Abstract
Um progresso considerável foi feito durante a última década para a identificação e caracterização de enzimas envolvidas na síntese (ciclases diguanylate) e degradação (fosfodiesterase) do segundo mensageiro c-di-GMP. Em contraste, há pouca informação disponível sobre os mecanismos moleculares e componentes celulares através do qual essa molécula de sinalização regula uma gama diversificada de processos celulares. A maioria das proteínas efetoras conhecidos pertencem à família Pilz ou estão degenerados ciclases diguanylate ou phosphodiesterases que desistiram de catálise e adotaram a função efetora. Assim, para definir melhor a rede c-di-GMP celular numa vasta gama de bactérias, métodos experimentais são necessários para identificar e validar novos efectores para os quais fiável em predições silico falham.
Recentemente, desenvolvemos um romance Captura Espectrometria de Massa Compound (CCMS) de base tecnológica como uma ferramenta poderosa paraidentificar e caracterizar bioquimicamente as proteínas de ligação c-di-GMP. Esta técnica tem sido relatada previamente para ser aplicável a uma vasta gama de organismos 1. Aqui nós damos uma descrição detalhada do protocolo que nós utilizamos para investigar tais componentes de sinalização. Como um exemplo, usamos a Pseudomonas aeruginosa, um agente patogénico oportunista, em que c-di-GMP desempenha um papel crítico no controle de biofilme e virulência. CCMS identificados 74% (38/51) dos componentes conhecidos ou previstos da rede c-di-GMP. Este estudo explica o procedimento CCMS em detalhe, e estabelece-lo como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar novos componentes envolvidos na pequena molécula de sinalização.
Introduction
c-di-GMP é um segundo mensageiro chave utilizados pela maioria das bactérias para controlar vários aspectos do seu crescimento e comportamento. Por exemplo, c-di-GMP regula a progressão do ciclo celular, motilidade e a expressão de exopolissacáridos e adesinas de superfície 2-4. Através da coordenação de tais processos c-di-GMP promove a formação de biofilme, um processo que está associado com infecções crónicas de uma variedade de bactérias patogénicas 5. c-di-GMP é sintetizado por enzimas chamadas ciclases diguanylate (PED) que abrigam um domínio GGDEF catalítico 4. Alguns PED possuem um site de inibidor que regula a atividade para baixo ciclase após ligação c-di-GMP. A degradação da proteína c-di-GMP é catalisada por duas classes distintas de fosfodiesterases (PDEs) ou albergando um EAL catalítica ou HD-GYP domínio 6,7.
A maioria das proteínas efectoras conhecidos que se ligam directamente c-di-GMP pertencem a uma das três classes de proteínas: catalíticaGGDEF ou EAL domínios aliado inativos e domínios Pilz, pequenos interruptores moleculares que passam por mudanças de conformação após ligação c-di-GMP 8. PEDs, Pilz PDEs e proteínas estão bem caracterizados e os seus domínios pode ser prevista em silício de forma relativamente segura. Um interesse particular agora está focado na identificação de novas classes de efetores c-di-GMP. Alguns efetores c-di-GMP com diferentes motivos de ligação foram descritos recentemente, como o CRP / FNR Bcam1349 família de proteínas em Burkholderia cenocepacia ou o FleQ regulador de transcrição em P. aeruginosa 9,10. Além disso, riboswitches específico GMP-c-di foram recentemente identificados e mostrado para controlar a expressão de genes de uma forma c-di-GMP-dependente 11. Os motivos c-di-GMP ligação dos diferentes efetores são apenas mal conservada fazer previsões de bioinformática de tais proteínas difícil. Para resolver este problema, foi desenvolvido um método bioquímico, o qual se baseia na utilização de uma spe c-di-GMPCaptura espe- Composto combinada com a espectrometria de massa 1,12,13.
Nós projetamos recentemente um romance trivalente c-di-GMP Captura Composto (CDG-CC, Figura 1) 1. Este andaime química é composta por: 1) um radical de c-di-GMP utilizado como isca para capturar c-di-GMP proteínas de ligação, 2) um grupo reactivo UV-fotoactivável usadas para reticular o CDG-CC para as proteínas ligadas e 3) uma biotina para isolar as proteínas capturadas usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. O CDG-CC podem ser usadas para capturar directamente e especificamente efectores c-di-GMP partir de uma mistura complexa de macromoléculas como lisados celulares. Composto de captura com base e abordagens químicas proteómica à base ter sido previamente relatado para ser aplicável a uma vasta gama de organismos, por exemplo, Caulobacter crescentus, Salmonella typhimurium enterica serovar e P. aeruginosa 1,14.
Neste trabalho metodológico,nós fornecemos uma descrição em profundidade do procedimento CCMS utilizando extratos de P. aeruginosa como um exemplo. Este estudo estabelece CCMS como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar bioquimicamente novos componentes envolvidos na sinalização molécula pequena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação Lysate
- Crescer P. aeruginosa células em LB para a densidade óptica desejada.
NOTA: Para obter orientação: usar ≈ 100 ml Cultura / amostra para culturas em fase estacionária e ≈ 500 ml cultur / sample para culturas em fase log (OD 600 nm = 0,5). - Pelete por centrifugação durante 20 min a 5.000 x g.
- Ressuspender 0,5-1 g de sedimento em 1 ml de tampão de lise (6,7 mM de MES, HEPES 6,7 mM, NaCl 200 mM, Kac 6,7 mM, DDT 1 mM, pH 7,5) e adicionar inibidor de protease (mini completo, isento de EDTA), bem como DNaseI.
- Lyse as células por três passagens através de uma célula de pressão francesa, a 20.000 psi (ver lista de materiais).
- Ultra-centrifugação do ligado celular a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
- Salve o sobrenadante (vá para o passo 2).
- Lave o pellet com 1 ml 1x tampão de lise por pipetagem cima e para baixo.
- Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
- Flash congelar o sedimento emazoto líquido e armazenar a -20 ° C até ser utilizado para a captura de proteínas membranares (ver etapa 3).
2. Remoção de nucleótidos livres c-di-GMP e Outros (Fração Solúvel Only)
- Lave uma coluna PD10 dessalinização (ver Lista de Materiais) com 10 ml de tampão de lise frio.
- Verter o sobrenadante (≈ 1 ml) para a PD10, a fim de remover nucleótidos.
- Elui-se com 4 ml de tampão de lise frio (500 ul passos).
- Selecione as frações mais concentrados, como determinado pelo ensaio de Bradford, e reuni-los.
(Apenas Fracção de Membrana) 3. pelota e ressuspensão Solubilização
- Ressuspender o sedimento em 500 a 1.000 ul de 1x tampão de captura (sem detergente) (ver Tabela 1).
NOTA: O pellet é difícil para voltar a suspender. Aconselha-se a primeira pipeta cima e para baixo com uma pipeta para voltar a suspender aproximadamente o pellet, em seguida, usar uma seringa de 27 G para bem homogeneizar a solução. - Adicionar 1% (w / v) n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM).
- Incubar a 4 ° C durante pelo menos 2 horas (ou O / N) a uma roda rotativa.
- Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 1 h a 4 ° C.
- Colha o sobrenadante.
Medição da Concentração 4. Protein
- Medir a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford (por ensaio BCA para a fracção de membrana).
- Definir a concentração total de proteína de 10 mg / ml.
5. Captura
- Misturar 300 ug de proteína com 1 mM de PIB, GTP, ATP, CTP, e 20 ul de tampão de captura de 5x (100 mM de HEPES, 250 mM de KAc, MgAc 50 mM, 5% de glicerol, pH 7,5) (Tabela 1). Ajustar o volume da reacção para 100 ul com H 2 O.
NOTA: o volume total inclui o volume do CDG-CC e c-di-GMP no caso do controlo de competição (ver passo 5.3 e Tabela 2).
NOTA: Todos os experimentos foram realizados em 200 &# 181; l de 12 tubos de tiras de PCR (Thermo Scientific).
NOTA: para a fração de membrana, certifique-se de manter sempre a concentração DDM acima da concentração micelar crítica (0,01% w / v) até a etapa de solubilização de proteínas em 8 M ureia (Passo 7.1). - Incubar a 4 ° C durante 30 min numa roda rotativa.
- Adicionar 10 uM CDG-CC (concentração final).
NOTA: incluir um controle sem CDG-CC (referido como "controle de talão"), e um controle suplementado com 1 mM c-di-GMP ("o controlo da concorrência") (ver Tabela 2).
Nota: A concentração CDG-CC pode ser ajustado de 1 a 10? M. - Incubar a 4 ° C durante pelo menos 2 h (de N para a fracção S / membrana) sobre uma roda rotativa, no escuro.
- Depois de uma breve centrifugação, de ligação cruzada pela activação do grupo reactivo do CDG-CC com luz UV durante 4 minutos, utilizando uma CaproBox (ver Lista de Materiais, λ = 310 nm, irradiância ≥10 mW / cm², a distância da fonte = 2 cm),. Nota: Retire a tampa das tiras cross-linking anterior.
- Adicionar 25 ul de tampão de lavagem 5x (NaCl 5 M, Tris 250 mM, pH 7,5) e 50 uL de pérolas magnéticas de estreptavidina bem ressuspensos, homogeneizar suavemente.
- Incubar a 4 ° C durante 1 hora numa roda rotativa.
6. Passos de lavagem
NOTA: (Magnet: veja a lista de materiais). Comece com uma captura das esferas magnéticas na faixa tampa PCR, com o ímã. Em seguida, substituir a tira de PCR por um novo contendo a solução de lavagem seguinte. Remova o ímã e ressuspender as contas, e incubar 2 min. Spin down e substituir a tampa por uma nova tampa.
- As etapas de lavagem (fração solúvel apenas)
- Lavar 6 vezes em 200 ul de 1x tampão de lavagem.
- Lavar uma vez em 200 ul de grau HPLC de H 2 O.
- Lavar 6 vezes em 200 ul de 80% de acetonitrilo.
- Lavar duas vezes em 200 ul de grau HPLC de H 2 O.
- As etapas de lavagem (membrafração ne apenas)
- Lavar cinco vezes em 200 ul de 1x tampão de lavagem + 0,1% de DDM.
- Lavar duas vezes em 200 ul de 1x tampão de lavagem com 0,05% de DDM.
- Lavar uma vez em 200 ul de tampão de lavagem 1x + 0,025% DDM.
- Lavar uma vez em 200 ul de tampão de lavagem 1x + 0,0125% DDM.
- Lavar 3 vezes, com 200 ul de 100 mM de ABC (bicarbonato de amónio, NH 4 CO 3) + 2 M de ureia.
7. MS Preparação de amostras
- Ressuspender as contas (diretamente na tampa) em 20 ul ABC 100 mM (ABC mM 100 + 8 M uréia para a fração de membrana) e transferir para tubos de 1,5 ml.
- Fracção de membrana só: incubar a 60 ° C durante 5 min, agitando a 500 rpm.
- Adicionar 0,5 uL de 200 mM de TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) e incubar a 60 ° C durante 1 hora, agitando a 500 rpm. Arrefecer a 25 ° C.
- Adicionar 0,5 mL de 400 mM frescamente preparado iodoacetamida e incubar a 25 ° C durante 30 min, agitando umat e 500 rpm no escuro.
- Adicionar 0,5 uL de 0,5 M de N-acetil-cisteína e incubar a 25 ° C durante 10 min, agitando a 500 rpm.
- Fracção de membrana só: adicionar 1 ul Lys-C e incubar a 37 ° C, O / N.
- Adicionar 2 mg de tripsina e incubar O / N a 37 ° C, agitação a 500 rpm (envoltório em Parafilm para evitar a secagem).
Observação: as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C nesta fase.
NOTA: fracção de membrana só: adicionar ABC 100 mM para ajustar a concentração de ureia para <2 M antes da adição de tripsina. - Mexer um pouco abaixo dos tubos e recolher contas com o ímã.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml (repetir este passo se grânulos são deixados).
- Adicionam-se 5 ul de 5% de TFA (ácido trifluoroacético) + 1 ul de 2 M de HCl (15 mL de 5% de TFA + 5 ul de 2 M de HCl para a fracção de membrana).
- Condição colunas C18 Microspin (The Nest Group, MA, EUA) com 150 ml de acetonitrila (spin 20 segundos a 2.400 rpm).
- Equilibrate as colunas C18 duas vezes com 150 ul de 0,1% de TFA (20 segundos de centrifugação, 2.400 rpm).
- Carregar a amostra e girar 2 min, 2000 rpm.
- Recarregar o fluxo de passagem na coluna e repetir a etapa de fiação (2 min, 2000 rpm).
- Lavar 3 vezes com 150 ul de 0,1% de TFA, 5% de acetonitrilo (20 seg, 2.400 rpm).
- Tomar um novo tubo e eluir duas vezes com 150 ul de 0,1% de TFA, 50% de acetonitrilo (2 min, 2000 rpm).
- Secam-se os péptidos em uma velocidade vac.
- Ressuspender em 40 ul 98% de H 2 O, 2% de acetonitrilo, 0,15% de ácido fórmico.
- Sonicate 20 sec (ciclo de pulso de 0,5, amplitude de 100%; veja a lista de materiais) e spin down 5 seg, 12.000 rpm (centrífuga de bancada). Vortex 10 seg, e spin down 5 seg, 12.000 rpm. Transferir num frasco de HPLC para análise por LC-MS / MS.
- Congelar a -20 ° C.
Observação: as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C nesta fase.
8. LC-MS / MS Análise
- Executar um nano-LC (sistemas nano-LC) equed com uma coluna de RP-HPLC (75 mm x 37 cm) cheia com resina C18 (C18 mágica AQ 3 mm) usando um gradiente linear de 95% de solvente A (ácido fórmico a 0,15%, acetonitrilo a 2%) e 5% de solvente B ( 98% de acetonitrilo, ácido fórmico a 0,15%) para 35% de solvente B ao longo de 60 min a uma velocidade de fluxo de 0,2 mL / min.
- Analisar os péptidos utilizando LC-MS / MS (dupla pressão LTQ-Orbitrap Velos espectrómetro de massa, ligada a uma fonte iónica de electropulverização).
NOTA: O modo de aquisição de dados foi criado para obter uma alta resolução MS varredura na parte FT do espectrômetro de massa com uma resolução de 60.000 FWHM seguidos por varreduras MS / MS no ion trap linear dos 20 íons mais intensos. Para aumentar a eficiência de tentativas de MS / MS, o rastreio modus estado carregado foi activado para excluir não atribuído individualmente e carrega iões. Conluio dissociação induzida foi acionado quando o precursor ultrapassado contagem de íon 100. A duração da exclusão dinâmico foi ajustada para 30 seg. O tempo de acumulação de íons foi definido para 300 ms (MS) e 50ms (MS / MS).
9. Banco de Dados de Pesquisa
- Baixe o P. aeruginosa NCBI-banco de dados através da homepage do NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Converta os espectros MS bruto em mascote arquivos genéricos (MGF), utilizando a ferramenta de conversão MassMatrix ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Pesquisar neste arquivo mgf usando MASCOTE versão 2.3 contra o P. aeruginosa NCBI-banco de dados contendo a frente e entradas de proteína reversa de engodo.
- Executar uma na digestão de tripsina silico após lisina e arginina (a não ser seguido por prolina) tolerando dois perderam clivagens na peptídeos trípticos totalmente.
- Defina os parâmetros de pesquisa de banco de dados para permitir metioninas oxidada (15,99491 Da) como modificações variáveis e carboxyamidomethylation (57,021464 Da) de resíduos de cisteína como a modificação fixa. Para MASCOTE nos perscrutaing scans de alta resolução, definir a tolerância massa precursor para 15 ppm e definir a tolerância massa fragmento de 0,6 Da. Finalmente, a proteína definida FDR para 1%.
- Importe as pesquisas mascote do P. experimentos aeruginosa CCMS em Andaime (Proteomesoftware, versão 3), defina os parâmetros para obter uma proteína FDR perto de 1%, e extrair as contagens totais espectrais.
- Para os resultados representativos apresentados neste trabalho, foi utilizado um teste t pareado para comparar a experiência com o controle de concorrência, e só consideradas hits com um valor p inferior a 0,1, e uma relação de contagem espectral acima de 2 (Experimento contagens espectrais / espectral competição controle contagens).
- Os dados podem ser exportados em qualquer software de planilha para análise posterior.
10. livre-Label Quantificação
- Importe os arquivos brutos em software progênese LC-MS (Nonlinear Dynamics, versão 4.0).
- Efetue o alinhamento LC-MS e detecção de recurso em Setti padrãoNGS.
- Exportar os dados em formato de mgf progênese LC-MS.
- Pesquisar os espectros de MS / MS usando o MASCOTE contra o NCBI P. banco de dados contendo aeruginosa frente e entradas de proteína reversa de engodo.
- Importe os resultados da pesquisa de banco de dados em progênese LC-MS e mapear os peptídeos identificações para recursos MS1.
- Para a avaliação de dados (cálculo de níveis de significância, dobram-change rácios) foi utilizado o script ProteinSQAnalysis de SafeQuant (limiar: valor q abaixo de 0,1, relação de contagem espectral acima de 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para identificar novos efectores c-di-GMP em P. aeruginosa foi utilizado sistematicamente CCMS para analisar as frações solúvel e de membrana de P. aeruginosa PAO1 estirpe a partir de uma cultura em fase logarítmica (OD600 = 0,5). Aqui vamos resumir e discutir os resultados representativos desta expedição de pesca. Foram utilizados quatro réplicas biológicas independentes. Para cada experimento, foram utilizadas duas concentrações CDG-CC diferentes (5 mm e 10 mm). Para investigar a especificidade para, as experiências foram realizadas na presença ou ausência de uma mM c-di-GMP como concorrente e, por fim, com um controle de talão (isto é, sem CDG-CC) (Tabela 1).
Quando se segue o método descrito em detalhe acima (Figura 2) que produziu uma lista de proteínas capturadas num formato andaime. Prováveis contaminantes foram removidos. Isto incluiu as proteínas ribossomais, estreptavidina, tripsina, albumina do soro, queratina e outras proteínas humanas. A proteínaidentificação taxa de falsas descobertas (FDR) foi definido como 1%, utilizando o software de andaime, e os dados exportados para o Excel. O número de acesso fornecido pela andaime pode ser convertido em números de locos utilizando a função PROCV no Excel ligada a uma lista de P. números de locos aeruginosa. Nesta fase, a lista de ocorrências 768 compreende proteínas para a fracção solúvel e proteínas de 433 para a fracção de membrana. No entanto, a maioria das proteínas não são significativamente enriquecida no experimento de captura. Assim, as proteínas que são provavelmente capturadas não especificamente (positivo no controlo do grânulo ou apenas na presença de competidor de c-di-GMP) foram removidos. Calculamos uma relação contagem espectral entre o experimento captura e controle de concorrência e proteínas só consideradas com uma proporção maior do que dois. Além disso, utilizamos um teste t pareado na contagem espectrais para fornecer uma medida de significância entre a experiência de captura e controle de concorrência, e definir um limite de 0,1 permissiva. Por fim, Foram considerados apenas sucessos robustos com pelo menos quatro peptídeos identificados nos quatro experimentos para as concentrações de compostos 2 captura tomadas por completo. Estes critérios devem ser ajustadas de acordo com as necessidades e usando a verificada e prevista proteínas de ligação c-di-GMP como padrão para definir o limite. Após a triagem, a lista foi reduzida para 76 hits para a fração solúvel, e 133 proteínas para a fração de membrana. Isto incluiu 13 solúvel e 21 proteínas de membrana a partir de P. aeruginosa que são conhecidos ou previstos para ligar c-di-GMP (Tabela 2). As outras proteínas de membrana 63 solúvel e 112 são novas proteínas c-di-GMP de ligação putativos que não contêm um dos domínios de ligação a c-di-GMP conhecidos. Estas visitas têm agora de ser validada por meio de testes de sua ligação específica para c-di-GMP.
Em uma tela anterior, pescamos GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) e Gsp69 (PA1127) 1. Estas três proteínas foram clonadas, sobre-expresso, e purificada a partir deE. coli e pode ser validada para se ligar c-di-GMP em experiências de ligação cruzada utilizando UV-33 marcado com P c-di-GMP 15. Os Kd foram determinadas a 1,0, 2,0 e 6,9 uM respectivamente, indicando que, de facto novos efectores podem ser identificados usando CCMS.
Em adição a este exemplo representativo, foi utilizado CCMS com extractos de células colhidas a partir de diferentes condições de crescimento e com várias concentrações de c-di-GMP intracelulares (n = 24). No geral, capturou 74% (38/51) da conhecida ou prevista P. aeruginosa PAO1 c-di-GMP componentes de sinalização (24/32 14/19 proteínas solúveis, proteínas de membrana). Dado que, pelo menos, nove destes genes foram mostrados para ser transcrita sob condições específicas (stress oxidativo, sensores de quorum, biofilmes 16) e que alguns podem não se ligar c-di-GMP em tudo, este grau de cobertura pode ser perto da saturação. Isto, juntamente com a observação de que a maioria desses componentes were capturado com elevada especificidade (Tabela 2) sustenta fortemente que esta técnica seja eficaz e poderosa.
Figura 1: Estrutura química do Composto de captura c-di-GMP.
Figura 2:. CCMS resumo do workflow Após lise mecânica dos nucleótidos livres são removidos utilizando uma coluna de exclusão de PD10. As proteínas das fracções solúveis ou de membrana são incubadas com o CDG-CC e a mistura é exposta a irradiação UV às proteínas capturadas ligação cruzada. Passos de lavagem dura são realizadas com compostos ligado à estreptavadina esferas magnéticas revestidas. Em talão digestão tríptica proporciona péptidos,que são então separado das pérolas e protonada para a sua identificação espectrometria de massa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.
Figura 3: Volcanoplots de P. proteínas aeruginosa significativamente enriquecido por CCMS. Após análise por LC-MS / MS e quantificação livre de marcador, as proteínas foram classificados como descrito no texto. Rácio Log2 intensidade de peptídeo detectado entre as experiências de captura e de competição foram calculados e plotados contra os valores derivados da análise de significância (modificado estatística t, método Bayes empírico 17). As proteínas dentro dos limites de significância para valores de p <0,05 e rácios de intensidade> 1,5 vezes são indicaded em uma caixa cinza. A 4 réplicas para a fracção solúvel (A) e a fracção de membrana (B) foram realizadas na presença de 10 uM c-di-GMP-CC, e a experiência de competição com 1 mM de c-di-GMP. Os pontos circulados correspondem a proteínas de ligação c-di-GMP conhecidos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior da figura.
| Captura: | Amortecedor | Químico | Fonte | Concentração | |||||
| Tampão de Lise bacteriana 10x | MES | Sigma | 67 mM | ||||||
| pH 7,5 | HEPES | Sigma | 67 mM | ||||||
| NaCl | Merck | 2 M | |||||||
| Na Acetato | Merck | 67 mM | |||||||
| DTT | Fluka | 10 mM | |||||||
| DNaseI | Roche | 20 U / ml | |||||||
| Cocktail de Inibidor de Protease Completo | Roche | 1 guia / 10 ml | |||||||
| Capturar tampão 5x | HEPES | Sigma | 100 mM | ||||||
| KAc | Sigma | 250 mM | |||||||
| MgAc (anidro) | Sigma | 50 mM | |||||||
| Glicerina | Sigma | 50% (V / V) | |||||||
| PIB, GTP, ATP, CTP | sigma | 1 mM de cada um | 5x tampão de lavagem | Tris-HCl | Merck | 1 H | |||
| (Para a fracção solúvel) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| n-octil-β-D-glucopiranósido | Anagrade (Affymetrix) | 42,5 mM | |||||||
| 5x tampão de lavagem | Tris-HCl | Merck | 1 H | ||||||
| (Para a fracção de membrana) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| Outros produtos químicos: | Bicarbonato de amónio (ABC) | Fluka | |||||||
| Uréia | Applichem | ||||||||
| MS preparação da amostra: | Amortecedor | Químico | Fonte | Concentração | |||||
| C18 Tampão A | TFA | Perfurar | 0,1% (V / V) | ||||||
| H2O de grau HPLC | 99,9% (V / V) | ||||||||
| C18 Tampão B | TFA | Perfurar | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitrilo | Biosolve | 49,9% (V / V) | |||||||
| H2O de grau HPLC | 50% (V / V) | ||||||||
| C18 TampãoC | TFA | Perfurar | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitrilo | Biosolve | 5% (V / V) | |||||||
| H2O de grau HPLC | 94,9% (V / V) | ||||||||
| LC Tampão A | O ácido fórmico | Sigma | 0,15% (V / V) | ||||||
| Acetonitrilo | Biosolve | 2% | |||||||
| H2O de grau HPLC | 97,85% | ||||||||
| Outros produtos químicos: | tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) | Sigma | |||||||
| iodoacetamide (IAA) | Sigma | ||||||||
| N-acetil-cisteína | Sigma | ||||||||
| A endoproteinase Lys-C | Wako | ||||||||
| Tripsina | Promega |
Tabela 1: Os tampões composição Resumo dos buffers de composição, os produtos químicos e fornecedores.. O GMP-c-di captura composto, c-di-GMP (para o controlo da concorrência), esferas magnéticas revestidas com estreptavidina, memória intermédia de captura, e o tampão de lavagem são incluídos no caproKit.
| Controle Bead | Captura de experiência | O controlo da concorrência | |
| Extracto de proteína (10 mg / ml) | 30 ul | 30 ul | 30 ul |
| c-di-GMP (10 mM) | 0 ul | 0 ul | 10 ul |
| Os nucleótidos (10 mM de cada nucleótido) | 10 ul | 10 ul | 10 ul |
| 5x buffer de captura | 20 ul | 20 ul | 20 ul |
| H2O | 42 ul | 32 ul | 22 ul |
| 30 min de incubação | |||
| c-di-GMP ~ CC (estoque 100 M) | 0 ul | 5-10 ul | 5-10 ul |
| As concentrações finais: | Controle Bead | Captura de experiência | O controlo da concorrência |
| c-di-GMP ~ CC (uM) | 0 mM | 5-10 mM | 5-10 mM |
| Concorrente c-di-GMP (uM) | 0 mM | 0 mM | 1.000 uM |
Tabela 2:. Mistura de reacção de captura Síntese da mistura de reacção para o controlo talão (isto é, sem o composto de captura), o ensaio de captura (com o c-GMP-di-CC), e o controlo da concorrência que contém um grande excesso de c- di-GMP. A concentração final de c-di-GMP-CC pode ser ajustado, e é tipicamente definido entre 5 e 10 uM.
| Nome Protein | Locus ID | Arquitetura Domain | captura experimento / competição experimento 1 | ||||||||||||||||||
| a) fracção solúvel | CDG-CC = 5 mm | CDG-CC = 10 mM | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WSPR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ Td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | Pilz | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | Pilz | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b) Membrana fracção | CDG-CC = 5 mm | CDG-CC = 10 mM | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| Mora | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| BIFA | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF domínio contendo um local I | ||||||||||
| 1 número de contagens espectrais dos peptídeos identificados | |||||||||||||||||||||
Tabela 3: P. aeruginosa conhecido c-di-GMP sinalização componentes especificamente capturados. proteínas foram identificadas primeiro classificados como descrito no texto. As proteínas são identificados com o seu número e nome lócus, e que indicam a sua arquitectura prevista com a base de dados do NCBI ferramenta online Domínio conservado (n = 4, CDG-CC = 5 mM ou 10 mM), a fim de demonstrar a especificidade de captura e a reprodutibilidade do método.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Um cuidado especial deve ser tomado em vários passos do protocolo. A concentração de proteína é um parâmetro crítico com uma concentração de 10 mg / ml de ser difícil de alcançar quando as células são cultivadas sob condições específicas de crescimento (por exemplo, biofilmes ou pequenas variantes de colónias). Assim, a re-suspensão da pelota deve ser realizada num pequeno volume de tampão de lise. As concentrações de proteína pode ser diminuída para 8 mg / ml. Comparado com o método publicado por Nesper et al. 1, foram incluídas várias nucleótidos para a reacção de captura para minimizar a captação não específica de proteínas de ligação a nucleótidos. Embora a adição de nucleótidos melhorou a especificidade, pode ao mesmo tempo evitar a captura de proteínas que se ligam a diferentes nucleótidos no mesmo local. Por exemplo, a FleQ efectora, o qual foi recentemente mostrado ligar-se ATP e c-di-GMP 18 foi pescado especificamente na ausência de ATP na nossa experiência anterior 1, mas não mais na data apresentada aqui na presença de um excesso de ATP.
O CDG-CC deve ser cuidadosamente protegido da luz. Embora a luz ambiente contém apenas uma pequena fracção de raios UV, é recomendável manter o stock do composto de captura envolvido em folha de alumínio, assim como a mistura de captura antes da activação por irradiação UV. Os passos de lavagem que se seguem podem ser muito severas para aumentar a especificidade, como as proteínas capturadas são covalentemente ao CDG-CC. No que diz respeito a análise por LC-MS / MS, as experiências devem ser realizadas em um ambiente livre de queratina limpo. Além disso, tampões de HPLC compatíveis devem ser usados, especialmente após os passos de lavagem. A lista de candidatos compreende, tipicamente, entre 300 e 800 proteínas (para uma quadruplicado), com baixas variações entre as repetições (ver Tabela 2, como exemplo).
Alguns parâmetros como a proteína ea concentração CDG-CC pode precisam ser otimizados em função dos organismos denalyzed. Desde que as proteínas abundantes baixas ou proteínas expressas apenas em condições específicas podem ser facilmente perdida, cuidado deve ser tomado em relação às condições de cultivo empregadas. Este problema pode ser superado através da comparação da lista de ocorrências com um atlas global de proteínas recolhidos para as mesmas condições de cultura. Finalmente, a optimização do detergente pode ser um desafio, porque tem de ser optimizado no que diz respeito à sua capacidade para solubilizar proteínas de membrana e também tem de ser compatível MS.
É preciso ter em mente que a molécula de c-di-GMP do CC é quimicamente modificada, tal como ela está ligada através do grupo 2'OH de uma ribose para o resto do andaime. Esta modificação pode alterar a sua capacidade para se ligarem a alguns efectores, proporcionando assim falsos-negativos. Neste contexto, é de salientar que nós nunca proteínas que abrigam um domínio EAL, mas falta um domínio GGDEF em P. capturado aeruginosa, embora proteínas EAL foram capturados em outras espécies, como Caulcrescentus obacter. Isto pode ser devido a um acesso pobre ou uma baixa afinidade do CDG-CC para o sítio de ligação, ou para a degradação do CDG-CC por proteínas EAL. Em contraste, muitas proteínas de ligação a nucleótidos foram capturadas com uma especificidade relativamente baixa e, em grande medida, são provavelmente os falsos positivos. Além disso validação de ligação a c-di-GMP utilizando técnicas tais como a DRaCALA 20 específico, UV ligação cruzada 15, fluorimetria de varrimento diferencial (DSF) 21, termoforese microescala (MST) 22, calorimetria isotérmico (ITC) 23-24 é ... assim necessário.
É também possível que uma fracção da porção de c-di-GMP do composto de captura é degradado pelas fosfodiesterases do lisado celular. Esta é uma das razões pelas quais o processo tem de ser levada a cabo a 4 ° C, por conseguinte, limitar a actividade da fosfodiesterase antes de reticulação.
O procedure pode ser adaptada a muitas espécies de bactérias, e tem sido utilizado com sucesso para três espécies diferentes de bactérias com modificações muito pequenas 1. A tecnologia baseada Composto de captura pode reduzir os falsos-positivos usando lavagem completa (por exemplo, 1 M de sal, a concentração elevada de detergentes, 2 M de ureia no caso de proteínas de membrana, 80% de acetonitrilo), em comparação com outras técnicas que não se baseiam na ligação covalente. Dado que a validação das candidatas pode ser um processo tedioso e demorado, isto é uma grande vantagem para os métodos alternativos, como proteómica químicos baseados abordagens 14.
Este método de vídeo ilustrado estabelece CCMS como uma ferramenta poderosa e versátil para identificar e caracterizar novos componentes envolvidos na sinalização molécula pequena. No futuro, os Compostos Captura semelhantes albergando outros grupos de selectividade pode ser utilizado para capturar as proteínas envolvidas na sinalização de molécula pequena, tais como os novos efectores c-di-AMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
