Summary
Implantatie van een biograft myocardiaal infarct geïnduceerd door LAD ligatie in een knaagdier model behandelen conventioneel vereist twee open-hartoperaties. Om terug te dringen en de optimale omstandigheden voor fixatie van vaste en gelatineachtige biomatrices geassocieerd met cellen, hebben minimaal invasieve procedures ontwikkeld.
Abstract
Cardiale celtherapie heeft opgedaan toenemende belangstelling en de implantatie van biomaterialen in verband met cellen is uitgegroeid tot een groot probleem om myocardcel levering te optimaliseren. Knaagdier model van een myocardinfarct (MI), bestaande uit LAD (LAD) ligatie is meestal uitgevoerd via een thoracotomie; een tweede open-hart operatie via een sternotomie is van oudsher uitgevoerd voor epicardial toepassing van de behandeling. Sinds de beschrijving van LAD ligatie model, heeft na de operatie sterftecijfer daalde 35-13%, maar de tweede operatie heeft kritiek gebleven. Om na de operatie het herstel te verbeteren en pijn en infectie te verminderen, zijn minimaal invasieve chirurgische procedures gepresenteerd. Twee thoracotomie uitgevoerd, dat het eerste voor LAD ligatie en het tweede voor behandeling epicardiale toediening. Biografts bestaande uit cellen gekoppeld aan vaste of gel Type matrices werden aangebracht op het infarct area. LAD ligatie resulteerde in verlies van hartfunctie zoals bevestigd door echocardiografie uitgevoerd na 2 en 6 weken. Goldner trichroomkleuring uitgevoerd op hart secties bevestigd transmuraal littekenvorming. Eerste en tweede operaties resulteerde in minder dan 10% postoperatieve mortaliteit.
Introduction
Sinds het einde van de 19 e eeuw, heeft hart-en vaatziekten de nummer een seriemoordenaar in de geïndustrialiseerde landen bleef. Onder hen, coronaire hartziekte is de belangrijkste oorzaak. De acute fase resulteert in een myocardinfarct (MI) en wordt gevolgd door onaangepast remodeling dat geleidelijk ontwikkelt in de richting van een chronische fase en ernstig hartfalen. Ondanks de recente belangrijke technologische en therapeutische vooruitgang, is de morbiditeit en mortaliteit ten gevolge van de progressie van hartfalen nog steeds 1. In deze context heeft celtherapie opgedaan toenemende belangstelling als een nieuwe therapeutische optie om de progressie van de ziekte naar hartfalen stoppen en de recent geïdentificeerde regeneratieve capaciteit van het myocardium te stimuleren. Experimentele en klinische onderzoeken hebben overtuigend bewijs van de gunstige effecten verkregen na harttransplantatie van verschillende celtypes aanwezig. Belangrijkste resultaten opgenomen verbeterde cardiac contractiele functie, verminderde linker ventrikel remodeling, verminderde infarctgrootte en verhoogde vasculaire dichtheid in het infarctgebied. Het lage retentie na celinjectie celaantal blijft een belangrijk nadeel. Vereniging van cellen met een biomatrix verbeteren van cel levertijd 2 hebben onlangs bevorderd onderzoeker en klinische belangen.
Ligatie van de linker anterior descending kransslagader (LAD) is een referentiemethode voor MI in kleine diermodel dat resulteert in een transmuraal infarct en een volwassen litteken. Celtherapie toegepast in de chronische fase van MI is een tweede chirurgische ingreep. Een mediane sternotomie wordt gewoonlijk uitgevoerd om intramyocardiale injectie van de cellen of epicardiale implantatie van biografts mogelijk. Dergelijke invasieve chirurgische procedures te verhogen van het sterftecijfer, na de operatie het herstel tijd, pijn, en het risico van infectie. De minimaal invasieve benadering hier gepresenteerde voorkomt niet alleen dergelijke voorspanning maar ook optimal toegankelijkheid van het centrum voor de behandeling van toepassing. MI en epicardial implantatie van cellen geassocieerd met een soort gel biomatrix worden uitgevoerd op een kloppend hart via links intercostale thoracotomie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Lewis mannelijke en vrouwelijke ratten, 200-220 g werden gehuisvest onder standaard laboratorium omstandigheden (12 uur licht en donker cyclus, ad libitum water en voedsel, IVC kooi). Alle dieren werden behandeld in overeenstemming met de aanbevelingen van de FELASA en de Zwitserse wet op de dierenbescherming.
1 Cell Voorbereiding: mesenchymale stamcellen Isolatie uit beenmerg
- Verdoven de ratten met isofluraan 5% en O 2 5 L / min in een inductie kamer voor 5 minuten. Plaats snuit van het dier in een neuskegel verbonden met het anesthesiesysteem. Voer een teen of staart knijpen om sedatie te bevestigen.
- Verwijder het vel van het been met een schaar door het snijden van de huid van de enkel aan de heup. Verwijder de spieren en snijd de slagader voor dierlijke verbloeding. Expose het heupgewricht en ontwrichten het dijbeen hoofd. Het is belangrijk niet te vergeten de femur kop beschadigen. Leg de botten in steriele PBS in een 50 ml plastic buis.
- Verwijder alle muscles en ligamenten van de botten zonder ze te breken. Opmerking: Het is belangrijk dat het bot blijft intact koppeling van spoeloplossing of contaminatie met ethanol voorkomen. Spoel de geschilde botten in 70% ethanol gedurende 5 minuten.
- Onder de steriele laminaire stroming kap, snijd beide uiteinden van de botten met een schaar. Spoel het beenmerg door het injecteren steriele PBS van het bot uiteinde. Verzamel merg in een 15 ml buis. Centrifugeer 7 min bij 300 x g.
- Verwijder het supernatant. Hang de pellet in 3 ml Red Blood cellysebuffer. Incubeer de suspensie gedurende 1 min bij kamertemperatuur alvorens opnieuw spinnen gedurende 7 min bij 300 x g. In een 150 ml kolf, voeg steriele cel kweekmedium (395 ml IMDM medium, 5 ml pen / strep, 100 ml FBS) en zaad van de cellen.
- Wijzig medium de tweede dag om niet-hechtende cellen te verwijderen.
- Voeren medium verandert elke tweede dag gedurende 2-3 weken tot de gewenste cel hoeveelheid wordt verkregen.
- Als alternatief, bereiden de biograft door zaading van de cellen op de vaste matrix als nodig en elders beschreven 3.
- De dag van cardiale implantatie, de voorbereiding van de cellen of de oogst van het biograft net voor epicardiaal toepassing.
- Het verzamelen van de cellen met behulp van Accutase cel detachement oplossing. Tel de cellen. Vul een 1,5 ml centrifugebuis met het volume van celsuspensie berekende gewenste hoeveelheid cellen te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 300 g en verwijder het supernatant.
- Als alternatief, de oogst van het biograft van cel kweekmedium, afspoelen in steriele PBS, en in vers kweekmedium te houden zonder serum.
2 Eerste Thoracotomie en LAD Ligation
- Weeg de rat. Zet de verwarming pad bij 37 ° C. Verdoven van de rat met 5% isofluraan en 5 L / min 100% O 2 in een inductie kamer voor 5-7 minuten. Voer een teen of staart knijpen om sedatie te bevestigen. Plaats de rat op de verwarming pad.
- Intuberen het dier met een 14G iv catheter. Sluit de intubatie katheter naar een knaagdier ventilator geprogrammeerd voor 2,5 L / min zuurstof, 2,5% isofluraan, tidal volume van 2 ml, en een ademhalingsfrequentie van 90 ademhalingen / min.
- Bereid een buprenorfine-oplossing bij 0,1 mg / kg. Injecteer subcutaan een derde van de oplossing. Scheer het linker gedeelte van de thorax. Desinfecteren met een 1% Betadine oplossing.
- Incise de huid loodrecht op het borstbeen bij de vierde intercostale ruimte. Scheid de 3 lagen van de thoracale spieren (pectoralis major, oplopend pectoralis en externe schuine pectoralis). Open de vierde intercostale ruimte (tussen de ribben 4 en 5).
- Gebruik een kleine retractor aan de ribben te spreiden en het hart bloot te leggen. Open het hartzakje zorgvuldig. Zoek en ligeren van de linker anterieure dalende kransslagader (LAD) met een 7,0 hechtdraad 4 mm onder het atrium.
- Sluit de intercostale ruimte met twee steken met 3,0 hechtingen. Plaats de twee hechtingen proximaal en distaal van het borstbeen. First, tighten het distale hechtdraad. Klem het beademingsapparaat evacuatieslang 2 seconden teneinde de borst blazen en vermijden pneumothorax. Draai de tweede hechtdraad. Plaats de spieren lagen weer op zijn plaats (geen hechtingen nodig zijn). Sluit de huid met een 5,0 hechtdraad.
- Ontsmet de hechtdraad met 1% Betadine oplossing. Injecteer de rest van de buprenorfine oplossing. Schakel de anesthesie-systeem. Verwijder intubatie catheter.
- Houd de rat in de kooi onder een warme lamp voor 1-2 uur. Houd een thermometer in de kooi en de afstand instellen tussen de warme lamp en de kooi om te voorkomen oververhitting. Zet de rat in de IVC-eenheid. Injecteren subcutaan Buprenorfine 0,05-0,1 mg / kg na -operatively elke 6-12 uur gedurende 48 uur.
3 Epicardiale administratie van de behandeling via een tweede Thoracotomie
- Herhaal de stappen 2.1-2.3.
- Incise de huid loodrecht op het borstbeen bij de vijfde intercostale ruimte. Scheid de 3 laags van de thoracale spieren (pectoralis major, oplopend pectoralis en externe schuine pectoralis). Open de vijfde intercostale ruimte (tussen de ribben 5 en 6).
- Gebruik een kleine retractor aan de ribben te spreiden en het hart bloot te leggen. Als er enige aanhang, ze voorzichtig te verwijderen met een fijne tang.
- Zoek het infarct gebied dat wordt weergegeven als een bleke gebied onder de ligatuur. OPMERKING: Als het nodig is, gebruik dan een 10 cm stuk hechtdraad (7.0) geplaatst aan de top om beter te visualiseren de linker hartkamer. Trek zachtjes aan de hechtdraad losjes gehouden door een klem om het hart bloot te leggen.
- Breng een van de volgende behandelingen:
- Plaats de biograft aan het oppervlak van het hart. Gebruik de voorgevulde spuit fibrinelijm voorverwarmd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Breng een druppel (50-100 pl) van fibrineafdichtmiddel onder de biograft met behulp van een 25 G naald Luer. Controleer of de biograft perfect is afgedicht.
- Ook verzoeken de cel pellet verzameld met een pipet op het oppervlak of het hart op de bleke gebied onder de ligatuur. Breng een druppel (50-100 pl) van fibrinelijm op de celpellet.
- Verwijder het stukje hechtdraad van de apex.
- Herhaal de stappen 2,6-2,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle dieren hersteld binnen 1 uur na thoracotomie. De wondgenezing was snel. Geen infectie of oedeem waargenomen.
De dubbele linker thoracotomie toegestaan optimale toegang tot het hart (figuur 1). Pijn en post-operatie mortaliteit waren laag. Het dier herstelde snel van de operatie en in gewicht (figuur 2). Kaplan Meir survival procent bedroeg 96% voor de eerste thoracotomie. Vier ratten van meer dan 104 stierven binnen de 24 uur na de behandeling applicatie via een tweede thoracotomie. Kaplan-Meir overleving procent varieerde van 100% bij dieren kregen een tweede thoracotomie maar geen behandeling (sham), 96% MSC en fibrinelijm groep of 86% wanneer dierlijke ontvangen MSC direct geïnjecteerd in het myocardium (figuur 3).
M-mode echocardiografie evaluatie uitgevoerd 2 weken na de LAD ligatie toonden een vermindering van de fractionele verkorting (FS) van 44 ± 3%22 ± 4%. De frequentie representatie van de FS opgenomen op 104 dieren 2 weken na LAD ligatie ontvangen bewijs van de herhaalbaarheid van de werkwijze (figuur 4). De variatiecoëfficiënt (CV) was 17%. Bovendien echocardiografie uitgevoerd bij 2 en 6 weken na LAD ligatie toonde progressie naar hartfalen voorgesteld door een vermindering van de ejectiefractie (EF) en een toename van LV delen in diastole en systole (figuren 4 en 5). De ontwikkeling van een transmuraal infarct in de schijn-geopereerde groep werd bevestigd door kleuring van Goldner hart doorsneden (figuur 6).
Figuur 1 (A) Het gebruik van oprolmechanisme mag de toegang tot het hart na thoracotomie. LAD ligatie werd 2 weken eerder uitgevoerden hechting zichtbaar is (pijl). Epicardial behandeling applicatie werd uitgevoerd met minimale uittreding van het hart. (B) De cellen pellet gefixeerd met fibrinelijm werden op het oppervlak van het infarctgebied.
Figuur 2 Daily postoperatieve follow-up toonde gewichtsverlies gedurende 2 dagen na de operatie. Herstel ging gepaard met een gewichtstoename in alle dieren. Gewicht variaties waren onafhankelijk van het type behandeling.
Figuur 3 Kaplan-Meir grafiek vertegenwoordigen procent overlevingskans na LAD ligatie (A) en na de behandeling door middel van een tweede thoracotomie (B) bleek dat beide operaties voor een lager verlies dieren. Controle groep vertegenwoordigt gezond dier dat niet geopereerd. Twee weken na de eerste thoracotomie, ontvingen de dieren ofwel een schijnoperaties maar geen behandeling (sham), fibrinelijm alleen cellen met fibrinelijm of cellen gefixeerd rechtstreeks geïnjecteerd in het myocardium (MSC geïnjecteerd).
Figuur 4 (A) Vertegenwoordiger M-mode echocardiografie beelden geregistreerde pre (gezond) en 2 weken na de LAD ligatie (infarct). (B) Frequentie verdeling van de fractionele verkorting geregistreerde waarden twee weken na de LAD ligatie (n = 104).
390fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 5 Hartfunctie werd vastgesteld door 2dimentional echocardiografie (methode tweedekker Simpson's) en opgenomen 2 en 6 weken na LAD-ligatie. Animal had twee thoracotomie maar kreeg geen behandeling. Gemiddelde ± SD en individuele waarden vertegenwoordigd ejectiefractie (A) LV volume in systole (B) en diastole (C). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een gekoppeld parametrische Wilcoxon test.
Figuur 6 Vertegenwoordiger Goldner vlekken tonen fibrotische litteken (groen) en levensvatbaar myocard (rood) 2 weken (A) en 6 weken (B) na de LAD ligatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De permanente ligatie van de LAD veroorzaakt onomkeerbare hartschade. Het eerste diermodel werd beschreven in 1960 4. Sindsdien is het beschouwd als een standaard en geschikt model voor chronische MI. Zijn stabiliteit en reproduceerbaarheid toegestaan experimentele evaluatie van therapieën voor MI-5. Verbeterde procedures na de eerste beschrijving meldde een operatieve mortaliteit van 35-13% 6.
Zoals verwacht, LAD ligatie geïnduceerde verminderde hartfunctie waargenomen binnen 2 weken. Een verdere daling in hartfunctie werd opgenomen tot 6 weken en verbonden transmuraal fibrotische litteken. Bovendien werd remodeling zoals LV dilatatie duidelijk waargenomen 6 weken na ligatie.
Een interval van 2 weken tussen de eerste en tweede operatie gekozen. In deze toestand werd de tweede thoracotomie vergemakkelijkt door de afwezigheid van verklevingen, omdat ze te overvloedig na 1 week waren performa tweede operatie in optimale omstandigheden. Bovendien, 2 weken vertegenwoordigde een optimale tijdschema voor de behandeling toepassing en men liet de eerste foto van ontsteking geïnduceerd door de ischemie te voorkomen en de behandeling toe te passen voor de vorming van een dichte fibrotische weefsel en progressie van de dilatatie.
Hoewel laterale thoracotomie is tegenwoordig de standaard chirurgische procedure voor de LAD ligatie op kleine dieren, wordt een mediane sternotomie meestal uitgevoerd voor celtherapie toepassing 7. De gepresenteerde tweede intercostale thoracotomie voor behandeling applicatie is een nieuwe, minimaal invasieve benadering; Het biedt toegang tot het hart door middel van de ribben zonder te snijden botten en door het splitsen van de spier. Het optreden van de naleving wordt verminderd als gevolg van de kleine en beperkte litteken na eerste thoracotomie en deze niet interfereren met de voltooiing van de behandeling van toepassing. Deze aanpak resulteerde in zeer lage kans op bloedingen, snelle postoperatieveherstel, lage sterfte, pijn en infectierisico. Deze tweede minimaal traumatische procedure duurde 20 min voor chirurgie en maximaal 20 minuten voor fixatie matrix. De snelle procedure en een beperkte blootstelling van het hart geminimaliseerd hartweefsel drogen. Post-operatieve echografie resulteerde in een goede beeldkwaliteit overname voor reproduceerbare metingen analyse. Er waren geen hematomen die beeldvorming zouden kunnen aantasten.
De toegankelijkheid van het hart toegestane optimale zichtbaarheid van het infarct myocardium en een goede belichting van het hart voor de toepassing van epicardiale behandelingen waaronder vaste en geltype biografts 8-10.
Het gebruik van fibrinelijm haar verscheidene voordelen. (I) Voor vaste pleisters lossen, het gebruik van fibrinelijm minder traumatisch dan hechtingen. (Ii) In vergelijking met andere lijm zoals BioGlue (CryoLife), fibrineafdichtmiddel was meer compliant dan BioGlue dat rigide structuur en verminderde hart gevormdcontracties. (Iii) De polymerisatietijd was optimaal voor adequate steiger of celpellet positionering. (Iv) fibrineafdichtmiddel toegestaan uitstekende initiële hechting van vaste patch. De pleister werd strak gehouden op het oppervlak van het hart ten minste 4 weken 10. (V) fibrinelijm was goed bewerkbaar indien gebruikt als matrix voor epicardiale cellen levering en gefixeerde cellen werden tot het einde van de chirurgische procedure gehandhaafd op het oppervlak van het infarctgebied. Hoewel de retentietijd van de cellen was niet scherp van deze studie en zou nader onderzoek vergen, is voorgesteld dat de matrix maakt verbeterde myocard behoud van geïmplanteerde cellen 11-14. Uit cellen wassen gedurende cardiale contractie, evenals de hypoxische en inflammatoire milieu, verklaart ten dele de snelle klaring. Deze nadelen kunnen worden verlaagd wanneer cellen worden geassocieerd met een matrix.
Betrokken belangrijkste technische uitdagingen de chirurgische behandeling vaneen solide biograft. Als de matrix stijf en nonflexible moeten fixatie met hechtingen worden begunstigd. De volgende kritische stappen moeten worden beschouwd voor een succesvolle procedure. Ten eerste moet een bijzondere aandacht worden besteed tijdens thoracotomie om te voorkomen dat het breken van de ribben. Ten tweede moet overmaat lijm zorgvuldig verwijderd om hechting van andere weefsels te voorkomen. Tenslotte gestandaardiseerde ligatuur positionering is belangrijk omdat het de variabiliteit in infarctgrootte verlagen. Een transmuraal infarct kan worden verkregen wanneer LAD geligeerd 4 mm onder het atrium.
Tot slot, dubbele thoracotomie vertegenwoordigd een veilige chirurgische ingreep met een lage sterfte, adequate toegang tot het kloppend hart voor de behandeling toepassing, en daarom zal de optimalisatie van de experimentele planning en vermindering van het aantal verloren dier te bevorderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs danken Prof Hendrik Tevaearai en het Ministerie van Cardiovasculaire Chirurgie voor financiële steun voor het eerste deel van de studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
- Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
- Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
- Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
- Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
- Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
- Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
- Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
- Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
- Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
- Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
- Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).
