Summary
Implantation av en biograft att behandla hjärtinfarkt inducerad av LAD ligation i en gnagarmodell har konventionellt krävs två öppna hjärtoperationer. För att minska dödligheten och ger optimala förutsättningar för fixering av fast och gelé biomatrices förknippade med celler, har minimalt invasiva procedurer utvecklats.
Abstract
Hjärtcellterapi har fått allt större intresse och implantation av biomaterial i samband med celler har blivit en viktig fråga för att optimera myokardcellerna leverans. Gnagare modell av hjärtinfarkt (MI) består av vänster främre nedåt Artery (LAD) ligation har vanligen utförts via en torakotomi; en andra hjärtoperationer via ett sternotomi har traditionellt utförts för epikardiell tillämpning av behandlingen. Eftersom beskrivningen av LAD ligation modell, har efter operationen dödligheten sjunkit från 35 till 13%, men den andra operationen har varit kritisk. I syfte att förbättra post-kirurgi återvinning och minska smärta och infektion, är minimalt invasiva kirurgiska procedurer presenteras. Två torakotomi utfördes, den första en för LAD ligation och den andra för behandling epikardiell administration. Biografts består av celler i samband med fasta eller gel typ matriser applicerades på infarkt area. LAD ligation resulterade i förlust av hjärtfunktionen vilket bekräftas av ekokardiografi utförs efter 2 och 6 veckor. Goldner trikromfläckning utförs på hjärtsektioner bekräftade transmural ärrbildning. Första och andra operationer resulterade i mindre än 10% postoperativ mortalitet.
Introduction
Sedan slutet av 19-talet, har hjärt-kärlsjukdom var antalet en seriemördare i industrialiserade länder. Bland dem representerar kranskärlssjukdom huvud etiologi. De akuta fasen ger hjärtinfarkt (MI) och följs av maladaptiv ombyggnad som successivt utvecklas mot en kronisk fas och svår hjärtsvikt. Trots de senaste betydande tekniska och terapeutiska framsteg är sjuklighet och dödlighet på grund av utvecklingen av hjärtsvikt växer fortfarande 1. I detta sammanhang har cellterapi fått ökat intresse som ett nytt behandlingsalternativ för att stoppa utvecklingen av sjukdomen mot hjärtsvikt och för att stimulera den nyligen identifierade förnyelseförmåga i hjärtmuskulaturen. Experimentella och kliniska undersökningar har gett övertygande bevis för de positiva effekter som erhölls efter hjärttransplantation av olika celltyper. Större utfall ingår förbättrad cardiac kontraktila funktion, minskade vänster kammare ombyggnad, minskad infarktstorlek och ökad vaskulär densitet i infarktområdet. Men det låga antalet celler behålla efter cellinjektion förblev en viktig nackdel. Föreningen av celler med en biomatris att förbättra cellleverans 2 har nyligen främjat forskare och kliniska intressen.
Ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) är en referensmetod för MI i små djurmodell som resulterar i transmural infarkt och en mogen ärr. Cellterapi används i den kroniska fasen av MI kräver ett andra kirurgiskt ingrepp. En median sternotomi utförs vanligtvis för att möjliggöra intramyocardial injektion av cellerna eller epikardiell implantation av biografts. Sådana kirurgiska ingrepp ökar dödligheten, efter kirurgi återhämtningstid, smärta och risk för infektion. Den minimalinvasiv metod som presenteras här inte bara hindrar en sådan partiskhet, men ger också optimal tillgängligheten av hjärtat för behandling ansökan. MI och epikardiell implantation av celler i förening med en gel typ biomatris utförs på ett slående hjärta via vänster interkostal torakotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Lewis Manliga och kvinnliga råttor 200-220 g inrymt under standardlaboratorieförhållanden (12 h ljus och cykel mörker, behag vatten och mat, IVC bur). Samtliga djur behandlades i enlighet med rekommendationerna från FELASA och Schweiziska lagen om djurskydd.
1. Cell Förberedelser: mesenkymala stamcellen Isolering från benmärg
- Bedöva råttorna med isofluran 5% och O 2 5 L / min i en induktionskammare för 5 min. Placera djurets nos in i en noskon ansluten till anestesisystemet. Utför en tå eller svans nypa för att bekräfta sedering.
- Ta bort skinnet från benet med en sax genom att skära huden från vristen till höften. Ta musklerna och skär lårbensartären för djur avblodning. Exponera höftleden och rubba lårbenet huvudet. Det är viktigt att inte skada lårbenet huvudet. Placera benen i steril PBS i en 50 ml plaströr.
- Ta bort alla muscles och ligament från benen utan att bryta dem. OBS: Det är viktigt att benet förblir intakt för att undvika koppling av spolningslösning eller förorening med etanol. Skölj de skalade ben i 70% etanol under 5 min.
- Under sterila laminärflödeshuv, skär båda spetsarna på ben med sax. Spola benmärgen genom att injicera steril PBS från benet extremiteten. Samla märg in i ett 15 ml rör. Centrifugera 7 min vid 300 x g.
- Avlägsna supernatanten. Häng pelleten i 3 ml röda blodkroppar Lysbuffert. Inkubera suspensionen under 1 min vid rumstemperatur före spinning igen för 7 min vid 300 x g. I en 150 ml odlingskolv, tillsätt sterilt cellkulturmedium (395 ml IMDM medium, 5 ml penna / streptokocker, 100 ml FBS) och frö cellerna.
- Ändra medel den andra dagen för att ta bort icke-vidhäftande celler.
- Utför medel förändringar varannan dag under 2-3 veckor tills önskad cellmängd erhålls.
- Alternativt förbereda biograft med utsädeing av celler på den fasta matrisen efter behov och beskrivs på annat håll 3.
- Dagen av hjärt implantation, förbereda cellerna eller skörda biograft strax före epikardiell ansökan.
- Samla cellerna med hjälp Accutase cell lossnar lösning. Räkna celler. Fyll ett 1,5 ml centrifugrör med volymen av cellsuspension beräknades för erhållande av önskad cell kvantitet. Centrifugera under 7 minuter vid 300 xg och avlägsna supernatanten.
- Alternativt, skörda biograft från cellkulturmedium, skölj i steril PBS, och hålla i färskt odlingsmedium utan serum.
2 Första Torakotomi och LAD Ligation
- Väg råttan. Sätt på värmedyna vid 37 ° C. Söva råttan med 5% isofluran och 5 l / min 100% O 2 i en induktionskammare för 5-7 min. Utför en tå eller svans nypa för att bekräfta sedering. Placera råttan på värmedyna.
- Intuberas djuret med en 14G IV kateter. Anslut intubation kateter till en gnagare ventilator programmerad för 2,5 l / min syre, 2,5% isofluran, tidalvolym på 2 ml och en andningsfrekvens på 90 andetag / min.
- Förbered en buprenorfin lösning vid 0,1 mg / kg. Injicera subkutant tredjedel av lösningen. Raka den vänstra delen av bröstkorgen. Desinficera med en 1% Betadine-lösning.
- Incise hud vinkelrät mot sternum vid det fjärde interkostalrummet. Separera 3 lager av bröstmuskeln (pectoralis major, stigande pectoralis och yttre sneda pectoralis). Öppna den fjärde revbensmellanrummet (mellan ribborna 4 och 5).
- Använd en liten upprullningsdonet sprida revbenen och att exponera hjärtat. Öppna perikardium noggrant. Leta upp och ligera den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) med en 7,0 sutur 4 mm under atrium.
- Stäng interkostalrummet med två stygn med användning av 3,0 suturer. Placera de två suturer proximalt och distalt från bröstbenet. Först tighten distala sutur. Kläm fast ventilator avgasslangen i 2 sekunder för att blåsa upp bröstet och undvika pneumothorax. Dra den andra sutur. Placera muskler lagren på plats igen (inga suturer behövs). Stäng huden med en 5,0 sutur.
- Desinficera sutur med 1% Betadine-lösning. Injicera resten av buprenorfin lösningen. Stäng av anestesisystemet. Avlägsna intubation kateter.
- Håll råttan i buren under en varm lampa under 1-2 timmar. Håll en termometer i buren och kontrollera avståndet mellan den varma lampan och bur i syfte att undvika överhettning. Returnera råttan i IVC enheten. Injicera subkutant Buprenorfin 0,05-0,1 mg / kg inlägg -operatively var 6-12 timme under 48 timmar.
3 epikardisk Administration av behandlingen via en andra Torakotomi
- Upprepa steg 2,1-2,3.
- Incise hud vinkelrät mot sternum vid det femte interkostalrummet. Separera 3 lagers av bröstmuskeln (pectoralis major, stigande pectoralis och yttre sneda pectoralis). Öppna den femte interkostalrummet (mellan ribborna 5 och 6).
- Använd en liten upprullningsdonet sprida revbenen och att exponera hjärtat. Om det finns någon vidhäftning, försiktigt bort dem med fin pincett.
- Leta reda på infarktområdet som visas som en blek området nedanför ligatur. OBS: Vid behov, använd en 10 cm bit av sutur (7,0) insatt i toppen för att bättre visualisera vänster kammare. Dra försiktigt suturen underhålls löst med en klämma för att exponera hjärtat.
- Applicera någon av följande behandlingar:
- Placera biograft vid ytan av hjärtat. Använd den förfyllda fibrintätning spruta förvärmt i rumstemperatur i 10 minuter. Applicera en droppe (50-100 l) av fibrintätning under biograft med hjälp av en 25 G Luerkanylen. Kontrollera att biograft är perfekt tätad.
- Alternativt, applicera cellpelleten in med en pipett på ytan of hjärtat på den bleka området nedanför ligatur. Applicera en droppe (50 till 100 | il) av fibrintätning på cellpelleten.
- Ta bort bit suturen från spetsen.
- Upprepa steg 2,6-2,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla djur återvinnas inom 1 timme efter torakotomi. Den sårläkning var snabb. Ingen infektion eller ödem observerades.
Den dubbla vänstra torakotomi tillät optimal tillgång till hjärtat (figur 1). Smärta och efter operationen dödligheten var låga. Djuret återhämtade sig snabbt från kirurgin och ökade i vikt (figur 2). Kaplan Meir överlevnadsprocent var 96% för första torakotomi. Fyra råttor över 104 dog inom 24 timmar efter behandling ansökan via en andra torakotomi. Kaplan-Meir överlevnad procent varierade från 100% när djuret fått en andra torakotomi men ingen behandling (sham), 96% för MSC och fibrintätningsmedel grupp, eller 86% när djuret fått MSC injiceras direkt i hjärtmuskeln (Figur 3).
M-mode ekokardiografisk utvärdering utförd 2 veckor efter LAD ligation visade en minskning av fraktionerad förkortning (FS) från 44 ± 3%till 22 ± 4%. Frekvensen representation av FS inspelade på 104 djur 2 veckor efter LAD ligation som bevis för repeterbarheten för metoden (Figur 4). Variationskoefficienten (CV) var 17%. Vidare ekokardiografi utfördes vid 2 och 6 veckor efter LAD ligation visade en utveckling mot hjärtsvikt föreslagit en minskning av ejektionsfraktion (EF) och en ökning av LV volymer i diastole och systole (figurerna 4 och 5). Utvecklingen av en transmural infarkt i skenopererade gruppen bekräftades genom Goldner färgning av hjärt tvärsnitt (Figur 6).
Figur 1 (A) Användningen av upprullningsdon får tillgång till hjärtat efter torakotomi. LAD ligation utfördes två veckor tidigareoch sutur är synlig (pil). Epikardiella behandling ansökan utfördes med minsta exteriorisering av hjärtat. (B) Cellerna pellet fixerades med fibrintätningsmedel bibehölls vid ytan av infarktområdet.
Figur 2 Daglig postoperativ uppföljning visade viktminskning i 2 dagar efter operationen. Återhämtning var tillsammans med förstärkningen av vikt i alla djur. Viktvariationer var oberoende av vilken typ av behandling.
Figur 3 Kaplan-Meir diagram som representerar procent överlevnad efter LAD ligation (A) och efter behandling via en andra torakotomi (B) visade att båda operationer ledde till minskad förlust av djur. Kontrollgrupp representerar friskt djur som inte hade någon operation. Två veckor efter den första torakotomi mottog djuren antingen en simulerad operation men ingen behandling (sham), enbart fibrinlim, celler fixerade med fibrintätningsmedel, eller celler injiceras direkt inom myokardiet (MSC injiceras).
Figur 4 (A) representant M-mode ekokardiografi bilder registrerade pre (friska) och 2 veckor efter LAD ligation (infarkt). (B) Frekvens fördelningen av de bråk förkortning värdena registreras två veckor efter LAD ligation (n = 104).
390fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5 Hjärta funktion bedömdes genom 2dimentional ekokardiografi (biplan Simpsons metod) och registreras två och sex veckor efter LAD-ligering. Animal hade två torakotomi men erhöll ingen behandling. Medelvärde ± SD samt individuella värden representeras för ejektionsfraktion (A) LV volym i systole (B) och diastole (C). Statistiska analyser utfördes med användning av ett parat nonparametric Wilcoxon test.
Figur 6 Representant Goldner färgning visar fibrotiska ärr (grön) och livskraftig hjärtmuskeln (röd) på 2 veckor (A) och 6 veckor (B) efter LAD ligation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den permanenta ligering av LAD orsakar irreversibel myokardskada. Den första djurmodell beskrevs 1960 4. Sedan dess har det ansetts som en standard och lämplig modell för kronisk MI. Dess stabilitet och reproducerbarhet tillät experimentell utvärdering av terapier för MI 5. Förbättrade rutiner efter den inledande beskrivningen rapporterade en operativ dödlighet på 35-13% 6.
Som väntat LAD ligation inducerad nedsatt hjärtfunktion observerats inom 2 veckor. En ytterligare minskning av hjärtfunktionen registrerades upp till 6 veckor och i samband med transmural fibrotisk ärr. Dessutom var LV remodeling inklusive LV dilatation tydligt observer 6 veckor efter ligering.
Ett intervall på 2 veckor mellan den första och den andra operationen valdes. I detta tillstånd var den andra torakotomi underlättas genom frånvaron av adherenser, eftersom de var alltför riklig efter en vecka för att utför litenma andra operation under optimala förhållanden. Dessutom två veckor representerade en optimal tidsramen för behandling ansökan och tilläts att undvika tidig pic av inflammation inducerad av ischemi och för att tillämpa den behandling innan bildandet av en tät fibrös vävnad och progression av dilation.
Även sido torakotomi är numera standard kirurgiskt ingrepp för LAD ligation på små djur, är en median sternotomi vanligtvis för cellterapi ansökan 7. Den presenterade andra revbens torakotomi för behandling ansökan är en roman, minimalt invasiv strategi; Det ger tillgång till hjärtat genom revbenen utan att skära ben och genom att dela muskeln. Förekomsten av följsamhet är nedsatt på grund av den lilla och begränsade ärr efter första torakotomi och att dessa inte stör utförandet av behandlingsansökan. Det tillvägagångssätt resulterade i mycket låg risk för blödning, snabb postoperativåtervinning, låg dödlighet, smärta och risk för infektion. Denna andra minimalt traumatisk procedur varade 20 min för kirurgi och upp till 20 min för matris fixering. Den snabba förfarandet och begränsad exponering av hjärtat minimeras hjärtvävnad torkning. Postoperativ ultraljud gav god kvalitet bild förvärv för reproducerbara mätningar analys. Det fanns inga hematom som kan försämra bild.
Tillgängligheten av hjärtat tillät optimal synlighet infarkt myokardiet samt en bra exponering av hjärtat för att tillämpa epikardiska behandlingar inklusive fasta och gel typ biografts 8-10.
Användningen av fibrintätning presenterade flera fördelar. (I) För att fixa fasta fläckar, var mindre traumatisk än suturer användning av fibrintätning. (Ii) jämfört med andra lim som Bioglue (Cryolife), fibrintätningsmedel var mer kompatibel än Bioglue som bildades styv konstruktion och nedsatt hjärtsammandragningar. (Iii) Dess polymerisationstiden var optimal för lämplig byggnadsställning eller cellpelleten positionering. (Iv) fibrintätningsmedel tillät utmärkt initial vidhäftning av fast plåstret. Lappen tätt hållna på ytan av hjärtat i minst 4 veckor 10. (V) fibrintätningsmedel var lätt att processen när den används som bärare av epikardiell cell leverans och fixerade celler hölls vid ytan av infarktområdet fram till slutet av det kirurgiska ingreppet. Även retentionstiden för cellerna var av fokus för denna studie och skulle kräva ytterligare undersökningar, har det föreslagits att matrix möjliggör förbättrad myocardial retention av implanterade celler 11-14. Tvätta av celler vid hjärtats sammandragning, samt hypoxisk och inflammatorisk miljö, kan delvis förklara den snabba avslut. Dessa nackdelar kan minskas när celler är associerade med en matris.
De viktigaste tekniska utmaningarna i fråga den kirurgiska behandlingen aven solid biograft. Om matrisen är styv och nonflexible bör fixering med suturer gynnas. Följande kritiska steg bör övervägas för framgångsrik förfarande. För det första bör en särskild uppmärksamhet ges under torakotomi för att undvika att bryta revbenen. För det andra bör överskott av lim avlägsnas försiktigt för att undvika vidhäftning av andras vävnader. Slutligen är en standardiserad ligatur positionering viktigt eftersom det kan minska variationen i infarktstorlek. En transmural infarkt kan erhållas när LAD ligeras 4 mm under det atrium.
Sammanfattningsvis dubbel torakotomi representerade en säker operation med låg dödlighet, tillräcklig tillgång till slående hjärta för behandling program, och därmed gynnar optimering av försöksplanering och minskat antal djur förlust.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Prof Hendrik Tevaearai och Department of Cardiovascular Surgery för ekonomiskt stöd för den första delen av studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
- Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
- Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
- Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
- Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
- Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
- Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
- Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
- Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
- Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
- Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
- Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).
