Summary
Имплантация biograft для лечения инфаркта миокарда, вызванную ЛАД перевязки в грызунах уже традиционно требуется два открытых операций на сердце. В целях снижения смертности и обеспечить оптимальные условия для фиксации твердых желатиновых biomatrices и связанных с клетками, минимально инвазивные процедуры были разработаны.
Abstract
Сердечная терапия клеток получил повышение заинтересованности и имплантации биоматериалов, связанных с клетками стало серьезной проблемой для оптимизации доставки клеток миокарда. Грызунов модель инфаркта миокарда (ИМ), состоящий из передней нисходящей артерии (LAD) перевязка имеет обычно были выполнены с помощью торакотомии; второй операции на открытом сердце с помощью стернотомию традиционно выполняется для эпикарда применения при лечении. Поскольку описание ЛАД лигирования модели, смертность после операции снизилась с 35-13%, однако вторая операция осталась критическая. В целях улучшения восстановления после операции и уменьшить боль и инфекции, малоинвазивные хирургические процедуры представлены. Два торакотомии проводились, первоначальный один для ЛАД перевязки, а второе для лечения эпикардиальной администрации. Biografts, состоящие из клеток, связанных с твердой или гелеобразной матрицы типа наносили на инфаркта АРеа. ЛАД перевязки привело к потере функции сердца, что подтверждается с помощью эхокардиографии, выполняемой через 2 и 6 недель. Голднер трихромом окрашивание выполняется на участках сердца подтвердили образование трансмурального рубца. Первый и второй операции в результате меньше, чем 10% послеоперационной смертности.
Introduction
С конца 19-го века, сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему номер один серийный убийца в промышленно развитых странах. Среди них, ишемическая болезнь сердца представляет собой основную этиологию. Острая фаза приводит к инфаркта миокарда (ИМ) и следуют неадекватные ремоделирования, что постепенно развивается в сторону хронической фазе и тяжелой сердечной недостаточности. Несмотря на недавние значительных технологических и терапевтических достижений, заболеваемость и смертность в связи с прогрессированием сердечной недостаточности по-прежнему растет 1. В этом контексте, клеточная терапия получила все больший интерес в качестве нового метода терапии, чтобы остановить прогрессирование болезни к сердечной недостаточности и стимулировать недавно идентифицированный регенеративные способности миокарда. Экспериментальные и клинические исследования предоставили убедительные доказательства благотворного влияния, полученных после трансплантации сердца в различных типах клеток. Основные исходы включали улучшенное CardiФункция переменного сократительная, снизился ремоделирования левого желудочка, уменьшается размер инфаркта, и повышение сосудистой плотности в зоне инфаркта. Тем не менее, сохранение низкого количества клеток после инъекции клеток остается важным недостатком. Ассоциация клеток с биоматрицы улучшения доставки клеток 2 недавно способствовали исследователь и клинические интересы.
Лигирование левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD) является эталонным методом для ИМ в небольшой животной модели, что приводит к трансмурального инфаркта и зрелого рубца. Сотовый терапии, примененной в хронической фазе инфаркта миокарда требует второго хирургического вмешательства. Средний стернотомия обычно выполняется, чтобы интрамиокардиальной инъекцию клеток или эпикардиальной имплантации biografts. Такие инвазивные хирургические процедуры увеличения смертности, послеоперационной время восстановления, боль и риск инфицирования. Малоинвазивная подход, представленный здесь не только предотвращает такую предвзятость, но и предоставляет оptimal доступность сердце, предназначенная для обработки. MI и эпикардиальная имплантация клеток, связанных с типа гель биоматрицы выполняются на работающем сердце с помощью левых межреберных торакотомии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Льюис самцов и самок крыс, 200-220 г были в стандартных лабораторных условиях (12 ч света и темноты, вволю воды и пищи, IVC клетка). Все животные были обработаны в соответствии с рекомендациями FELASA и швейцарского Закона о защите животных.
1 Приготовление клеток: мезенхимальных стволовых клеток Выделение из костного мозга
- Обезболить крыс с изофлуран и 5% O 2 5 л / мин в индукционной камере в течение 5 мин. Поместите морду животного на носовой обтекатель, подключенного к системе анестезии. Выполните ног или хвоста щепотку, чтобы подтвердить седации.
- Снимите кожу от ноги ножницами, сокращая кожу от лодыжки до бедра. Удалить мышцы и сократить бедренную артерию для животных обескровливания. Expose тазобедренный сустав и вывихнуть бедренной головой. Важно, чтобы не повредить бедренной головой. Поместите кости в стерильном PBS в 50 мл пластиковую пробирку.
- Удалите все муscles и связки от кости, не нарушая их. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, что кость остается неизменным, чтобы избежать увязки решения промывки или загрязнения с этанолом. Промыть очищенных костей в 70% этаноле в течение 5 мин.
- Под стерильной ламинаре, палка о двух кончики костей с ножницами. Промойте костный мозг, вводя стерильной PBS из костного конечности. Сбор мозга в 15 мл пробирку. Центрифуга 7 мин при 300 х г в.
- Удалить супернатант. Приостановить осадок в 3 мл Красная кровь буфера для лизиса клеток. Инкубируйте суспензию в течение 1 мин при комнатной температуре, прежде чем снова вращается в течение 7 минут при 300 х г в. В колбе для культивирования 150 мл, добавить стерильную клеточную культуральную среду (395 мл IMDM среднего, 5 мл ручка / стрептококковая, 100 мл FBS) и семян клетки.
- Изменение среднего второй день, чтобы удалить прилипших клеток.
- Выполнение средних изменений каждый второй день в течение 2-3 недель, пока не будет получен желаемый количество клеток.
- Кроме того, подготовить biograft семенамичисле клеток на твердой матрице по мере необходимости и описано в другом месте 3.
- День сердечной имплантации, подготовки клетки или урожай biograft перед эпикардиальной применения.
- Сбор клеток с использованием Accutase открепления клеток решение. Граф клеток. Наполните 1,5 мл центрифужную пробирку с объемом суспензии клеток рассчитанное так, чтобы получить требуемое количество клеток. Центрифуга в течение 7 минут при 300 мкг в и удалите супернатант.
- Кроме того, урожай biograft от клеточной культуральной среды, промыть в стерильной PBS, и держать в свежей культуральной средой без сыворотки.
2 первых Торакотомия и ЛАД Лигирование
- Взвесьте крысу. Включите грелку при 37 ° С. Обезболить крысу с 5% изофлуран и 5 л / мин 100% O 2 в индукционной камере 5-7 мин. Выполните ног или хвоста щепотку, чтобы подтвердить седации. Поместите крысу на грелку.
- Интубировать животное с 14G внутривенный катетер. Подключение интубации катетер к вентилятору, запрограммированного для грызунов 2,5 л / мин кислорода, 2,5% изофлуран, дыхательного объема 2 мл, и частота дыхания 90 вдохов / мин.
- Подготовьте бупренорфин решение в 0,1 мг / кг. Введите подкожно треть решения. Бритье левую часть грудной клетки. Лечить с 1% раствором Бетадин.
- Надрезать кожу перпендикулярно к грудине на четвертом межреберье. Отделите 3 слоев грудной мышцы (грудная, по возрастанию грудной и наружной косой грудной). Откройте четвертую межреберье (между ребрами 4 и 5).
- Используйте маленькую втягивающим распространяться ребра и подвергать сердце. Осторожно откройте перикарда. Найдите и перевязывать передней нисходящей коронарной артерии (LAD) с 7,0 шов 4 мм ниже атриуме.
- Закройте межреберье с двумя стежками с использованием 3,0 швов. Расположите два швы проксимально и дистально от грудины. Во-первых, тighten дистального шва. Зажмите выпускной трубы вентилятора для 2 сек для того, чтобы раздуть грудь и избежать пневмоторакс. Затяните вторую шва. Расположите слои мышц на место (не швы не нужны). Закройте кожу с 5,0 шва.
- Лечить шва с 1% раствором Бетадин. Введите остальную часть раствора бупренорфина. Выключите систему анестезии. Удалить интубации катетер.
- Держите крысу в клетке под теплым лампы в течение 1-2 часов. Хранить термометр в клетку и контролировать расстояние между лампой и теплой клетке, чтобы избежать перегрева. Вернуться крысу в блоке IVC. Введите подкожно бупренорфина 0,05-0,1 мг / кг Опубликовать -operatively каждый 6-12 ч в течение 48 ч.
3 эпикардиальной Администрация лечения через второй Торакотомия
- Повторите шаги 2.1-2.3.
- Надрезать кожу перпендикулярно к грудине в пятом межреберье. Отделите 3 слояс грудной мышцы (большой грудной мышцы, по возрастанию грудная и наружная косая грудной). Откройте пятом межреберье (между ребрами 5 и 6).
- Используйте маленькую втягивающим распространяться ребра и подвергать сердце. Если есть следование, тщательно удалить их с тонким пинцетом.
- Найдите площадь инфаркта, который появляется в виде бледно-области ниже лигатуры. ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте 10 см кусок шва (7,0), вставленный в вершине, чтобы лучше представить себе в левый желудочек. Аккуратно потяните к шву поддерживается слабо зажимом подвергать сердце.
- Применить один из следующих процедур:
- Расположите biograft на поверхности сердца. С помощью предварительно заполненный шприц фибринового герметика подогретую при комнатной температуре в течение 10 мин. Нанесите каплю (50-100 мкл) фибринового герметика под biograft с помощью иглы 25 G Luer. Убедитесь, что biograft является полностью герметичным.
- Кроме того, применяются осадок клеток, собранных с кончика пипетки на поверхности Ое сердце на бледно области ниже лигатуры. Нанесите каплю (50-100 мкл) фибринового герметика на осадку клеток.
- Извлеките часть шовного материала от вершины.
- Повторите шаги 2.6-2.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все животные восстанавливается в течение 1 часа после торакотомии. Заживление ран было быстрым. Не наблюдалось инфекция или отек.
Двойной левый торакотомия разрешено оптимальный доступ к сердцу (Рисунок 1). Боль и послеоперационной смертности был низким. Животное быстро оправились от операции и прибавил в весе (Рисунок 2). Каплан Меир выживание процентов было 96% в первый торакотомии. Четыре крысы более 104 умерли в течение следующего приложения обработки 24 ч через второй торакотомии. Каплан-Меир процентов выживаемости колебалась от 100%, когда животное получало второй торакотомия, но не лечения (обман), 96% для MSC и фибрина герметика группы, или 86%, если животное получало MSC впрыскивается непосредственно в миокарде (рисунок 3).
Оценка эхокардиографии в М-режиме выполняется 2 недели после ЛАД перевязки показали снижение фракции укорочения (FS) от 44 ± 3%до 22 ± 4%. Представление частота FS, записанных на 104 животных 2 недели после ЛАД лигирования предусмотренных доказательства повторяемости метода (Рисунок 4). Коэффициент вариации (CV) составила 17%. Кроме того, эхокардиография выполняется в 2 и 6 недель после ЛАД перевязки показал прогрессия к сердечной недостаточности, предложенной к уменьшению фракции выброса (ФВ) и увеличением объемов ЛЖ в диастолы и систолы (рисунки 4 и 5). Развитие трансмурального инфаркта в группе ложнооперированных было подтверждено окрашиванием Goldner поперечных сечений сердца (рисунок 6).
Рисунок 1 (А) Использование втягивающего разрешается доступ к сердцу следующей торакотомия. ЛАД перевязки проводили на 2 недели раньшеи шов виден (стрелка). Эпикарда приложение Обработку проводили с минимальным экстериоризацию сердца. (Б) Клетки фиксировали на пеллетах фибринового герметика поддерживали на поверхности области инфаркта.
Рисунок 2 Daily послеоперационный период наблюдения показал потерю веса в течение 2 дней после операции. Восстановление сопровождалось усилением веса у всех животных. Изменения веса не зависели от типа обработки.
Рисунок 3 Каплан-Меир график, представляющий процентов сообщение выживание ЛАД перевязка (А) и после лечения с помощью Второй торакотомия (B) показали, что оба операции привело к снижению потери животных. Контрольная группа представляет здоровое животное, что не имел хирургию. Через две недели после первого торакотомии, животные получали либо имитации операции, но не лечения (обман), фибринового герметика один, клетки фиксированные с фибринового герметика, или клетки, непосредственно вводится в миокард (MSC вводили).
Фигура 4 (А) представитель M-режим эхокардиография изображения, зарегистрированные до (здоровый) и 2 недели после ЛАД перевязка (инфаркту). Распределение (B) Частота дробных значений укорочение записаны две недели после ЛАД перевязка (п = 104).
390fig5highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок функция 5 Сердце оценивали по 2dimentional эхокардиографии (метод биплан Симпсона) и записал 2 и 6 недель после ЛАД перевязки. Животное было два торакотомии, но не получил никакого лечения. Среднее ± SD, а также отдельные значения представлены для фракции выброса (A) объемом ЛЖ в систолу (B) и диастолы (С). Статистический анализ проводился с использованием парного непараметрического критерия Вилкоксона.
Рисунок 6 Представитель Голднер окрашивания показывая фиброзный рубец (зеленый) и жизнеспособного миокарда (красный) на 2 недели (А) и 6 недель (B) сообщение ЛАД лигирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Постоянный перевязка ЛАД вызывает необратимые повреждения миокарда. Первая модель животное было описано в 1960 году 4. С тех пор она была рассмотрена в качестве стандартного и подходящей модели для хронического ИМ. Его стабильность и воспроизводимость разрешено экспериментальная оценка терапии ИМ 5. Усовершенствованные процедуры следующие исходного описания сообщили оперативную смертность 35-13% 6.
Как и ожидалось, ЛАД сшивка улучшает нарушенную функцию сердца наблюдается в течение 2 недель. Дальнейшее снижение функции сердца был записан до 6 недель и связаны с трансмурального фиброзной шрам. Кроме того, модернизация LV включая дилатации ЛЖ отчетливо наблюдалась 6 недель после перевязки.
Интервал 2 недель между первой и второй операции был выбран. В этом состоянии, второй торакотомия способствовало отсутствие спаек, так как они были слишком обильные после 1 недели до Перформа вторая операция в оптимальных условиях. Кроме того, за 2 недели представлены оптимальный период времени для применения лечения и позволило избежать ранний рис воспаления, вызванного ишемией и применить обработку перед образованием плотной фиброзной ткани и прогрессирование дилатации.
Хотя задняя торакотомия является современным стандартом хирургическая процедура для ЛАД перевязки на мелких животных, средний стернотомия обычно выполняется для применения клеточной терапии 7. Представленная второй межреберная торакотомия, предназначенная для обработки является новым, малоинвазивная подход; это позволяет получить доступ к сердцу через ребра без резки кости и, разделив мышцы. Возникновение присоединения уменьшается за счет малого и ограниченного рубца следующие первого торакотомии, и они не мешают выполнения приложения обработки. Подход привел к очень низким риском кровотечения, быстрый послеоперационныйвосстановление, низкая смертность, боль, и риск инфицирования. Этот второй минимально травматические процедура длилась 20 мин к операции, и до 20 мин для фиксации матрицы. Быстрая процедура и ограниченное воздействие на сердца к минимуму ткани сушки сердечной. Послеоперационный ультразвуковое привело в хорошем приобретения качество изображения для анализа воспроизводимые измерения. Там не было гематомы, которые могли бы ухудшить изображений.
Доступность сердце разрешено оптимальную видимость инфаркта миокарда, а также хорошую экспозицию сердца для применения эпикардиальных процедур, включая твердых и гелевых biografts типа 8-10.
Использование фибринового герметика представлены несколько преимуществ. (I) Чтобы устранить твердые участки, использование фибринового герметика было менее травмирующим, чем швов. (II) по сравнению с другими клей, такой как Bioglue (Cryolife), фибринового герметика было больше, чем соответствует Bioglue, что формируется жесткую конструкцию и нарушение сердцесхватки. (III) Его время полимеризации был оптимальным для адекватного эшафот или осадок клеток позиционирования. (IV) фибрина герметик разрешено отличную начальную адгезию твердых патч. Пластырь плотно поддерживается на поверхности сердца, по крайней мере, 4 недель 10. (V) фибриновый уплотнитель было легко процесса при использовании в качестве каркаса для доставки клеток эпикарда и фиксированные клетки не были сохранены в поверхности зоны инфаркта до конца хирургической процедуры. Хотя время удерживания клеток был в фокусе этого исследования и потребует дальнейших исследований, было предложено, что матрица дает улучшенную миокарда сохранение имплантированных клеток 11-14. Промыть клеток в течение сердечного сокращения, а также в гипоксических и воспалительной среде, можно частично объяснить быстрый клиренс. Эти недостатки могут быть уменьшены, когда клетки, связанные с матрицей.
Основные технические проблемы касался хирургического обработкутвердый biograft. Если матрица является жесткой и негибкой, фиксация швами следует отдавать предпочтение. Следующие важные шаги должны быть рассмотрены для успешной процедуры. Во-первых, особое внимание следует уделять во время торакотомии, чтобы избежать нарушения ребра. Во-вторых, избыток клея должны быть тщательно удалены, чтобы избежать прилипания других тканей. И, наконец, это стандартизированный лигатуру позиционирования важно, так как это может уменьшить вариабельность размера инфаркта. Трансмуральный инфаркт можно получить, когда ЛАД лигируется 4 мм ниже предсердия.
В заключение, дважды торакотомия представлены безопасную хирургическую процедуру с низкой смертностью, адекватного доступа к бьющегося сердца для применения лечения, и, следовательно, будет способствовать оптимизации планирования эксперимента и уменьшенное количество потери животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят проф Хендрик Tevaearai и Департамент сердечно-сосудистой хирургии для финансовой поддержки начальной части исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
- Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
- Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
- Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
- Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
- Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
- Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
- Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
- Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
- Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
- Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
- Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).
