Summary
Эмбриональные нейроны рождаются в вентрикулярной зоне нервной трубки, но мигрируют достичь соответствующих целей. Branchiomotor лице (ФБМ) нейроны полезной моделью для изучения миграцию нейронов. Этот протокол описывает Wholemount Экс Vivo культуры мышиного эмбриона hindbrains исследовать механизмы, которые регулируют FBM миграции.
Abstract
Эмбриональные нейроны рождаются в вентрикулярной зоне мозга, но впоследствии перейти на новые направления для достижения соответствующих целей. Расшифровка молекулярные сигналы, которые совместно направлять миграцию нейронов в эмбриональном мозге Поэтому важно понять, как сложные нейронные сети, сформировать который позже поддерживает послеродовой жизни. Branchiomotor лице (ФБМ) нейроны в мышь эмбриона заднего мозга мигрируют из ромбомере (г) 4 каудально, чтобы сформировать парные лица ядер в R6-производного области заднего мозга. Здесь мы предоставляем подробный протокол для Wholemount экс естественных культуры мышиного эмбриона hindbrains подходящих для расследования сигнальных путей, которые регулируют FBM миграции. В этом методе, hindbrains эмбрионов E11.5 мыши рассекали и культивировали в открытом подготовки книги на культуре клеток вставок в течение 24 часов. В течение этого времени FBM нейроны мигрировать в направлении каудально R6 и может подвергаться функции блокирования антител и небольшой moleculэс в культуральной среде или гепарина бисером, нагруженных рекомбинантных белков для изучения роли для путей, причастных к руководящим миграцию нейронов сигнализации.
Introduction
Эмбриональные нейроны рождаются в вентрикулярной зоне мозга, но впоследствии перейти на новые направления для достижения соответствующих целевых регионов, которые находятся на большом расстоянии. Правильное позиционирование нейронных клеточных тел в соответствующих местах вдоль спинно-вентральной и передне-задней оси развивающегося мозга имеет важное значение для правильного подключения, выживание и функции этих нейронов после миграционной стадии 1-4. Подобно молекулярных механизмов, которые контролируют аксонов 5-7, комбинаторные наборы притяжения и отталкивания киев, как полагают, чтобы направлять мигрирующих нейронов 1,8. Однако из-за взаимодействия нескольких типов клеток, сигналы, контролирующие миграцию нейронов были широко изучены менее, чем участвует в аксонов, которые могут быть изучены клеточно автономно. Развивающийся заднего мозга позвоночных была использована в нескольких недавних исследований, чтобы понять молекулярные и клеточные механизмыиз миграции нейронов, например, в куриных, мыши и рыбок данио 1-4,9. Этот орган состоит из нескольких различных типов нейронов, в том числе несколько подтипов precerebellar и моторных нейронов 5,7,10,11.
Hindbrain motorneuron рождаются в вентрикулярной зоне, близкой к донной, и они дифференцируются в специфические подмножества в соответствии с их ромбомере происхождения 1,12. Branchiomotor лица (ФБМ) нейроны образуются в ромбомере (R) 4 в заднем мозге и расширить свои аксоны дорсально через точки выхода r4 во второй жаберной дуги для иннервации мышцы лица 2,9,13. FBM нейроны рыбок данио и мышей обеспечивают превосходные модели для изучения молекулярных и клеточных механизмов миграции нейронов в процессе, который легко визуализируется, потому что эти нейроны воспроизводимо перемещать их somata в пространственно-временной четко определенного процесса. У мышей, FBM нейроны сначала мигрируют ЦАСноситься через R5 и то и каудально и вентрально, чтобы достигнуть их окончательную позицию по пиальных стороне заднего мозга на территории R6, где они образуют парные ядра черепного нерва VII-(VIIN) 10,11,14. У рыбок данио FBM нейроны первоначально мигрируют вентрально, а затем изменить направление на границе R4-R5 продолжить миграцию к пиальных поверхности в ламинином-зависимым образом 4,12,15,16. Этот переход происходит в течение нескольких дней в разработки и может быть разделен на этапах тангенциальной и радиальной миграции, что позволяет идентифицировать молекулы, которые опосредуют эти два различных процесса. В противоположность этому, FBM нейроны мембране цыпленка мозге остаются в r4 3,13,17-19.
Во время их миграции FBM нейронов могут быть идентифицированы, как и другие типы или моторных нейронов, через их экспрессии фактора транскрипции homoeodomain островок 1 (Isl1) 14. Таким образом, Wholemount иммунофлюоресценции окрашивание или в гибридизация для этого маркера на разных стадиях развития показывает явное миграционный поток FBM somata, простирающуюся от r4-R6 в данио или мыши 4,15,16. Кроме того, люминесцентные трансгенные журналисты, такие как Isl1-GFP были использованы в качестве подходящих инструментов для визуализации миграции FBM нейронов у рыбок данио 3,17-19. В дополнение к их пригодности для работы с изображениями, многие исследователи изучили миграцию FBM нейронов в развивающихся данио, потому что их свободно живущие эмбрионы можно легко манипулировать с методами клеточной трансплантации и фармакологических соединений, применяемых непосредственно в аквариумную воду. В отличие от этого, эмбрион мыши развивается заключен в матке, исключающие имплантацию бисером, несущих сигналы наведения или администрацию функциональных блокировки антител, которые не пересекают плацентарный барьер. Кроме того, фармакологические соединения, вводимые беременной матери может иметь ипжелаемые побочные эффекты, которые могут косвенно нарушают эмбриогенеза. Обход это ограничение, мы разработали Экс Vivo метод культуры для всей заднего мозга мыши, совместимый с ФБМ нейрона миграции и выживания в течение 24 ч после культивирующий в искусственной среде 7,16. Этот метод позволяет легко фармакологической манипуляции, имплантацию бисером, несущих сигналы наведения или управления функциональных блокировки антител, а также может быть адаптирована для изучения миграции других нейронов подтипов в заднем мозге на разных стадиях развития.
Protocol
1. Дополнительно: Подготовка Affi-гель гепарин бисер (гель бусы) для FBM Пробирной достопримечательности
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка гелевые шарики минимум за 1 день до начала процедуры эксплантов.
- Промыть 100 мкл гель гепарином шарик суспензии стерильной PBS в течение 20 мин на ролик при комнатной температуре (RT).
- Пелле бусины в настольную центрифугу течение 5 мин при 13000 х г. Добавить стерильной PBS и повторите процедуру 4x.
- После последней промывки, удалить PBS и впитывать шарики в небольшом объеме стерильного раствора, содержащего рекомбинантный белок выбора, заботясь, чтобы покрыть шарики с раствором. Этот протокол использует 100 нг / мкл рекомбинантного человеческого VEGF165 в PBS, чтобы воспроизвести ранее опубликованной эксперимент 16.
- Инкубируйте гель гепарином шарики с рекомбинантного белкового раствора в течение не менее 12 ч и максимум 1 недели на ролик при 4 ° С.
2. Покрытие культуры Insertс
Заднего мозга экспланты культивируют на Corning культуры вставляет с размером пор 8 мкм, или эквивалентные вставками. Культура вставки могут быть повторно использованы после завершения протокола, если они промывают дистиллированной водой, стерилизуют этанолом и хранили в 70% этаноле до необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в капюшоне потока в стерильных условиях.
- Подготовка эксплантатов культуральной среды, состоящей из Neurobasal среде с добавлением В27 (20 мкл / мл), глюкоза (6 мг / мл) и пенициллин / стрептомицин (5 мкг / мкл).
- Wash культура вставляет стерильной PBS в течение 5 мин и сухой в течение 5-10 мин под капотом потока.
- Положите одну культуру вставку в каждой отдельной скважине 12well пластины. Примечание: вставки, возможно, потребуется небольшой толчок, чтобы плотно в колодец.
- Покройте культуры вставки с 10-20 мкг / мл мыши ламинином в Neurobasal среды и поместить их в инкубаторе для тканевых культур (37 ° С, 5% СО
3. Рассечение Hindbrains от E11.5 эмбрионов мыши
- Cull приуроченный беременной женщины мышь с этической точки зрения утвержденной процедурой на эмбриональный день (E) 11,5 и поместить в матку, содержащий эмбрионов в 100 мм пластиковую чашку с ледяной среде L15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги рассечение должны выполняться в ледяной L15. - Использование рассекает микроскопом и Дюмон часовщик щипцы номер 5, рвать матки мышечной стенки выставить эмбрионов, отпустите каждый эмбрион, разорвать пуповину, и осторожно удалите желточный мешок.
- С помощью пластмассовой пипетки Пастера с открытия широким отверстием, передать каждый эмбрион в чистую пластиковую чашку с ледяной L15.
- Использование Дюмон щипцы, обезглавить эмбрион чуть выше передних конечностей. Если эксперимент требует генотипирование эмбрионов, собирать образцы тканей для изоляции геномной ДНК (например, небольшой Piecе желточного мешка или кончика хвоста 16,20).
- Поверните голову спинной стороной вверх и определить 4-е желудочек, которая покрыта тонким слоем ткани (рис. 2В). Тщательно проколоть roofplate и начинают очистить его каудально вдоль средней линии над задней части заднего мозга и спинного мозга, а рострально над мозга. Задний мозг должен теперь быть подвержены (рис. 2в).
- Тщательно дразнить от оставшегося головы мезенхиму и любые мозговые оболочки, которые прикреплены к пиальных стороне заднего мозга (рис. 2D).
- Удалить среднего мозга и ткани спинного мозга, так что задний мозг разворачивается и может лежать ровно в подготовке открытая книга (Рисунок 2E).
- Использование широким отверстием пластик пипетки Пастера, передать каждый расчлененный заднего мозга к 12-луночный планшет, содержащий ледяной L15 и хранить их на льду, пока все hindbrains не были расчленены.
- Использование широким отверстием пластик пипетки Пастера, трансфер грехGLE заднего мозга в пустую чашку, держа его открытую подготовку книги, желудочковая стороной вверх, в капле приближенного 100 мкл L15.
- Трансфер несколько мкл инкубированных гель гепарин бисера к тому же капли. Примечание: Так как размеры бисера являются переменными, целесообразно передать около 10 бусин, а затем выбрать оптимальный размер для трансплантации в заднем мозге.
- Сделать небольшой разрыв в заднем мозге ткани и тщательно вставить 1-3 гелевые шарики в ткани заднего мозга на уровне r5 / 6, примерно на полпути между средней линии и бокового края заднего мозга, снижение их в ткани так, чтобы шарик находится как раз под заднего мозга поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура вскрытия не может занять от 5-20 мин / заднего мозга, в зависимости от опыта, и может растянуться на длительный период, если пометы большие, во всяком случае, hindbrains должно быть в культуре не более 3 ч вскрытия навсегда Результаты.
4. Задний мозгЭксплантата Культура
- Снять пластину, содержащую культуру вставки из инкубатора, аспирация решение ламинином покрытия.
- Положите одну культуру вставки в отдельную посуду культуры, наполненной ледяной L15 и, используя широким отверстием пластик пипетки Пастера, передать каждый заднего мозга вентральной стороной вверх на культуры вставки (рис. 2G). Задний мозг должен полностью лежать плашмя на вставки мембраны.
- Осторожно поднимите культуры вставку из чашки и промокните его несколько раз на бумаге чистой ткани для удаления избытка жидкости. Этот процесс гарантирует, что задний мозг придерживается культуры вставки в плоской, открытой подготовке книги. Если задний мозг сворачивается, ее ткань может необратимо расти вместе.
- Заполните оригинальный 12-луночный планшет с 500 мкл предварительно нагретой питательных сред и поместите вставку обратно в этот колодезь. Тщательно отрегулируйте громкость с помощью другого 400-600 мкл СМИ просто покрыть задний мозг, гарантируя, что задний мозг не плаваетот мембраны. Если он плывет, вернитесь к шагу 4.4 и повторять, пока задний мозг не остается прикрепленным к мембране.
- На данном этапе можно добавить биологические ингибиторы, представляющих интерес для СМИ, чтобы изучить их влияние на миграции FBM нейронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантации шарики или введение других методов лечения, рекомендуется поддерживать по крайней мере, 2 ключевых эксплантов в нормальных условиях роста на эксперимент, чтобы убедиться, что эксперимент был создан успешно. - Выдержите эксплантов для 24-30 ч в инкубаторе для тканевых культур (37 ° C, 5% СО 2).
5. Wholemount Иммунофлуоресцентное Окрашивание заднего мозга эксплантов
- Аспирируйте СМИ из каждой лунки, промыть в PBS и исправить в течение 2 часов при 4 ° С при осторожном перемешивании в ледяной 4% формальдегида (свежеприготовленный или только разморозить 4% параформальдегида, растворенного в PBS). Примечание: Не пытайтесь удалить задний мозг из культуральной вставки до фиксациизавершена.
- Промыть 3 раза ЗФР. Тщательно очистите hindbrains от культуры вставками использованием Дюмон щипцы. Некоторые экспланты трудно слезть, но, как правило, поднимается, слегка надавливая через раз изгнав PBS из пипетки.
- Перенесите hindbrains до 2,0 мл с круглым дном трубы для иммунофлуоресценции маркировки. Проницаемыми hindbrains в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) в PBS, содержащем 0,1% Тритон-100 (ПБТ) с нежным прокатки.
- Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в PBT, содержащей 10% инактивированной нагреванием нормальной козьей сывороткой с нежным прокатки.
- Инкубировать эксплантов с нежным прокатки при 4 ° С в течение 5 дней с первичным антителом, специфичным для Isl1, разбавленного 1:100 в PBT, содержащим 1% инактивированной нагреванием нормальной козьей сывороткой.
- Вымойте эксплантов в РТ 4x с PBT в течение 15 мин каждый.
- Инкубировать эксплантов с нежным прокатки при комнатной температуре в течение 3 часов с флуорофора-конъюгированного козьего антитела против мышиных антител (например, Alexa Fluor 488 козьего антимышь, разводили 1:200) в PBT, содержащим 1% инактивированной нагреванием нормальной козьей сывороткой.
- Вымойте экспланты 4x при комнатной температуре с PBT в течение 15 мин каждая с нежным прокатки.
- Постфиксный эксплантов в 4% формальдегиде в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Покройте стекло с 3 слоями черной изоленты и акциза с помощью скальпеля небольшой квадратной слоистой лентой, чтобы создать карман для эксплантов; альтернативно, использовать депрессия предметное стекло.
- Установите каждый задний мозг в SlowFade реагента в одном кармане и накройте покровным стеклом, тщательно избегая пузырьков воздуха ловушки и изображения с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы иммуноокрашивания, в гибридизация с рибонуклеотидных, которые признают FBMS (т.е. Isl1 или Phox2b) может быть использован для визуализации FBM нейроны 16,21.
Резюме шагов и сроков
Временный спаривания, чтобы получить E11.25 беременности: ~ 14 дней
Дополнительно: бисера подготовка (Protocoл 1): ~ 2 часа, за день до изоляции эмбриона
Подготовка культуры вставки и СМИ (протокол 2): ~ 30 мин, до изоляции эмбрион
Изоляция эмбрионов и задний мозг рассечение (шаги 3.1-3.4): ~ 10 мин / эмбрион
Hindbrain рассечение (шаги 3.5-3.7): ~ 5-10 мин / заднего мозга
Процедура эксплантата (шаги 3,8-3,9): ~ 5-10 мин / заднего мозга
Дополнительно: шарик имплантация (шаги 3.10-3.11): ~ 5-10 мин / заднего мозга
Эксплантата культура (шаг 4.7): 24 часа в сутки
Фиксация для окрашивания антител (шаг 5.1): 2 часа
Процедура окраски и обработки изображений (протокол 5): 5 дней
Representative Results
В этом разделе показаны примеры результатов, которые можно получить, изучая FBM нейронов миграции в заднем мозге мыши через экс естественных условиях культуры. Мы покажем, что нейроны FBM в эксплантированных hindbrains от дня 11 эмбрионов мыши сначала пройти по касательной миграции (рис. 3А), а затем начинают собирать лица двигателя ядра (рис. 3б), похожий на их поведение в период внутриутробного развития (см. рисунок 1). Кроме того, мы показали, что имплантация VEGF165 пропитанной шарик привлекает FBM нейронов (рис. 3C и 3D), как было показано ранее 16. Важно отметить, что этот протокол позволяет изучать FBM миграции в отсутствие кровеносных сосудов или факторов сосудов, полученных которые могут повлиять FBM миграции в период внутриутробного развития, так как nonperfused сосудистую вырождается в культуре 16. Таким образом, неспецифическая мечения клеток крови наблюдается при использовании антитела Isl1 мыши на только чтоне изолированные hindbrains мыши (рис. 1), больше не существует в заднего мозга ткани после 24 часов в культуре (3А-F). Наконец, мы показываем два примера hindbrains, которые не были эксплантированных правильно и поэтому содержат FBM нейроны в ненормальном распределении, либо потому, что задний мозг не эксплантированных достаточно скоро после выделения эмбрионов (рис. 3Е) или потому, что задний мозг ткани сложить в Transwell ( Рисунок 3F).
Рисунок 1. ФБМ нейрон миграция конфокальной Z-стек hindbrains дикого типа мыши после Isl1 Wholemount иммунного и flatmounting;.. Задний мозг средней линии обозначается звездочкой во всех панелей (А) желудочков поверхность из E11.5 заднего мозга в область, содержащая Isl1-позитивных нейронов FBM (стрелка), демонстрируя свою тангенциальную миграцию из R4-R6;. положение R4, R5 и R6 обозначен (А ') пиальных поверхность одной половины одного и того же заднего мозга в области, содержащей зачаток . одного из парных ядер FBM (обозначенных VIIN), а также других Isl1-положительных популяций нейронов (В) желудочков поверхность из E12.5 заднего мозга, содержащего FBM нейроны, которые мигрируют по касательной (стрелку); стрелкой указывают пример кровеносного сосуда, содержащего циркулирующие клетки, которые неспецифически меченых перекрестной реакции с анти-мыши вторичного антитела, используемого для выявления антител IgG мыши Isl1 (В '). пиальных поверхность одной половины одного и того же E12.5 мозге, который содержит один из парных ядер FBM. Срединная линия обозначается звездочкой в каждой панели. Шкала бар (все панели): 200 мкм. В, брюшная, Р, относящийся к мягкой мозговой оболочке./ 51397fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. E11.5 мыши задний мозг рассечение и экс естественных культуры. (AE) Ключевые шаги в протоколе вскрытия E11.5 заднего мозга; масштабной линейки:. 1 мм (А) Руководитель эмбриона после его отрезать от остальной части эмбриона на уровне передних конечностей (В) Ростральная часть. голова была удалена, а остальная часть головы ткани расположены так, что 4-й желудочек (стрелка) был ориентирован вверх. (С) Крыша 4-го желудочка отслаивали и задний мозг подвергался пилинг ткани под заднего мозга от рострально и каудально. (D) пиальных мембрана была удалена (обратите внимание, что в этом эксдостаточно, некоторые шейного отдела спинного мозга (SC) ткань по-прежнему прикреплен к заднего мозга). (E) Превышение среднего мозга (MB) и спинного мозга (SC) ткань была удалена, чтобы сохранить только задний мозг. (F) Культура вставки были покрыты ламинином и помещали в 12 хорошо планшета для культуры ткани в. (G) Каждый заднего мозга помещали на одной вставкой и покрыты СМИ. (H) Схематическое представление пути, пройденного миграции FBM нейронов (синие) во время 24 часов культуры. Нажмите здесь чтобы просмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Мышь задний мозг экс естественных культуры. (А, В) E11.5 заднего мозга культивировали в течение 24 часов и immunofluoresc видимому помечены для Isl1, чтобы проиллюстрировать FBM нейронов миграции в эксплантате, оба желудочка (А) и относящийся к мягкой мозговой оболочке (B) стороны заднего мозга показаны (C, D) E11.5 однопометница hindbrains культивировали в присутствии гепарина имплантированного шарика пропитанной. в PBS (С) или VEGF165 (D); отметить, что FBM нейроны мигрировали в направлении и на VEGF165 шарик, а поток мигрирующий поэтому расширена каудально по сравнению с необработанной стороне того же заднего мозга или заднего мозга, содержащего шарик управления (E. , F) Примеры неудовлетворительных E11.5 заднего мозга эксплантов, в которых FBMS не эмигрировали из R4 (E), или в котором задний мозг ткани сложить во культуры (F). Срединная линия обозначается звездочкой в каждой панели. Шкала бар (для всех панелей): 200 мкм. В, брюшная, Р, относящийся к мягкой мозговой оболочке."> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Discussion
Этот протокол описывает Wholemount культуру hindbrains E11.5 мыши в системе Transwell изучения миграции FBM нейронов. Этот протокол позволяет мыши заднего мозга motorneurons быть сдержанным живым и миграции в течение 24 часов, что позволяет Экс Vivo манипуляции. Этот метод имеет многочисленные экспериментальные преимущества для исследователей, стремящихся определить молекулярные и клеточные механизмы миграции нейронов. В то время как традиционные анализы миграции эксплантов небольшие кусочки нервной ткани в матрицу на чашки для культивирования и включить наблюдение отдельных нейронов как они реагируют на внешних раздражителей, основным преимуществом Transwell анализа является его пригодность для манипулирования мигрирующие нейроны в среде хоста органов и, следовательно, более физиологический контекст. Важно отметить, что вещества могут быть легко применены к экс виво заднего мозга эксплантатов, чтобы проверить их действие на миграцию нейронов, обходя возможные побочные эффекты, связанные с administeзвонить эти вещества для беременной мыши. Наконец, экс естественных модель также позволяет тестировать веществ, которые не пересекают плацентарный барьер, например, функции блокировки антител. Благодаря этим преимуществам, экс естественных задний мозг культура является альтернативным и дополнительный метод к использованию эмбрионов рыбок данио, которые можно лечить с помощью водорастворимых малых молекул в аквариумной воде, или в маточно электропорации эмбриональных мозгов, которая требует использования специализированной оборудование и труднее, чем мастер техники культуры, описанной здесь. Еще одно преимущество протоколу, описанному здесь является его податливость к имплантации шарики, пропитанные рекомбинантного белка или других реагентов, поэтому позволяет применение стандартного эмбрионального методике, разработанной для управления куриного эмбриона в мышиной модели миграции нейронов. В частности, экс виво модели культуры могут быть применены к hindbrains генно-инженерных мышей дефектныхTive в специфических молекул, вовлеченных в миграцию нейронов, таких как рост или факторов руководство рецепторов, и в сочетании с имплантатами бортовых проверить, если реагирование на лигандов теряется. В дополнение к фармакологической манипуляции, экс виво протокол культура также может быть адаптирована к электропорации векторы экспрессии, которые могут манипулировать экспрессии генов, представляющих интерес; соответствующие методы электропорации были описаны ранее 22,23. Этот протокол также может быть адаптирована для визуализации нейронов миграцию покадровой микроскопии в задний мозг эксплантатов трансгенных мышей, содержащих флуоресцентно меченных FBM нейронов, например Isl1-Cre; Rosa26Yfp 21. Наконец, этот протокол также может быть использован для изучения других типов миграции нейронов в мозге, такие как те, которые формируют нижней оливы, хотя для этого потребуется использование hindbrains на старых эмбриональных стадиях и может потребовать культуру до 48 часов, в зависимости от нейронной жизнеспособности Критические шаги и способы их устранения Для успеха этого протокола, крайне важно, чтобы эмбрионы собраны на ранней стадии день E11.5, ближе к E11.25, когда ФБМ нейрон миграция только начинается. Тем не менее, это не всегда можно уловить эмбрионов на этой стадии развития из-за естественной изменчивости спаривания мышей, и, соответственно, могут быть некоторые различия в той мере, в FBM миграции между различными экспериментами. Изменчивость в FBM миграции могут быть также отмечено, если эксперимент не завершен в пределах периода времени, назначенного около 3 ч, как можно видеть на рисунке 3E. Hindbrain ткани из мышиных эмбрионов E11.25 является деликатным. Когда рассечения и в течение всей процедуры эксплантов, важно, чтобы не разорвать задний мозг ткани в области, из R4-R6, где FBM нейроны расположены. В связи с деликатным характером диссПроцесс АЗДЕЛ, и потому, что скорость, с которой hindbrains помещаются в культуре влияет результат, процедура может занять пару практике бежит к хозяину, в частности перед драгоценные образцы или реагенты используются. Наконец, важно, чтобы задний мозг ткань помещают в открытой конфигурации книги на культуре вставки, так как складывание заднего мозга ткани в процессе культивирования будет препятствовать нормальному миграции FBM (см. рис 3F).
Disclosures
Ни один из авторов не конкурирующие интересы или конфликтующие интересы.
Acknowledgments
МТ поддерживается кандидат студенчества [Ref. 092839/Z/10/Z] и CR на Новый следователь Award [Ref. 095623/Z/11/Z] из Wellcome Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Lumsden, A., Keynes, R. Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain. Nature. 337 (6206), 424-428 (1989).
- Chandrasekhar, A. Turning heads: development of vertebrate branchiomotor neurons. Dev. Dyn. 229 (1), 143-161 (2004).
- Mapp, O. M., Wanner, S. J., Rohrschneider, M. R., Prince, V. E. Prickle1b mediates interpretation of migratory cues during zebrafish facial branchiomotor neuron migration. Dev. Dyn. 239 (6), 1596-1608 (2010).
- Glasco, D. M., Sittaramane, V., et al. The mouse Wnt/PCP protein Vangl2 is necessary for migration of facial branchiomotor neurons, and functions independently of Dishevelled. Biol, D. ev. 369 (2), 211-222 (2012).
- Marillat, V., Sabatier, C., et al. The Slit Receptor Rig-1/Robo3 Controls Midline Crossing by Hindbrain Precerebellar Neurons and Axons. Neuron. 43 (1), 69-79 (2004).
- Dickson, B. J.
- Vivancos, V., Chen, P., et al. Wnt activity guides facial branchiomotor neuron migration and involves the PCP pathway and JNK and ROCK kinases. Neural Dev. 4, 7 (2009).
- Guan, K. -L., Rao, Y. Signalling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 941-956 (2003).
- Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat. Rev. 8 (11), 859-871 (2007).
- Garel, S., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P. Control of the migratory pathway of facial branchiomotor neurones. Development. 127 (24), 5297-5307 (2000).
- Gavalas, A., Ruhrberg, C., Livet, J., Henderson, C. E., Krumlauf, R. Neuronal defects in the hindbrain of Hoxa1, Hoxb1 and Hoxb2 mutants reflect regulatory interactions among these Hox genes. Development. 130 (23), 5663-5679 (2003).
- Grant, P. K., Moens, C. B. The neuroepithelial basement membrane serves as a boundary and a substrate for neuron migration in the zebrafish hindbrain. Neural Dev. 5, 9 (2010).
- Lumsden, A. Segmentation and compartition in the early avian hindbrain. Mech. Dev. 121 (9), 1081-1088 (2004).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Qu, Y., Glasco, D. M., et al. Atypical cadherins Celsr1-3 differentially regulate migration of facial branchiomotor neurons in mice. J. Neurosci. 30 (28), 9392-9401 (2010).
- Schwarz, Q., Gu, C., et al. Vascular endothelial growth factor controls neuronal migration and cooperates with Sema3A to pattern distinct compartments of the facial nerve. Genes Dev. 18 (22), 2822-2834 (2004).
- Stockinger, P., Maître, J. -L., Heisenberg, C. -P. Defective neuroepithelial cell cohesion affects tangential branchiomotor neuron migration in the zebrafish neural tube. Development. 138 (21), 4673-4683 (2011).
- Wanner, S. J., Prince, V. E. Axon tracts guide zebrafish facial branchiomotor neuron migration through the hindbrain. Development. , (2013).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Laird, P. W., Zijderveld, A., Linders, K., Rudnicki, M. A., Jaenisch, R., Berns, A. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Res. 19 (15), 4293 (1991).
- Srinivas, S., Watanabe, T., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1 (1), 4 (2001).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J. Vis. Exp. (74), (2013).
- Holland, P. J., George, A. M., Worrell, L. T. C., Landsberg, R. L. In vitro electroporation of the lower rhombic lip of midgestation mouse embryos. J. Vis. Exp. (66), (2012).
