Summary
भ्रूण न्यूरॉन्स न्यूरल ट्यूब का निलय क्षेत्र में पैदा हुए, लेकिन उपयुक्त लक्ष्य तक पहुँचने की ओर पलायन कर रहे हैं. चेहरे branchiomotor (FBM) न्यूरॉन्स neuronal प्रवास अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हैं. इस प्रोटोकॉल FBM प्रवास को विनियमित तंत्र है कि जांच करने के लिए माउस भ्रूण hindbrains की wholemount पूर्व vivo संस्कृति का वर्णन करता है.
Abstract
भ्रूण न्यूरॉन्स मस्तिष्क के निलय क्षेत्र में पैदा हुआ था, लेकिन बाद में उपयुक्त लक्ष्य तक पहुंचने के लिए नए स्थलों की ओर पलायन कर रहे हैं. मिलकर भ्रूण के मस्तिष्क में neuronal प्रवास गाइड कि आणविक संकेतों का गूढ़ रहस्य जटिल तंत्रिका नेटवर्क बाद में प्रसव के बाद जीवन का समर्थन है जो फार्म कैसे को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. माउस भ्रूण पश्चमस्तिष्क में चेहरे branchiomotor (FBM) न्यूरॉन्स पश्चमस्तिष्क की R6 व्युत्पन्न क्षेत्र में बनती चेहरे नाभिक के लिए फार्म rhombomere (नि.) 4 दुमदारी से विस्थापित. यहाँ हम FBM प्रवास को विनियमित कि संकेत दे रास्ते की जांच के लिए उपयुक्त माउस भ्रूण hindbrains की wholemount पूर्व vivo संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इस विधि में, E11.5 माउस भ्रूण की hindbrains 24 घंटे के लिए सेल संस्कृति आवेषण पर एक खुली किताब की तैयारी में विच्छेदित और सुसंस्कृत हैं. इस समय के दौरान, FBM न्यूरॉन्स R6 की ओर दुमदारी विस्थापित और समारोह अवरुद्ध एंटीबॉडी और छोटे molecul से अवगत कराया जा सकता हैneuronal प्रवास का मार्गदर्शन में फंसा रास्ते संकेतन के लिए भूमिका की जांच करने के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ भरी हुई संस्कृति मीडिया या हेपरिन मोती में ते.
Introduction
भ्रूण न्यूरॉन्स मस्तिष्क के निलय क्षेत्र में पैदा हुआ था, लेकिन बाद में एक बड़ी दूरी पर स्थित हैं कि उचित लक्ष्य क्षेत्रों तक पहुँचने के लिए नए स्थलों की ओर पलायन कर रहे हैं. विकासशील मस्तिष्क के dorso-उदर और पूर्वकाल पीछे axes साथ उपयुक्त स्थानों में neuronal सेल शरीर की सही स्थिति प्रवासी चरण 1-4 के बाद सही तारों, अस्तित्व, और इन न्यूरॉन्स के समारोह के लिए आवश्यक है. अक्षतंतु मार्गदर्शन 5-7 कि नियंत्रण आणविक तंत्र के लिए इसी प्रकार, आकर्षक और प्रतिकारक संकेत के मिश्रित सेट पलायन न्यूरॉन्स 1,8 मार्गदर्शन करने के लिए लगा रहे हैं. बहरहाल, कारण अनेक प्रकार की कोशिकाओं की बातचीत के लिए, neuronal प्रवास को नियंत्रित करने के संकेत कम बड़े पैमाने पर स्वायत्त सेल का अध्ययन किया जा सकता है जो अक्षतंतु मार्गदर्शन, में शामिल लोगों से अध्ययन किया गया है. रीढ़ की विकासशील पश्चमस्तिष्क आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने के लिए हाल ही में कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया हैneuronal प्रवास की, लड़की, माउस, और zebrafish 1-4,9 में उदाहरण के लिए. इस अंग कई precerebellar के उपप्रकार और मोटर न्यूरॉन्स 5,7,10,11 सहित न्यूरॉन्स के कई अलग अलग प्रकार के होते हैं.
पश्चमस्तिष्क motorneuron floorplate के करीब निलय क्षेत्र में पैदा हुआ था, और वे मूल 1,12 के अपने rhombomere के अनुसार विशिष्ट सबसेट में अंतर कर रहे हैं. चेहरे branchiomotor (FBM) न्यूरॉन्स पश्चमस्तिष्क में rhombomere (नि.) 4 में उत्पन्न होता है और चेहरे की मांसपेशियों 2,9,13 अंदर आना करने के लिए दूसरा गिल चाप में पीछे की ओर एक r4 बाहर निकलने के बिंदु के माध्यम से उनके axons का विस्तार कर रहे हैं. Zebrafish और चूहों की FBM न्यूरॉन्स इन न्यूरॉन्स reproducibly एक spatiotemporally अच्छी तरह से परिभाषित प्रक्रिया में उनके somata सरकाना क्योंकि, आसानी से कल्पना की है कि एक प्रक्रिया में neuronal प्रवास के आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल उपलब्ध कराते हैं. चूहों में, FBM न्यूरॉन्स पहले Cau विस्थापितइठलाना R5 के माध्यम से और फिर दोनों दुमदारी और पेट के बल वे VIIth कपाल तंत्रिका (VIIn) 10,11,14 की बनती नाभिक फार्म जहां R6, के क्षेत्र में पश्चमस्तिष्क की pial पक्ष पर अपनी अंतिम स्थिति तक पहुँचने के लिए. Zebrafish में, FBM न्यूरॉन्स शुरू में पेट के बल विस्थापित और फिर एक laminin निर्भर तरीके 4,12,15,16 में pial सतह की ओर पलायन जारी रखने के लिए R4-R5 सीमा पर दिशा बदलते हैं. इस प्रवास के विकास में कई दिनों की अवधि में आय और इन दो अलग प्रक्रियाओं है कि मध्यस्थता अणुओं की पहचान की अनुमति, स्पर्शरेखा और रेडियल प्रवास के चरणों में विभाजित किया जा सकता है. इसके विपरीत, भ्रूण लड़की पश्चमस्तिष्क की FBM न्यूरॉन्स r4 3,13,17-19 में रहते हैं.
उनके प्रवास के दौरान, FBM न्यूरॉन्स homoeodomain प्रतिलेखन कारक आइलेट 1 (ISL1) 14 की उनकी अभिव्यक्ति के माध्यम से, अन्य प्रकार या मोटर न्यूरॉन्स की तरह, पहचाना जा सकता है. इस प्रकार, wholविभिन्न विकासात्मक चरणों में इस मार्कर के लिए emount immunofluorescence धुंधला या स्वस्थानी संकरण में zebrafish या माउस 4,15,16 में R6 को r4 से देने FBM somata के विशिष्ट प्रवासी धारा से पता चलता है. इसके अलावा, इस तरह के ISL1-GFP जैसे फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक संवाददाताओं zebrafish 3,17-19 में FBM न्यूरॉन्स पलायन कल्पना करने के लिए उपयुक्त उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. उनके मुक्त रहने वाले भ्रूण कोशिका प्रत्यारोपण तकनीक और मछलीघर पानी को सीधे आवेदन औषधीय यौगिकों के साथ आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है क्योंकि इमेजिंग के लिए उनकी उपयुक्तता के अलावा, कई जांचकर्ताओं, zebrafish विकसित करने में FBM न्यूरॉन्स के प्रवास अध्ययन किया है. इसके विपरीत, माउस भ्रूण मार्गदर्शन cues या अपरा बाधा पार नहीं है कि समारोह अवरुद्ध एंटीबॉडी के प्रशासन को ले जाने मोतियों का आरोपण precluding, गर्भाशय में संलग्न विकसित करता है. इसके अलावा, गर्भवती मां को दिलाई औषधीय यौगिकों संयुक्त राष्ट्र हो सकता हैपरोक्ष रूप से embryogenesis ख़राब कर सकते हैं कि वांछित दुष्प्रभाव. इस सीमा को धोखा, हम 7,16 explanting के बाद 24 घंटे के लिए FBM न्यूरॉन प्रवास और अस्तित्व के साथ संगत है कि पूरे माउस पश्चमस्तिष्क के लिए एक पूर्व vivo संस्कृति विधि विकसित की है. इस विधि आसान औषधीय हेरफेर, मार्गदर्शन cues या समारोह अवरुद्ध एंटीबॉडी के प्रशासन को ले जाने मोतियों का आरोपण की अनुमति देता है और यह भी विभिन्न विकासात्मक चरणों में पश्चमस्तिष्क में अन्य neuronal उपप्रकार के प्रवास अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
1. वैकल्पिक: FBM आकर्षण परख के लिए Affi जेल हेपरिन मोती (जेल मोती) तैयार करें
नोट: explant प्रक्रिया शुरू करने से पहले कम से कम 1 दिन जेल मोती तैयार.
- कमरे के तापमान (आर टी) पर एक रोलर पर 20 मिनट के लिए बाँझ पीबीएस के साथ 100 μl जेल हेपरिन मनका निलंबन धो लें.
- 13,000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में गोली मोती. बाँझ पीबीएस जोड़ें और वाशिंग प्रक्रिया 4x दोहराने.
- अंतिम धोने के बाद, पीबीएस हटाने और समाधान के साथ मोती को कवर करने के ख्याल रख रही है, चुनाव की पुनः संयोजक प्रोटीन युक्त एक बाँझ समाधान की एक छोटी मात्रा में मोती लेना. इस प्रोटोकॉल एक पहले प्रकाशित प्रयोग 16 को पुन: पेश करने के लिए पीबीएस में 100 μl / एनजी पुनः संयोजक मानव VEGF165 का उपयोग करता है.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोलर पर 12 घंटे की एक न्यूनतम के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन समाधान और 1 सप्ताह के एक अधिकतम के साथ जेल हेपरिन मोती सेते
2. संस्कृति डालने की कोटिंगएस
पश्चमस्तिष्क explants Corning संस्कृति पर संवर्धित कर रहे हैं एक 8 माइक्रोन रोमकूप आकार, या समकक्ष आवेषण के साथ सम्मिलित करता है. संस्कृति आवेषण वे, आसुत जल से धोया इथेनॉल के साथ निष्फल, और जब तक जरूरत 70% इथेनॉल में जमा हो जाती है, बशर्ते प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद पुन: उपयोग किया जा सकता है.
नोट: निम्न चरणों बाँझ शर्तों के तहत एक प्रवाह हुड में बाहर किया जाना चाहिए.
- B27 (20 μl / एमएल) के साथ पूरक Neurobasal मध्यम से मिलकर explant संस्कृति मीडिया तैयार करें, ग्लूकोज (6 मिलीग्राम / एमएल) और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 ग्राम / μl).
- धो संस्कृति 5 मिनट और प्रवाह हुड के तहत 5-10 मिनट के लिए सूखी के लिए बाँझ पीबीएस के साथ सम्मिलित करता है.
- एक 12well थाली के प्रत्येक व्यक्ति के कुएं में एक संस्कृति डालने रखें. नोट: सम्मिलित करता है और साथ में कसकर फिट करने के लिए एक छोटा सा धक्का पड़ सकता है.
- Neurobasal मध्यम में 10-20 ग्राम / एमएल माउस laminin साथ संस्कृति आवेषण कवर और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ (एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में उन्हें जगह
3. E11.5 माउस भ्रूण से Hindbrains के विच्छेदन
- भ्रूण दिन पर एक नैतिकता की दृष्टि से अनुमोदित प्रक्रिया (ई) 11.5 के साथ समय गर्भवती महिला माउस चुनना और ठंडा l15 के माध्यम से एक 100 मिमी प्लास्टिक पकवान में भ्रूण युक्त गर्भाशय जगह है.
नोट: सभी विच्छेदन कदम ठंडा l15 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. - एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग और ड्यूमॉन्ट घड़ीसाज़, भ्रूण बेनकाब करने के लिए गर्भाशय मांसपेशियों दीवार आंसू प्रत्येक भ्रूण जारी, गर्भनाल तोड़, और ध्यान से जर्दी थैली हटाने, संख्या 5 संदंश.
- एक विस्तृत बोर खोलने के साथ एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, ठंडा L15 के साथ एक साफ प्लास्टिक पकवान में प्रत्येक भ्रूण स्थानांतरण.
- Dumont संदंश का प्रयोग, बस forelimbs ऊपर भ्रूण सिर काटना. प्रयोग भ्रूण की जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है, जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए ऊतक के नमूने लेने (जैसे एक छोटे piecजर्दी थैली या पूंछ टिप 16,20) के ए.
- ऊपर सिर पृष्ठीय पक्ष मुड़ें और एक पतली ऊतक परत (चित्रा 2B) द्वारा कवर किया जाता है, जो 4 वें निलय, पहचान. ध्यान roofplate पियर्स और पीछे पश्चमस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊपर midline साथ दुमदारी इसे दूर छील करने के लिए शुरू हो, और rostrally मध्यमस्तिष्क से अधिक. पश्चमस्तिष्क अब (चित्रा -2) उजागर किया जाना चाहिए.
- ध्यान शेष सिर mesenchyme और पश्चमस्तिष्क (चित्रा 2 डी) के pial पक्ष से जुड़े होते हैं कि किसी भी तानिका दूर तंग.
- पश्चमस्तिष्क फहराने इतना है कि मध्यमस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को निकालें और एक खुली किताब की तैयारी (चित्रा 2 ई) में फ्लैट झूठ कर सकते हैं.
- एक विस्तृत बोर प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, ठंडा L15 युक्त एक 12 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक विच्छेदित पश्चमस्तिष्क हस्तांतरण और सभी hindbrains विच्छेदित कर दिया गया है जब तक बर्फ पर उन्हें दुकान.
- एक विस्तृत बोर प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, एक पाप हस्तांतरणयह लगभग 100 μl L15 की एक छोटी बूंद में एक खुली किताब की तैयारी, निलय पक्ष रखते हुए एक खाली पकवान GLE पश्चमस्तिष्क,.
- एक ही छोटी बूंद के लिए incubated जेल हेपरिन मोतियों की कुछ microliters स्थानांतरण. नोट: मोती के आकार चर रहे हैं, क्योंकि यह लगभग 10 मोती हस्तांतरण और फिर पश्चमस्तिष्क में प्रत्यारोपण के लिए एक इष्टतम आकार का चयन करने की सलाह दी जाती है.
- पश्चमस्तिष्क ऊतक के एक छोटे से आंसू करें और ध्यान से ऊतक में उन्हें कम, मध्यम रेखा और पश्चमस्तिष्क के पार्श्व किनारे के बीच आधे रास्ते के बारे में, R5 / 6 के स्तर पर पश्चमस्तिष्क ऊतक में 1-3 जेल मोती डालने इतना है कि मनका बस पश्चमस्तिष्क सतह के नीचे रखा जाता है.
नोट: विच्छेदन की प्रक्रिया के अनुभव के आधार पर, 5-20 मिनट / पश्चमस्तिष्क के बीच ले सकते हैं, और litters बड़े हैं एक विस्तारित अवधि में खिंचाव हो सकता है, किसी भी मामले में, hindbrains अच्छे के लिए 3 घंटा पोस्टमार्टम से नहीं रह संस्कृति में होना चाहिए परिणाम.
4. पश्चमस्तिष्कExplant संस्कृति
- इनक्यूबेटर से संस्कृति आवेषण युक्त थाली निकालें, laminin कोटिंग समाधान aspirate.
- संस्कृति डालने (चित्रा 2 जी) पर ऊपर प्रत्येक पश्चमस्तिष्क उदर पक्ष हस्तांतरण, एक विस्तृत बोर प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग, ठंडा L15 और से भरा एक अलग संस्कृति डिश में एक संस्कृति डालने रखें. पश्चमस्तिष्क डालने झिल्ली पर पूरी तरह से फ्लैट झूठ चाहिए.
- ध्यान से पकवान से संस्कृति डालने उठा और अतिरिक्त तरल निकालने के लिए स्वच्छ टिशू पेपर पर यह कई बार थपका. इस प्रक्रिया पश्चमस्तिष्क एक फ्लैट, खुली किताब की तैयारी में संस्कृति डालने का पालन करता है कि यह सुनिश्चित करता है. पश्चमस्तिष्क कर्ल है, तो इसका ऊतक अचल साथ लंबी हो सकती है.
- 500 μl prewarmed संस्कृति मीडिया के साथ मूल 12 अच्छी तरह से थाली भरें और अच्छी तरह से इस में वापस डालने जगह. ध्यान पश्चमस्तिष्क नाव नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, बस पश्चमस्तिष्क कवर करने के लिए मीडिया के एक और 400-600 μl के साथ मात्रा को समायोजितझिल्ली बंद. यह तैरता है, 4.4 कदम और पश्चमस्तिष्क झिल्ली के साथ जुड़ा रहता है जब तक दोहराने की वापसी.
- इस स्तर पर, यह FBM न्यूरॉन्स के प्रवास पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए मीडिया के लिए ब्याज की जैविक inhibitors जोड़ने के लिए संभव है.
नोट: मोती दाखिल या अन्य उपचार का प्रबंध करते हैं, तो यह प्रयोग सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के प्रति सामान्य विकास शर्तों के तहत कम से कम 2 नियंत्रण explants बनाए रखने की सिफारिश की है. - एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) में 24-30 घंटे के लिए explants सेते हैं.
5. पश्चमस्तिष्क explants के wholemount immunofluorescent धुंधला
- प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया aspirate, पीबीएस में कुल्ला और ठंडा 4% formaldehyde (पीबीएस में भंग 4% paraformaldehyde के हौसले से तैयार या हौसले thawed) में कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए तय कर लो. नोट: निर्धारण से पहले संस्कृति डालने से पश्चमस्तिष्क दूर करने की कोशिश न करेंपूरा हो गया है.
- पीबीएस के साथ 3x कुल्ला. ध्यान Dumont संदंश का उपयोग संस्कृति आवेषण से hindbrains छील. कुछ explants बंद छील करने के लिए कठिन हैं, लेकिन आम तौर पर बार बार एक पिपेट से पीबीएस को खदेड़ने के माध्यम से कोमल दबाव लागू करने के द्वारा उठाया जा सकता है.
- Immunofluorescence लेबलिंग के लिए 2.0 मिलीलीटर दौर तली ट्यूबों को hindbrains स्थानांतरण. कोमल रोलिंग के साथ 0.1% TritonX-100 (पीबीटी) युक्त पीबीएस में कमरे के तापमान (आर टी) पर 30 मिनट के लिए hindbrains Permeabilize.
- कोमल रोलिंग के साथ 10% गर्मी निष्क्रिय सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीटी में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- ISL1 के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 5 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल रोलिंग के साथ explants सेते हैं, 1% गर्मी निष्क्रिय सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीटी में 1:100 पतला.
- 15 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी साथ आरटी 4x में explants धो लें.
- Fluorophore संयुग्मित बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी (जैसे एलेक्सा Fluor 488 बकरी विरोधी के साथ 3 घंटे के लिए आरटी पर कोमल रोलिंग के साथ explants सेतेमाउस, 1% गर्मी निष्क्रिय सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीटी) में 1:200 पतला.
- Explants कोमल रोलिंग के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीटी साथ आरटी पर 4x धो लें.
- आरटी पर 30 मिनट के लिए 4% formaldehyde में explants postfix.
- Explants के लिए एक जेब बनाने के लिए 3 काले बिजली के टेप की परतों और एक छुरी स्तरित टेप का एक छोटा सा वर्ग के साथ आबकारी साथ एक गिलास स्लाइड कवर; वैकल्पिक रूप से, एक अवसाद कांच स्लाइड का उपयोग करें.
- एक जेब में SlowFade अभिकर्मक में प्रत्येक पश्चमस्तिष्क माउंट और ध्यान से एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग कर जाल हवाई बुलबुले और छवि को परहेज, एक गिलास coverslip के साथ कवर किया.
नोट: immunostaining के लिए एक विकल्प के रूप में, FBMs (यानी Isl1 या Phox2b) समझते हैं कि riboprobes साथ स्वस्थानी संकरण में FBM न्यूरॉन्स 16,21 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
कदम और समय का सारांश
~ 14 दिन: E11.25 गर्भधारण प्राप्त करने के लिए संभोग के समय समाप्त
वैकल्पिक: मनका तैयारी (Protocoएल 1): भ्रूण अलगाव से पहले दिन पर ~ 2 घंटा,
संस्कृति सम्मिलित करता है और मीडिया (प्रोटोकॉल 2) तैयार: ~ 30 मिनट, पहले भ्रूण अलगाव
भ्रूण अलगाव और पश्चमस्तिष्क विच्छेदन (3.1-3.4 कदम): ~ 10 मिनट / भ्रूण
पश्चमस्तिष्क विच्छेदन (3.5-3.7 कदम): ~ 5-10 मिनट / पश्चमस्तिष्क
Explant प्रक्रिया (3.8-3.9 कदम): ~ 5-10 मिनट / पश्चमस्तिष्क
वैकल्पिक: मनका आरोपण (3.10-3.11 कदम): ~ 5-10 मिनट / पश्चमस्तिष्क
Explant संस्कृति (कदम 4.7): 24 घंटे
एंटीबॉडी धुंधला के लिए फिक्सेशन (5.1 कदम): 2 घंटा
धुंधला प्रक्रिया और इमेजिंग (प्रोटोकॉल 5): 5 दिन
Representative Results
यह खंड पूर्व vivo संस्कृति के माध्यम से माउस पश्चमस्तिष्क में FBM न्यूरॉन प्रवास का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है कि परिणाम के उदाहरण दिखाता है. हम 11 दिन माउस भ्रूण से explanted hindbrains में FBM न्यूरॉन्स पहले एक स्पर्शरेखा प्रवास (चित्रा 3) से गुजरना और फिर utero में उनके व्यवहार के लिए इसी तरह चेहरे का मोटर नाभिक (चित्रा 3 बी), (1 चित्र देखें) को इकट्ठा करने के लिए शुरू करते हैं. हम आगे पहले 16 के रूप में दिखाया एक VEGF165 से लथपथ मनका के आरोपण, FBM न्यूरॉन्स (आंकड़े -3 सी और 3 डी) को आकर्षित करती है कि प्रदर्शित करता है. Nonperfused vasculature संस्कृति 16 में घिनौना क्योंकि महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल, रक्त वाहिकाओं या utero में FBM प्रवास को प्रभावित कर सकते कि पोत व्युत्पन्न कारकों के अभाव में FBM प्रवास का अध्ययन कर देता है. हौसले पर ISL1 माउस एंटीबॉडी का उपयोग इस प्रकार, जब unspecific रक्त कोशिका लेबलिंग मनायापृथक माउस hindbrains (चित्रा 1) संस्कृति (आंकड़े 3 ए एफ) में 24 घंटे के बाद नहीं रह पश्चमस्तिष्क ऊतकों में मौजूद है. पश्चमस्तिष्क भ्रूण अलगाव (चित्रा 3E) के बाद या जल्द ही explanted नहीं किया गया था, क्योंकि अंत में, हम या तो सही ढंग से explanted और इसलिए एक असामान्य वितरण में FBM न्यूरॉन्स होते नहीं थे कि hindbrains के दो उदाहरण दिखा क्योंकि (transwell में मुड़ा पश्चमस्तिष्क ऊतक चित्रा 3F).
चित्रा 1. FBM न्यूरॉन प्रवास ISL1 wholemount immunolabeling और flatmounting बाद wildtype माउस hindbrains के Confocal Z-ढेर;.. में एक E11.5 पश्चमस्तिष्क की पश्चमस्तिष्क midline सभी पैनलों में एक तारांकित साथ संकेत दिया है (ए) निलय सतह R6 को r4 से उनके स्पर्शरेखा प्रवास का प्रदर्शन, ISL1 पॉजिटिव FBM न्यूरॉन्स (तीर) युक्त क्षेत्र;. मूलरूप वाले क्षेत्र में एक ही पश्चमस्तिष्क के एक आधे से R4, R5 और R6 की स्थिति संकेत दिया है (ए ') pial सतह . tangentially (तीर) पलायन कर रहे हैं कि FBM न्यूरॉन्स युक्त एक E12.5 पश्चमस्तिष्क की (VIIn के साथ संकेत) बनती FBM नाभिक में से एक है, साथ ही अन्य ISL1 पॉजिटिव न्यूरॉन आबादी का (बी) निलय सतह; Arrowhead एक उदाहरण से संकेत मिलता है unspecifically ISL1 माउस आईजीजी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के पार प्रतिक्रिया से चिह्नित कर रहे हैं कि परिसंचारी कोशिकाओं से युक्त रक्त वाहिनियों की. (बी) शामिल हैं जो एक ही E12.5 पश्चमस्तिष्क, के एक आधे के pial सतह बनती FBM नाभिक में से एक. midline प्रत्येक कक्ष में एक asterisk के साथ संकेत दिया है. स्केल बार (सभी पैनलों): 200 माइक्रोन. वी, उदर, पी, pial./ 51397fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. E11.5 माउस पश्चमस्तिष्क विच्छेदन और पूर्व vivo संस्कृति. (एई) E11.5 पश्चमस्तिष्क विच्छेदन प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम; पैमाने पर पट्टी:. इसे दूर forelimb स्तर पर भ्रूण के शेष से कट गया था के बाद भ्रूण की 1 मिमी (ए) सिर (बी) के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा. सिर हटा दिया है और 4 वें वेंट्रिकल (तीर) ऊपर की ओर उन्मुख किया गया था इतना है कि सिर ऊतक के शेष तैनात. (सी) 4 वें वेंट्रिकल की छत दूर खुली थी, और पश्चमस्तिष्क दूर पश्चमस्तिष्क नीचे के ऊतकों छीलने से अवगत कराया गया था rostrally और दुमदारी. (डी) pial झिल्ली (यह पूर्व में ध्यान दें कि हटा दिया गया थापर्याप्त, कुछ ग्रीवा रीढ़ की हड्डी (अनुसूचित जाति) ऊतक) पश्चमस्तिष्क से जुड़ी रह गया है. (ई) अतिरिक्त मध्यमस्तिष्क (एमबी) और रीढ़ की हड्डी (अनुसूचित जाति) ऊतक सिर्फ पश्चमस्तिष्क बनाए रखने के लिए निकाल दिया गया है. (एफ) संस्कृति आवेषण के साथ लेपित किया गया laminin और एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में रखा. (जी) प्रत्येक पश्चमस्तिष्क एक डालने पर रखा जाता है और मीडिया के साथ कवर किया गया था. (एच) संस्कृति के 24 घंटे के दौरान FBM न्यूरॉन्स (नीला) पलायन द्वारा उठाए गए पथ के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. यहां क्लिक करें बड़ी छवि को देखने के लिए.
चित्रा 3. माउस पश्चमस्तिष्क पूर्व vivo संस्कृति. (ए, बी) एक E11.5 पश्चमस्तिष्क 24 घंटा और immunofluoresc के लिए सुसंस्कृत था ently एक explant में FBM न्यूरॉन प्रवास को वर्णन करने ISL1 के लिए लेबल, निलय (ए) और pial पश्चमस्तिष्क (बी) दोनों पक्षों दिखाए जाते हैं (सी, डी) E11.5 littermate hindbrains लथपथ प्रत्यारोपित हेपरिन मनका की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे. पीबीएस (सी) या VEGF165 (डी) में; FBM न्यूरॉन्स की दिशा में और VEGF165 मनका पर चले गए, और पलायन धारा इसलिए एक ही पश्चमस्तिष्क या नियंत्रण मनका युक्त पश्चमस्तिष्क की अनुपचारित पक्ष की तुलना में आगे दुमदारी बढ़ाया ध्यान दें कि (ई. , असंतोषजनक E11.5 पश्चमस्तिष्क FBMs r4 से प्रवास नहीं है जिसमें explants, (ई), या एफ) उदाहरण जिसमें संस्कृति (एफ) के दौरान मुड़ा पश्चमस्तिष्क ऊतक. midline प्रत्येक कक्ष में एक asterisk के साथ संकेत दिया है. (सभी पैनलों के लिए) स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन. वी, उदर, पी, pial."> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
इस प्रोटोकॉल FBM न्यूरॉन्स के प्रवास अध्ययन करने के लिए एक transwell प्रणाली में E11.5 माउस hindbrains की wholemount संस्कृति का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल माउस पश्चमस्तिष्क motorneurons पूर्व vivo हेरफेर सक्षम करने, 24 घंटे की अवधि के लिए जीवित है और पलायन रखा जा सकता है. इस विधि neuronal प्रवास के आणविक और सेलुलर तंत्र की पहचान करने की मांग जांचकर्ताओं के लिए कई प्रयोगात्मक फायदे हैं. पारंपरिक प्रवास assays संस्कृति व्यंजन पर मैट्रिक्स में छोटे तंत्रिका ऊतक टुकड़े explant और वे एक्सोजेनस उत्तेजनाओं का जवाब के रूप में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स का अवलोकन सक्षम जबकि, transwell परख की एक प्रमुख लाभ अपने मेजबान अंग वातावरण में पलायन न्यूरॉन्स में हेरफेर करने के लिए उपयुक्तता और इसलिए एक अधिक है शारीरिक संदर्भ. महत्वपूर्ण बात है, पदार्थ आसानी से administe के साथ जुड़े संभावित दुष्प्रभावों को धोखा, neuronal प्रवास पर उनके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए पूर्व vivo पश्चमस्तिष्क explants करने के लिए लागू किया जा सकता हैएक गर्भवती माउस को इन पदार्थों की अंगूठी. अंत में, पूर्व vivo मॉडल भी इस तरह के समारोह अवरुद्ध एंटीबॉडी के रूप में अपरा बाधा पार नहीं करते कि पदार्थों के परीक्षण की अनुमति देता है. कारण इन फायदों के लिए, पूर्व vivo पश्चमस्तिष्क संस्कृति मछलीघर पानी में, या विशेष के उपयोग की आवश्यकता है जो भ्रूण के दिमाग की utero electroporation, में करने के लिए पानी में घुलनशील छोटे अणुओं के साथ इलाज किया जा सकता है जो zebrafish भ्रूण, का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक और पूरक विधि प्रदान करता है उपकरण और यहां वर्णित संस्कृति तकनीक से गुरु को और अधिक कठिन है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह इसलिए neuronal प्रवास के एक माउस मॉडल को लड़की भ्रूण हेरफेर करने के लिए विकसित की एक मानक embryological विधि के आवेदन की अनुमति, पुनः संयोजक प्रोटीन या अन्य अभिकर्मकों में लथपथ मोती दाखिल करने के लिए अपने ज़िम्मा है. विशेष रूप से, पूर्व vivo संस्कृति मॉडल अनुवांशिक इंजीनियर चूहों की hindbrains लिए लागू किया जा सकता है defecइस तरह के विकास या मार्गदर्शन कारक रिसेप्टर्स के रूप में neuronal प्रवास में फंसा विशिष्ट अणुओं, में सक्रिय है, और ligands के लिए जवाबदेही खो दिया है अगर परीक्षण करने के लिए मनका प्रत्यारोपण के साथ संयुक्त. औषधीय हेरफेर के अलावा, पूर्व vivo संस्कृति प्रोटोकॉल भी ब्याज के जीनों की अभिव्यक्ति में हेरफेर सकता है कि अभिव्यक्ति वैक्टर electroporate लिए अनुकूलित किया जा सकता है, electroporation के लिए उपयुक्त तरीकों पहले 22,23 वर्णित किया गया है. Rosa26Yfp 21; इस प्रोटोकॉल fluorescently लेबल FBM न्यूरॉन्स, जैसे Isl1-Cre युक्त ट्रांसजेनिक चूहों से पश्चमस्तिष्क explants में समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी द्वारा न्यूरॉन प्रवास कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस पुराने भ्रूण चरणों में hindbrains के उपयोग की आवश्यकता होगी और अप करने के लिए 48 घंटे के लिए संस्कृति की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि अंत में, इस प्रोटोकॉल भी ऐसे अवर जैतून कि फार्म के रूप में उन पश्चमस्तिष्क में पलायन न्यूरॉन्स के अन्य प्रकार, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, neuronal व्यवहार्यता पर निर्भर करता है गंभीर कदम और निवारण इस प्रोटोकॉल की सफलता के लिए यह भ्रूण FBM न्यूरॉन प्रवास अभी शुरू हुई है जब E11.25, के करीब दिन E11.5, पर जल्दी एकत्र कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. हालांकि, यह कारण चूहों की प्राकृतिक संभोग परिवर्तनशीलता को इस विकास के चरण में भ्रूण को पकड़ने के लिए, और उसके अनुसार, विभिन्न प्रयोगों के बीच FBM प्रवास के विस्तार में कुछ परिवर्तनशीलता हो सकता है वहाँ हमेशा संभव नहीं है. प्रयोग चित्रा 3E में देखा जा सकता है, के रूप में नियत समय सीमा के भीतर के बारे में 3 घंटे पूरा नहीं किया गया तो FBM प्रवास में परिवर्तनशीलता भी देखा जा सकता है. E11.25 माउस भ्रूण से पश्चमस्तिष्क ऊतक नाजुक है. विदारक और explant प्रक्रिया के दौरान, जब वह FBM न्यूरॉन्स स्थित हैं जहां r4-R6 से क्षेत्रों में पश्चमस्तिष्क ऊतक आंसू नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. कारण Diss की नाजुक प्रकृति कोhindbrains संस्कृति में रखा जाता है जिस गति से परिणाम को प्रभावित करती है ection प्रक्रिया, और क्योंकि, प्रक्रिया कीमती नमूने या अभिकर्मकों इस्तेमाल कर रहे हैं विशेष रूप से पहले, अभ्यास के एक जोड़े मास्टर को चलाता लग सकता है. अंत में, यह संस्कृति दौरान पश्चमस्तिष्क ऊतक की तह (चित्रा 3F देखें) सामान्य FBM प्रवास कर पाएगा क्योंकि पश्चमस्तिष्क ऊतक, संस्कृति डालने पर एक खुली किताब विन्यास में रखा गया है कि महत्वपूर्ण है.
Disclosures
लेखकों में से कोई भी हितों या परस्पर विरोधी हितों प्रतिस्पर्धा है.
Acknowledgments
मीट्रिक टन एक पीएचडी छात्रवृत्ति [रेफरी द्वारा समर्थित है. एक नई अन्वेषक पुरस्कार [रेफरी द्वारा 092839/Z/10/Z] और सीआर. 095623/Z/11/Z] वेलकम ट्रस्ट से.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
| Cell culture plates, 12-well | Thermo Scientific | 150628 | |
| Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
| 15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
| Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
| Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
| Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
| B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
| Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
| Recombinant human VEGF165 | R&D Systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80 °C |
| Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |
References
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