Summary
Implantation af en biograft at behandle myokardieinfarkt induceret af LAD ligering i en gnaver model er traditionelt krævet to åbne hjerteoperationer. Med henblik på at reducere dødeligheden og giver optimale betingelser for fiksering af faste og gelatinøse biomatrices forbundet med celler, er blevet udviklet minimalt invasive procedurer.
Abstract
Cardiac celleterapi har fået stigende interesse og implantation af biomaterialer, der er forbundet med celler er blevet et stort problem at optimere myokardiecellen levering. Gnavermodel af myokardieinfarkt (MI), der består af Venstre anterior faldende arterie (LAD) ligering er almindeligvis blevet udført via en torakotomi; en anden åben hjerteoperation via en sternotomi er traditionelt blevet udført for epikardial anvendelse af behandlingen. Da beskrivelsen af LAD ligatur model, har post-kirurgi dødeligheden faldet fra 35 til 13%, men den anden kirurgi er forblevet kritisk. For at forbedre postoperativt genopretning og mindske smerter og infektion, er minimalt invasive kirurgiske procedurer præsenteres. To thoracotomies blev udført for den første for LAD underbinding og den anden til behandling epikardial indgivelse. Biografts består af celler i forbindelse med faste eller gel typen matricer blev påført infarktområdet area. LAD ligering resulterede i tab af hjertefunktionen som bekræftet ved ekkokardiografi udføres efter 2 og 6 uger. Goldner trikrom farvning udført på hjerte sektioner bekræftet transmural ardannelse. Første og anden kirurgi resulterede i mindre end 10% post-operativ mortalitet.
Introduction
Siden slutningen af det 19. århundrede, har hjertekarsygdomme været nummer et seriemorder i de industrialiserede lande. Blandt dem, koronararteriesygdom udgør den vigtigste ætiologi. De akutte resultater fase i myokardieinfarkt (MI) og efterfølges af utilpasset remodellering der gradvist udvikler sig i retning af en kronisk fase og alvorlig hjerteinsufficiens. Trods de seneste væsentlige teknologiske og terapeutiske fremskridt, er sygelighed og dødelighed som følge af progressionen af hjertesvigt stadig voksende 1. I denne sammenhæng har celleterapi fået stigende interesse som en ny terapeutisk mulighed for at stoppe progressionen af sygdommen mod hjertesvigt og stimulere nylig identificeret regenerationsevne myokardiet. Eksperimentelle og kliniske undersøgelser har tilvejebragt overbevisende dokumentation for de gavnlige virkninger, der opnås efter hjertetransplantation af forskellige celletyper. Vigtigste resultater indgår forbedret cardiac kontraktile funktion, nedsat venstre ventrikel remodeling reduceret infarktstørrelse og forøget vaskulær tæthed i infarktområdet. Den lave celleantal tilbageholdelse efter celleinjektion fortsat en vigtig ulempe. Sammenslutningen af celler med en biomatrix at forbedre celle levering 2 har for nylig skabt forsker og kliniske interesser.
Ligering af venstre forreste nedadgående kranspulsåre (LAD) er en referencemetode til MI i lille dyremodel, der resulterer i transmural infarkt og en moden ar. Celleterapi anvendes i den kroniske fase af MI kræver en anden kirurgisk indgreb. En mediansternotomi udføres sædvanligvis for at tillade intramyocardial injektion af cellerne eller epikardial implantation af biografts. Sådanne invasive kirurgiske procedurer øger dødeligheden, post-kirurgi opsving tid, smerte og risiko for infektion. Den minimalt invasiv strategi, der fremlægges her ikke blot forhindrer en sådan skævhed, men også giver optimal tilgængelighed af hjertet til behandling ansøgning. MI og epikardial implantation af celler i forbindelse med en gel typen biomatrix er foretaget på et bankende hjerte via venstre interkostale thoracotomies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Lewis Mand og hunrotter blev 200-220 g opstaldet under standard laboratorieforhold (12 timers lys og mørke cyklus, ad libitum vand og mad, IVC bur). Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med anbefalingerne fra FELASA og den schweiziske lov om dyrebeskyttelse.
1. Celle Forberedelse: mesenchymale stamceller Isolering fra knoglemarv
- Bedøver rotterne med isofluran 5% og O 2 5 L / min i en induktion kammer i 5 min. Placer dyrets snude i en næsekegle tilsluttet anæstesi systemet. Udfør en tå eller hale knibe for at bekræfte sedation.
- Fjern skindet fra benet med en saks ved at skære i huden fra ankel til hofte. Fjern musklerne og skære lårarterien for dyrs forblødning. Expose hofteleddet og forrykke lårbenshovedet. Det er vigtigt ikke at beskadige lårbenshovedet. Placer knoglerne i sterilt PBS i et 50 ml plastrør.
- Fjern alle muscles og ledbånd fra knoglerne uden at bryde dem. BEMÆRK: Det er vigtigt, at knoglen forbliver intakt for at undgå kobling af rødmen opløsning eller forurening med ethanol. Skyl de skrællede knogler i 70% ethanol i 5 min.
- Under sterile laminær strømning, skæres begge spidserne af knogler med en saks. Skyl knoglemarven ved injektion sterilt PBS fra knoglen ende. Saml marv i et 15 ml rør. Centrifuger 7 minutter ved 300 x g.
- Supernatanten fjernes. Suspender pillen i 3 ml røde blodlegemer Lysebuffer. Inkuberes suspensionen i 1 minut ved stuetemperatur før spinding igen i 7 minutter ved 300 x g. I en 150 ml kultur kolbe, der tilsættes sterilt celledyrkningsmedium (395 ml IMDM medium, 5 ml pen / strep, 100 ml FBS) og frø cellerne.
- Skift medium anden dag for at fjerne ikke-adhærerende celler.
- Udfør udskiftning af medium hver anden dag i 2-3 uger, indtil den ønskede celle mængde opnås.
- Alternativt kan forberede biograft ved frøning af cellerne på den faste matrix efter behov og beskrevet andetsteds 3.
- Dagen af hjerte implantation forberede cellerne eller høste biograft lige før epikardial ansøgning.
- Saml cellerne under anvendelse Accutase celle løsrivelse løsning. Tæl cellerne. Fyld en 1,5 ml centrifugeglas med volumen cellesuspension er beregnet til at opnå den ønskede celle mængde. Centrifugeres i 7 min ved 300 xg og fjern supernatanten.
- Alternativt høste biograft fra celledyrkningsmediet, skylles i sterilt PBS, og opbevares i frisk dyrkningsmedium uden serum.
2. Først torakotomi og LAD Ligation
- Rotten vejer. Tænd varmepude ved 37 ° C. Anesthetize rotten med 5% isofluran og 5 l / min 100% O 2 i en induktion kammer i 5-7 min. Udfør en tå eller hale knibe for at bekræfte sedation. Placer rotte på varmepude.
- Intubere dyret med en 14G iv kateter. Slut intubation kateteret til en gnaver ventilator programmeret til 2,5 L / min oxygen 2,5% isofluran, respirationsvolumen på 2 ml og en åndedrætsfrekvens på 90 vejrtrækninger / min.
- Forbered en buprenorphin opløsning ved 0,1 mg / kg. Injicer subkutant en tredjedel af opløsningen. Barber venstre del af brystkassen. Desinficeres med en 1% Betadine-opløsning.
- Incise huden vinkelret på brystbenet ved fjerde interkostale rum. Adskil de 3 lag thorax muskel (pectoralis major, opstigende pectoralis og eksterne skrå pectoralis). Åbn fjerde interkostale mellemrum (mellem ribberne 4 og 5).
- Brug en lille retraktor at sprede ribberne og blotlægge hjertet. Åbn hjertesækken omhyggeligt. Find og ligere den venstre forreste nedadgående kranspulsåre (LAD) med et 7,0 sutur 4 mm under atrium.
- Luk interkostale plads med to masker anvender 3,0 suturer. Placer de to suturer proksimalt og distalt fra brystbenet. Først tighten den distale sutur. Clamp ventilatoren udstødning rør til 2 sek, for at puste brystet og undgå enhver pneumothorax. Spænd anden sutur. Placer muskler lag tilbage på plads (der er ikke behov for suturer). Luk huden med en 5,0 sutur.
- Desinficer suturen med 1% betadinopløsning. Injicer resten af buprenorphin opløsning. Sluk for anæstesi-systemet. Fjern intubation kateter.
- Hold rotten i buret under en varm lampe til 1-2 timer. Hold et termometer i buret og styre afstanden mellem den varme lampe og buret for at undgå overophedning. Retur rotte i IVC enheden. Injicer subkutant Buprenorphin 0,05-0,1 mg / kg indlæg -operatively hver 6-12 timer i 48 timer.
3. epikardielle administration af behandlingen via en anden thoracotomi
- Gentag trin 2.1-2.3.
- Incise huden vinkelret på brystbenet på den femte interkostale plads. Adskil 3 lags af thorax muskel (pectoralis major, opstigende pectoralis og ekstern skrå pectoralis). Åbn femte interkostale mellemrum (mellem ribberne 5 og 6).
- Brug en lille retraktor at sprede ribberne og blotlægge hjertet. Hvis der er noget vedhæftning, forsigtigt fjerne dem med fine pincet.
- Find den infarkt område, der fremstår som et blegt område under ligatur. BEMÆRK: Når det er nødvendigt, skal du bruge en 10 cm stykke af sutur (7,0) indsat i spidsen for bedre at visualisere den venstre ventrikel. Træk forsigtigt suturen vedligeholdes løst med en klemme for at blotlægge hjertet.
- Anvende en af følgende behandlinger:
- Placer biograft på overfladen af hjertet. Brug fyldt fibrintætningsmiddel sprøjte forvarmet ved stuetemperatur i 10 min. Påfør en dråbe (50-100 ul) af fibrintætningsmiddel under biograft anvendelse af en 25 G luerkanylen. Kontroller, at biograft perfekt er forseglet.
- Alternativt anvende cellepelleten opsamles med en pipette spids på overfladen of hjertet på blegt område under ligatur. En dråbe (50-100 ul) af fibrintætningsmiddel på cellepelleten.
- Fjern stykke suturen fra spidsen.
- Gentag trin 2,6-2,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle dyr inddrevet inden for 1 time efter thoracotomies. Den sårheling var hurtig. Ingen infektion eller ødem blev observeret.
Den dobbelte venstre torakotomi tilladt optimal adgang til hjertet (figur 1). Smerter og post-kirurgi dødelighed var lave. Dyret genvundet hurtigt fra kirurgi og tog på i vægt (Figur 2). Kaplan Meir overlevelse procent var 96% for den første torakotomi. Fire rotter end 104 døde inden for 24 timer efter behandling ansøgning via en anden thorakotomi. Kaplan-Meir overlevelse procent varierede fra 100%, når dyr modtog sit andet torakotomi men ingen behandling (simuleret), 96% for MSC og fibrintætningsmiddel gruppe eller 86%, når dyr fik MSC injiceret direkte i myokardiet (Figur 3).
M-mode ekkokardiografisk vurdering udført 2 uger efter LAD ligering viste en reduktion i fraktioneret forkortelse (FS) fra 44 ± 3%til 22 ± 4%. Hyppigheden repræsentation af FS indspillet på 104 dyr 2 uger efter LAD ligeringsprodukter leveret bevis for metodens repeterbarhed (Figur 4). Variationskoefficienten (CV) var 17%. Endvidere ekkokardiografi udført ved 2 og 6 uger efter LAD ligering viste en fremgang mod hjertesvigt foreslået af en reduktion af uddrivningsfraktion (EF) og en stigning af LV mængder i diastole og systole (figur 4 og 5). Udviklingen af en transmural infarkt i skinopererede gruppe blev bekræftet ved Goldner farvning af hjertet tværsnit (figur 6).
Figur 1. (A) Anvendelsen af retraktor tilladt adgang til hjertet efter torakotomi. LAD ligering blev udført to uger tidligereog sutur er synlige (pil). Epikardial behandling ansøgning blev udført med mindst eksteriorisering af hjertet. (B) Cellerne pellet fast med fibrinklæber blev fastholdt på overfladen af infarktområdet.
Figur 2. Daglig postoperativ opfølgning viste vægttab for 2 dage efter operationen. Recovery blev ledsaget med gevinst på vægt i alle dyr. Vægt variationer var uafhængige af typen af behandling.
Figur 3. Kaplan-Meir graf, der repræsenterer procent overlevelse efter LAD ligatur (A) og efter behandling via en anden torakotomi (B) viste, at begge operationer resulterede i reduceret tab af dyr. Kontrolgruppen repræsenterer sundt dyr, der havde ingen operation. To uger efter den første torakotomi modtog dyr enten en skinoperation men ingen behandling (fingeret), fibrinklæber alene celler fikseret med fibrinklæber eller celler injiceret direkte i myokardium (MSC injiceret).
Figur 4. (A) repræsentant M-mode ekkokardiografi billeder registreret før (sunde) og 2 uger efter LAD ligatur (infarktramt). (B) Frekvens fordeling af de brøkdele afkortning værdier registreres der to uger efter LAD ligatur (n = 104).
390fig5highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 5. hjertefunktion blev vurderet ved 2dimentional ekkokardiografi (biplan Simpsons metode) og registreres 2 og 6 uger efter LAD ligatur. Animal havde to thoracotomies men modtog ingen behandling. Gennemsnit ± SD samt individuelle værdier repræsenteret uddrivningsfraktion (A) LV volumen i systole (B) og diastole (C). Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af en parret ikke-parametrisk Wilcoxon test.
Figur 6. Repræsentant Goldner farvning viser fibrotisk ar (grøn) og levedygtigt myocardium (rød) på 2 uger (a) og 6 uger (B) efter LAD ligering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den permanente ligering af LAD forårsager uoprettelige myokardieskade. Den første dyremodel blev beskrevet i 1960 4. Siden da har det været betragtet som en standard og passende model for kronisk MI. Dets stabilitet og reproducerbarhed tilladt eksperimentel evaluering af terapier for MI 5. Forbedrede procedurer efter den indledende beskrivelse rapporterede en operativ dødelighed på 35-13% 6.
Som forventet, LAD ligatur induceret nedsat hjertefunktion observeret inden for 2 uger. En yderligere nedgang i hjertefunktionen blev registreret op til 6 uger, og er forbundet med transmural fibrotisk ar. Desuden blev LV remodeling herunder LV dilatation klart observeret seks uger skrive ligering.
Et interval på 2 uger mellem første og anden operation blev valgt. I denne tilstand, blev det andet thoracotomi lettes ved fraværet af adhærenser, som de var for rigelige efter 1 uge til forbedre præstationenma anden kirurgi i optimale betingelser. Desuden to uger udgjorde en optimal tidsramme for behandling anvendelse og fik lov at forhindre tidlig pic af inflammation induceret af iskæmi og anvende behandlingen før dannelsen af en tæt fibrøst væv og progression af dilatation.
Selv lateral torakotomi er i dag standard kirurgisk procedure for LAD ligering på små dyr, er en mediansternotomi normalt udføres til celleterapi ansøgning 7. Den præsenterede anden interkostale thoracotomi til behandling ansøgning er en roman, minimalt invasiv tilgang; det giver adgang til hjertet gennem ribbenene uden at skære knogler ved at opdele musklen. Forekomsten af adhærens er nedsat på grund af den lille og begrænset ar efter første torakotomi og disse ikke forstyrrer udførelsen af ansøgningen behandling. Den fremgangsmåde resulterede i meget lav risiko for blødning, hurtig postoperativnyttiggørelse, lav dødelighed, smerte og risiko for infektion. Denne anden minimalt traumatisk procedure varede 20 min til kirurgi og op til 20 min for matrix fiksering. Den hurtige procedure og begrænset eksponering af hjertet minimeres hjertevæv tørring. Postoperativ ultralydsbilleddannelse resulterede i billedkvalitet erhvervelse godt for reproducerbare målinger analyse. Der var ingen hæmatomer, som kan forringe billeddannelse.
Tilgængeligheden af hjertet tillod optimal synlighed infarktområdet myokardie samt en god eksponering af hjertet for anvendelse af epikardielle behandlinger, herunder faste og gel typen biografts 8-10.
Anvendelsen af fibrin-tætningsmiddel præsenteret flere fordele. (I) At fastsætte faste pletter, brug af fibrintætningsmidlet var mindre traumatisk end suturer. (Ii) når sammenlignet med andre lim såsom Bioglue (Cryolife), fibrintætningsmiddel var mere kompatibel end Bioglue som dannede stiv struktur og nedsat hjertesammentrækninger. (Iii) hvis polymerisationstid var optimal for en passende stillads eller cellepellet positionering. (Iv) fibrintætningsmiddel tilladt glimrende indledende vedhæftning af fast plaster. Plasteret blev stramt fastholdt på overfladen af hjertet for mindst 4 uger 10. (V) fibrinklæber var let at bearbejde, når de anvendes som et stillads til epikardial celle levering og fikserede celler blev fastholdt på overfladen af infarktområdet indtil afslutningen af den kirurgiske procedure. Selv retentionstiden af cellerne var ude af fokus af denne undersøgelse og ville kræve yderligere undersøgelser er det blevet foreslået, at matricen tillader forbedret myocardial fastholdelse af implanterede celler 11-14. Vask ud af celler under hjertekirurgi sammentrækning, samt hypoxiske og inflammatoriske miljø, kan til dels forklare den hurtige clearance. Disse ulemper kan blive reduceret, når celler er forbundet med en matrix.
De vigtigste tekniske udfordringer vedrørte kirurgisk håndtering afen solid biograft. Hvis matricen er stiv og ubøjelige, bør fiksering med suturer blive begunstiget. De følgende kritiske trin bør overvejes for en vellykket procedure. For det første bør der gives en særlig opmærksomhed under thoracotomi at undgå at bryde ribbenene. For det andet bør overskydende lim fjernes forsigtigt for at undgå vedhæftning af andre væv. Endelig en standardiseret ligatur positionering er vigtig, da det kan reducere variation i infarktstørrelse. En transmural infarkt kan opnås, når LAD er ligeret til 4 mm under atrium.
Konklusionen er, at dobbelt thoracotomi udgjorde en sikker kirurgisk procedure med lav dødelighed, tilstrækkelig adgang til det bankende hjerte for behandling program, og derfor vil favorisere optimering af den eksperimentelle planlægning og reduceret antal dyr tab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Prof Hendrik Tevaearai og Institut for kardiovaskulær kirurgi for finansiel støtte til den indledende del af undersøgelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polysorb 3-0 suture | Covidien | UL 204 | |
| Polysorb 5-0 suture | Covidien | UL 202 | |
| Surgipro II 7-0 Suture | Covidien | VP904X | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| Inspira Advanced Volume Controlled Ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Dumont #7 Forceps | FST Germany | 11274-20 | |
| Fibrin Sealant | Baxter | 1501441 | TISSEEL Glue, Frozen -20 °C |
| Castroviejo Eye Specula | Harvard Apparatus | 72-8925 | use as retractor for the ribs |
| IMDM GlutaMAX | Gibco | 31980 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| FBS | PAA Clone | A15-101 | |
| Bone Scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
| Red Blood Cell Lysis Solution | Gentra Systems | D-50k1 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Stem Cell Technology | 7920 |
References
- Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
- Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
- Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
- Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
- Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
- Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
- Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
- Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
- Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
- Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
- Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
- Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).
