脏的缝合。
- 应用下列治疗之一：
- 定位biograft在心脏表面。使用该预填充纤维蛋白封闭剂注射器预热，在室温下放置10分钟。通过将25g鲁尔针应用纤维蛋白胶的biograft下降（50-100微升）。验证biograft是完全密封的。
- 另外，申请用枪头收集细胞沉淀在表面ØF表示心脏上的绷带下面的苍白区。应用纤维蛋白胶的下降（50〜100μL）到细胞沉淀。
- 从顶点中取出一块缝合。
- 重复步骤2.6-2.8。
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Representative Results
开胸手术后1小时内的所有动物恢复。伤口愈合快。无感染或水肿观察。
双左侧开胸允许的心脏最优访问（ 图1）。疼痛和手术后的死亡率较低。动物从手术中恢复迅速和体重增加（ 图2）。卡普兰梅厄成活率为96％，为第一开胸手术。四只超过104 通过第二开胸手术24小时以下处理应用程序内死亡。卡普兰-梅尔存活百分比从当动物接受第二次开胸手术，但不接受任何治疗（假）和100％时，对MSC 96％蛋白胶基，或当动物接受MSC 86％变化的心肌（ 图3）内直接喷射。
M型超声心动图评价完成后2周LAD结扎显示，从44±3％，短轴缩短率（FS）减少至22±4％。记录在104动物后2周LAD结扎所提供的方法（ 图4）的可重复性的证据的FS的频率表示。变化（CV）的系数为17％。此外，超声心动图进行第2和第6周后结扎LAD呈恶化对心脏衰竭通过减少左室射血分数（EF）和舒张和收缩增加左室容积的建议（ 图4和图5）。 à透梗死假手术组的发展是由心脏截面Goldner染色（ 图6）确认。
图1（a）使用了下面的开胸，结扎LAD 允许牵引器访问的心脏为2周前完成和缝合线是可见的（箭头）。心外膜处理中的应用与心脏的最小外化表现。 （B）使细胞沉淀物固定用纤维蛋白封闭剂被维持在梗死区的表面上。
图2：每日术后随访显示体重减轻2天手术后。恢复伴随有重量的所有动物增益。体重的变化是独立处理的类型。
图3：采用Kaplan-梅厄图代表存活百分比后结扎LAD（A）和经后处理第二次开胸手术（二）表明，两种手术导致动物减少损失。对照组代表健康的动物，没有手术。第一次开胸手术后两个星期，动物分别接受假手术，但是不治疗（假），独自一人纤维蛋白胶，细胞固定用纤维蛋白胶，或细胞心肌内直接注射（MSC注射）。
图4（A）代表M型超声心动图图像预注册（健康）和2周后结扎LAD（心肌梗死），（B）频率的缩短分数值的分布记录了二周后结扎LAD（N = 104）。
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图5。心功能被2dimentional超声心动图（双平面Simpson法）进行评估并记录2和6周后结扎LAD。动物有两个开胸手术，但没有接受治疗。平均值±标准差以及个别值表示为射血分数（一 ）在收缩（B）左室容积和舒张（C）。统计分析采用配对非参数Wilcoxon秩检验。
图6。代表Goldner染色显示在第2周（A）和6周（B）后结扎LAD纤维化瘢痕（绿色）和存活心肌（红色）。
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Discussion
法援署的永久结扎造成不可逆的心肌损伤。第一个动物模型于1960年4被描述。从那时起，它已被认为是慢性心肌梗塞标准和合适的模型。其稳定性和重复性使治疗的实验评价心肌梗死5。继最初的描述改进程序报告了一个手术死亡率35-13％6。
正如预期的那样，LAD结扎诱导的2个星期内观察到受损的心脏功能。在心脏功能的进一步下降，记录长达6周，并与透纤维化瘢痕相关联。此外，左室重构，包括左心室扩张明显观察后6周结扎。
的第一和第二外科手术在2周的间隔被选择。在这种状态下，第二开胸用无adherences的便利，因为它们太丰富，1周后，以perfor马云第二次手术的最佳条件。此外，第2周为代表用于治疗应用的最佳时间帧，并使其避免炎症引起的局部缺血的早期图片和扩张的致密的纤维组织和进展的形成之前应用的治疗。
虽然侧开胸是时下标准的外科手术上的小动物结扎LAD，通常是进行细胞疗法的应用程序7中的正中。所提出的第二肋间开胸治疗的应用是一种新的，微创的方法;它允许通过肋条连接到心脏不切断骨骼与通过分割肌肉。粘附的发生被减少由于小而有限的瘢痕以下第一开胸和这些不与治疗应用的完成干扰。该方法导致的出血，快速术后非常低风险回收，低死亡率，疼痛和感染的风险。这第二个最小创伤的过程持续了20分钟的手术，长达20分钟的基质固定。快速程序和心脏最小化心肌组织干燥的风险敞口有限。术后超声成像造成的重复的测量分析，质量好，图像采集。目前还没有血肿，可能影响成像。
心脏的访问允许的心肌梗死的最佳可见度，以及对心脏的心外膜处理，包括固体和凝胶型biografts 8-10应用了良好的曝光。
使用纤维蛋白封闭剂的呈现若干优点。 （一）要解决固体补丁，使用纤维蛋白胶比缝合创伤小。 （二）当与其它胶如Bioglue（Cryolife）相比，纤维蛋白胶比Bioglue更兼容的形成刚性结构和受损心脏收缩。 （ⅲ）它的聚合反应时间是最佳的适当支架或细胞颗粒的定位。 （四）纤维蛋白胶允许固体贴片优良的初粘性。该补丁被紧紧保持心脏的表面上至少4周10。 （v）的纤维蛋白封闭剂是易于处理作为支架用于心外膜细胞递送用于固定细胞维持在梗死区的表面，直到在手术过程的结束时。虽然在细胞中的停留时间是从本研究的焦点和将要求进一步的研究，已经提出了矩阵允许植入的细胞11-14改善心肌保留。心脏的收缩，以及在缺氧和炎症环境中洗出的细胞，可以部分解释的快速清除。当细胞与基质相关的这些缺陷可能会减少。
有关的主要技术挑战的外科处理扎实biograft。如果基体是刚性的，nonflexible，固定缝合，应青睐。以下关键步骤应被视为成功的过程。首先，应特别注意开胸手术过程中给予，以避免破坏肋骨。第二，过量的胶应小心除去，以避免其他人组织中的粘附性。最后，标准化的结扎定位是很重要的，因为它可以减少梗死面积的变化。 à透梗死可以在LAD结扎4毫米中庭下方获得。
总之，双开胸代表一个安全的手术死亡率低，获得足够的跳动的心脏进行治疗的应用，因此将有利于实验的规划优化和动物的损失数量减少。
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Acknowledgments
作者感谢教授亨德里克Tevaearai心血管外科为研究的初始部分资金支持的部门。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
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