Summary
Implantação de um biograft para tratar infarto do miocárdio induzido por ligadura LAD em um modelo de roedor tem convencionalmente necessárias duas cirurgias de coração aberto. A fim de reduzir a mortalidade e proporcionar as condições óptimas para a fixação de Biomatrizes sólidos gelatinosos e associados a células, procedimentos minimamente invasivos têm sido desenvolvidos.
Abstract
Terapia celular cardíaca tem ganhado interesse crescente e implante de biomateriais associados com as células se tornou uma questão importante para otimizar a entrega de células do miocárdio. Roedor modelo de infarto do miocárdio (IM), que consiste de Esquerda artéria descendente anterior (LAD) ligadura tem sido comumente realizada através de uma toracotomia; uma segunda cirurgia de coração aberto através de uma esternotomia tem sido tradicionalmente realizada para a aplicação do epicárdio do tratamento. Desde a descrição do modelo de ligadura LAD, a taxa de mortalidade pós-operatória diminuiu 35-13%, porém a segunda cirurgia manteve-se crítico. A fim de melhorar a recuperação pós-cirurgia e reduzir a dor e infecção, procedimentos cirúrgicos minimamente invasivos são apresentados. Dois toracotomia foram realizadas, a inicial para LAD ligadura e o segundo tratamento a administração de epicárdico. Bioenxertos consistindo de células associadas com matrizes de tipo sólido ou de gel foram aplicados na AR enfartadaea. LAD ligação resultou em perda da função cardíaca, como confirmado por ecocardiografia realizada após 2 e 6 semanas. Goldner tricrômico coloração realizada em secções coração confirmou a formação de cicatriz transmural. Cirurgias primeiro e segundo resultou em menos que 10% de mortalidade pós-operatória.
Introduction
Desde o final do século 19, a doença cardiovascular continua a ser o número um assassino em série nos países industrializados. Entre eles, a doença arterial coronária representa a etiologia principal. Os resultados de fase aguda no infarto do miocárdio (MI) e é seguido por remodelação mal-adaptativo que se desenvolve progressivamente em direção a uma fase crônica e insuficiência cardíaca grave. Apesar dos recentes avanços tecnológicos e terapêuticos significativos, a morbidade ea mortalidade devido à progressão da insuficiência cardíaca ainda está crescendo 1. Neste contexto, a terapia celular tem ganhado cada vez mais interesse como uma nova opção terapêutica para parar a progressão da doença para a insuficiência cardíaca e para estimular a capacidade regenerativa recentemente identificado do miocárdio. Estudos experimentais e clínicos têm fornecido muitas evidências dos efeitos benéficos obtidos após o transplante cardíaco de vários tipos de células. Entre os principais resultados incluíram melhoria cardifunção contrátil ac, diminuição do remodelamento ventricular esquerdo, redução do tamanho do infarto, e aumento da densidade vascular na área infartada. No entanto, a baixa retenção número de células após a injeção de células manteve-se uma desvantagem importante. Associação de células com um biomatriz para melhorar de entrega célula 2, recentemente promovido pesquisador e interesses clínicos.
Ligadura da artéria descendente anterior da artéria coronária (LAD) é um método de referência para MI em modelo animal de pequeno porte que resulta em infarto transmural e uma cicatriz madura. A terapia celular aplicada na fase crônica da MI requer uma segunda intervenção cirúrgica. A esternotomia mediana geralmente é realizada para permitir a injeção intramiocárdica das células ou a implantação do epicárdio de bioenxertos. Tais procedimentos cirúrgicos invasivos, aumentar a taxa de mortalidade, pós-cirurgia de tempo de recuperação, a dor, e o risco de infecção. A abordagem minimamente invasiva aqui apresentada não só evita esse viés, mas também fornece oacessibilidade ptimal do coração para a aplicação dos tratamentos. MI e implantação do epicárdio de células associadas com uma biomatriz tipo gel são realizadas com o coração batendo através de toracotomia intercostal esquerdo.
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Protocol
NOTA: Lewis ratos machos e fêmeas, de 200-220 g foram alojados em condições padrão de laboratório (12 horas de luz e de ciclo de escuro, de água ad libitum e alimentares, IVC gaiola). Todos os animais foram tratados de acordo com as recomendações do FELASA ea Lei Suíça sobre a protecção animal.
1. celular Preparação: Isolamento de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea
- Anestesiar os ratos com isoflurano a 5% de O 2 e 5 L / min, numa câmara de indução por 5 min. Coloque focinho do animal, para um cone de nariz ligada ao sistema de anestesia. Realize um dedo do pé ou cauda pitada de confirmar sedação.
- Retirar a pele da perna com uma tesoura de corte da pele do tornozelo para o quadril. Retirar os músculos e corte da artéria femoral para a exsanguinação animal. Expor a articulação do quadril e deslocar a cabeça do fêmur. É importante para não danificar a cabeça do fêmur. Colocar os ossos em PBS estéril num tubo de plástico de 50 ml.
- Remova todas as muscles e ligamentos dos ossos sem quebrá-los. NOTA: É importante que o osso permanece intacto para evitar ligação de solução de lavagem ou de contaminação com etanol. Lave os ossos pelados em etanol 70% por 5 min.
- Sob a estéril câmara de fluxo laminar, cortar ambas as pontas dos ossos com uma tesoura. Lave a medula óssea através da injeção de PBS estéril a partir da extremidade do osso. Recolha de medula para um tubo de 15 ml. Centrífuga 7 min a 300 x g.
- Remover o sobrenadante. Suspender o sedimento em 3 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão durante 1 min à temperatura ambiente antes de girar de novo durante 7 minutos a 300 x g. Em um frasco de cultura de 150 ml, estéril adicionar meio de cultura celular (395 ml de meio IMDM, 5 ml de pen / strep, 100 ml de FBS) e propagar as células.
- Alterar o segundo meio dia para remover células não aderentes.
- Realizar as mudanças de meio a cada segundo dia, durante 2-3 semanas, até que a quantidade de célula desejado é obtido.
- Em alternativa, preparar o biograft por sementesção das células para a matriz sólida, como descrito noutro local necessário e 3.
- O dia da implantação cardíaca, preparar as células ou colher o biograft imediatamente antes da aplicação do epicárdio.
- Coletar as células usando solução desprendimento de células Accutase. Contar as células. Encher um tubo de centrífuga de 1,5 ml, com o volume de suspensão de células para obter uma quantidade calculada de célula desejado. Centrifuga-se durante 7 minutos a 300 xg e remover o sobrenadante.
- Alternativamente, a colheita biograft de meio de cultura celular, enxaguar em PBS estéril, e manter em meio de cultura fresco sem soro.
2. Primeiro toracotomia e LAD Ligadura
- Pesa-se o rato. Ligue o bloco de aquecimento a 37 ° C. Anestesiar ratos com 5% de isoflurano e 5 L / min de 100% de O 2 em uma câmara de indução para 5-7 min. Realize um dedo do pé ou cauda pitada de confirmar sedação. Coloque o rato sobre a almofada de aquecimento.
- Entubar o animal com um 14L iv cateter. Conectar o cateter intubação a um ventilador roedor programado para 2,5 L / min de oxigênio, 2,5% de isoflurano, o volume corrente de 2 ml, e uma freqüência respiratória de 90 ciclos / min.
- Prepara-se uma solução de buprenorfina a 0,1 mg / kg. Injectar subcutaneamente um terço da solução. Raspar a parte esquerda do tórax. Desinfectar com uma solução de Betadine 1%.
- Incisar a pele perpendicular ao esterno no quarto espaço intercostal. Separe as três camadas de músculo torácico (peitoral maior, peitoral ascendente e peitoral oblíquo externo). Abra o quarto espaço intercostal (entre as costelas 4 e 5).
- Use um pequeno afastador para espalhar as costelas e para expor o coração. Abra o pericárdio com cuidado. Localize e ligadura da artéria descendente anterior coronariana (LAD), com 7,0 sutura 4 milímetros abaixo do átrio.
- Feche o espaço intercostal, com dois pontos com 3,0 suturas. Posicione as duas suturas proximal e distal do esterno. Em primeiro lugar, tighten sutura distal. Prenda o tubo de escape ventilador para 2 segundos, a fim de inflar o peito e evitar pneumotórax. Aperte a segunda sutura. Posicione as camadas de músculos de volta no lugar (sem suturas são necessários). Fechar a pele com uma sutura 5.0.
- Desinfetar a sutura com solução Betadine 1%. Injectar o resto da solução de buprenorfina. Desligue o sistema de anestesia. Remover cateter intubação.
- Mantenha o rato na gaiola sob uma lâmpada quente por 1-2 horas. Manter um termómetro na gaiola e controlar a distância entre a lâmpada e o compartimento quente, a fim de evitar um excesso de aquecimento. Retorne o rato na unidade IVC. Injetar por via subcutânea Buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg pós -operatively cada 6-12 horas para 48 horas.
3. Epicárdica Administração da Via Tratamento Segunda toracotomia
- Repita os passos de 2,1-2,3.
- Incisar a pele perpendicular ao esterno no quinto espaço intercostal. Separar a fase 3s do músculo torácico (peitoral maior, peitoral ascendente e peitoral oblíquo externo). Abra o quinto espaço intercostal (entre as costelas 5 e 6).
- Use um pequeno afastador para espalhar as costelas e para expor o coração. Se há alguma adesão, retire-os cuidadosamente com uma pinça fina.
- Localize a área do infarto que aparece como uma área clara abaixo da ligadura. NOTA: Se necessário, use um pedaço de 10 cm de sutura (7,0) inserido no ápice para melhor visualizar o ventrículo esquerdo. Puxe delicadamente à sutura mantida frouxamente por uma braçadeira para expor o coração.
- Aplique um dos seguintes tratamentos:
- Posicionar o biograft na superfície do coração. Utilizar a seringa pré-cheia de selante de fibrina previamente aquecida à temperatura ambiente durante 10 min. Aplique uma gota (50-100 L) de selante de fibrina sob a biograft usando uma agulha 25 G Luer. Verifique se o biograft está perfeitamente selado.
- Alternativamente, aplicam-se o sedimento de células recolhidas com uma pipeta de ponta na superfície of o coração na área abaixo da ligadura pálido. Aplicar uma gota (50-100 ul) de selante de fibrina sobre o sedimento celular.
- Remover o pedaço de fio de sutura a partir do vértice.
- Repita os passos de 2,6-2,8.
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Representative Results
Todos os animais recuperados dentro de 1 hora após toracotomias. A cicatrização foi rápida. Não se observou qualquer edema ou infecção.
A toracotomia esquerda dobro permitido o acesso ideal para o coração (Figura 1). Dor e mortalidade pós-operatória foi baixa. O animal recuperou-se rapidamente a partir da cirurgia e ganho de peso (Figura 2). A percentagem de sobrevivência de Kaplan Meir foi de 96% para o primeiro toracotomia. Quatro ratos mais de 104 morreram na sequência da aplicação de tratamento de 24 horas por meio de uma segunda toracotomia. Kaplan-Meir variada a percentagem de sobrevivência de 100% em que os animais receberam uma segunda toracotomia mas nenhum tratamento (Sham), 96% para o MSC e fibrina grupo selante, ou 86% em que os animais receberam MSC injectado directamente dentro do miocárdio (Figura 3).
Avaliação ecocardiográfica M-mode realizados 2 semanas após a ligadura LAD mostrou uma redução na fração de encurtamento (FS) de 44 ± 3%a 22 ± 4%. A representação freqüência dos FS gravadas em 104 animais duas semanas pós LAD ligadura fornecidas provas da repetibilidade do método (Figura 4). O coeficiente de variação (CV) foi de 17%. Além disso, o ecocardiograma realizado em 2 e 6 semanas após LAD ligadura mostrou uma progressão para insuficiência cardíaca sugerida por uma redução da fração de ejeção (EF) e um aumento dos volumes do VE em diástole e sístole (Figuras 4 e 5). O desenvolvimento de um enfarte transmural do grupo operado simulada foi confirmada por coloração de Goldner secções transversais do coração (Figura 6).
A Figura 1 (A) A utilização de afastador permitido o acesso ao coração após toracotomia. LAD ligação foi realizada 2 semanas mais cedoe sutura é visível (seta). A aplicação dos tratamentos do epicárdio foi realizada com exteriorização mínimo do coração. (B) As células pelete fixo com selante de fibrina foram mantidas na superfície da área de enfarte.
Figura 2 Diário seguimento pós-operatório apresentaram perda de peso por 2 dias pós-cirurgia. Recuperação foi acompanhada de ganho de peso em todos os animais. Variações de peso foram independentes do tipo de tratamento.
Figura 3 Kaplan-Meir ligadura gráfico representando por cento pós sobrevivência LAD (A) e após o tratamento por meio de um segunda toracotomia (B) mostrou que ambas as cirurgias resultaram em perda reduzida de animais. Grupo controle representa animal saudável que não tinha cirurgia. Duas semanas após a primeira toracotomia, os animais receberam uma operação simulada, mas nenhum tratamento (sham), Fibrina sozinho, as células fixas com selante de fibrina, ou células injectadas directamente dentro do miocárdio (MSC injectado).
Figura 4 (A) Representante do modo-M imagens de ecocardiografia pré registrado (saudável) e 2 semanas após ligadura LAD (enfartado). Distribuição (B) Freqüência dos valores de fração de encurtamento gravou duas semanas após ligadura LAD (n = 104).
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Figura 5 função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia 2dimentional (método de Simpson biplano) e gravou 2 e 6 semanas após ligadura LAD. Animal tinha duas toracotomias, mas não receberam nenhum tratamento. Média ± DP, bem como os valores individuais são representados por fração de ejeção (A) volume do VE em sístole (B) e diástole (C). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste não paramétrico de Wilcoxon pareado.
Figura 6 Representante Goldner coloração mostrando cicatriz fibrótica (verde) e miocárdio viável (vermelho) em 2 semanas (A) e seis semanas (B) pós LAD ligadura.
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Discussion
A ligadura permanente da LAD causa lesão miocárdica irreversível. O primeiro modelo animal foi descrito em 1960 4. Desde então, tem sido considerado como um modelo padrão e adequado para MI crónica. Sua estabilidade e reprodutibilidade permitiu a avaliação experimental de terapias para MI 5. Procedimentos melhorou após a descrição inicial relatou uma taxa de mortalidade operatória de 35-13% 6.
Como esperado, a ligadura LAD induzida função cardíaca comprometida observada no espaço de 2 semanas. Uma nova diminuição da função cardíaca foi registrada até 6 semanas e associado a cicatriz fibrosa transmural. Além disso, a remodelação do VE, incluindo a dilatação do VE foi claramente observada 6 semanas após a ligadura.
Um intervalo de 2 semanas entre o primeiro e segundo cirurgia foi escolhido. Nesta condição, a segunda toracotomia foi facilitada pela ausência de aderências, como eles eram muito abundantes depois de 1 semana para perforsegunda cirurgia ma em ótimas condições. Além disso, duas semanas representado um período de tempo óptimo para a aplicação de tratamento e deixou-se evitar o pic início da inflamação induzida pela isquemia e para aplicar o tratamento, antes da formação de um tecido fibroso denso e progressão da dilatação.
Apesar de toracotomia lateral é hoje em dia o procedimento cirúrgico padrão para LAD ligadura de pequenos animais, uma esternotomia mediana é geralmente realizada para aplicação terapêutica de células 7. O segundo apresentou toracotomia intercostal para a aplicação dos tratamentos é um romance, a abordagem minimamente invasiva; que permite o acesso ao coração através das costelas sem osso corte e dividindo o músculo. A ocorrência de aderência é reduzida devido ao pequeno e limitado cicatriz após a primeira toracotomia e estes não interferem com a realização da aplicação dos tratamentos. A abordagem resultou em risco muito baixo de hemorragia pós-operatória rápidarecuperação, baixa mortalidade, dor, e o risco de infecção. Este segundo procedimento minimamente traumática durou 20 min durante a cirurgia e até 20 minutos para a fixação da matriz. O procedimento rápido e exposição limitada do coração minimizada secagem do tecido cardíaco. Ultra-sonografia pós-operatório resultou em boa aquisição de imagem de qualidade para análise de medições reproduzíveis. Não houve hematomas que poderiam prejudicar a imagem.
A acessibilidade do coração permitiu melhor visibilidade do miocárdio enfartado, bem como uma boa exposição do coração para a aplicação dos tratamentos do epicárdio incluindo bioenxertos tipo sólido e gel 8-10.
A utilização de selante de fibrina apresentada várias vantagens. (I) Para corrigir manchas sólidas, a utilização de selante de fibrina é menos traumático do que as suturas. (Ii) quando comparado com outros cola como Bioglue (Cryolife), selante de fibrina era mais complacente do que Bioglue que formou estrutura rígida e coração prejudicadacontrações. (Iii) O tempo de polimerização foi ótima para andaime adequado ou posicionamento pellet celular. (Iv) O selante de fibrina autorizados excelente aderência inicial de correção sólido. O adesivo foi mantida firmemente sobre a superfície do coração durante pelo menos 4 semanas 10. (V) O selante de fibrina era fácil de processo, quando utilizado como uma estrutura de suporte para a entrega de células do epicárdio e células fixadas foram mantidas a superfície da área de enfarte, até ao fim do procedimento cirúrgico. Embora o tempo de retenção das células era de foco deste estudo e exigiria mais investigações, foi proposto que a matriz permite uma melhor retenção do miocárdio de 11-14 células implantadas. Lave para fora das células durante a contração cardíaca, bem como a hipoxia e ambiente inflamatório, pode explicar em parte a rápida liberação. Estes inconvenientes poderiam ser reduzida quando as células são associados com uma matriz.
Os principais desafios técnicos em causa o tratamento cirúrgico dabiograft um sólido. Se a matriz é rígido e não flexível, fixação com suturas devem ser favorecidas. Os seguintes passos críticos devem ser considerados para o procedimento bem-sucedido. Em primeiro lugar, deve ser dada uma atenção especial durante a toracotomia para evitar quebrar as costelas. Em segundo lugar, o excesso de cola deve ser cuidadosamente removida para evitar a aderência de outros tecidos. Finalmente, uma ligadura de posicionamento normalizada é importante, uma vez que podem reduzir a variabilidade na dimensão do enfarte. Um enfarte transmural pode ser obtida quando é ligado LAD quatro milímetros abaixo do átrio.
Em conclusão, o dobro toracotomia representou um procedimento cirúrgico seguro, com baixa mortalidade, o acesso adequado ao coração batendo para a aplicação dos tratamentos, e, portanto, vai favorecer a otimização do planejamento experimental e número reduzido de perda de animal.
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Acknowledgments
Os autores agradecem ao Prof Hendrik Tevaearai e do Departamento de Cirurgia Cardiovascular de apoio financeiro para a parte inicial do estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
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