Abstract
Der er gjort betydelige fremskridt i løbet af det sidste årti mod identifikation og karakterisering af enzymer involveret i syntesen (diguanylate cyclaser) og nedbrydning (fosfodiesteraser) af den anden messenger c-di-GMP. I modsætning hertil få oplysninger om de molekylære mekanismer og cellulære komponenter, hvorigennem dette signalmolekyle regulerer en bred vifte af cellulære processer. De fleste af de kendte effektor proteiner tilhører Pilz familie eller er degenereret diguanylate cyclaser eller phosphodiesteraser, der har givet op på katalyse og har vedtaget effektorfunktion. Således bedre at definere den cellulære c-di-GMP net i en bred vifte af bakterier eksperimentelle metoder er nødvendige for at identificere og validere nye effektorer for hvilke pålidelige i silico forudsigelser mislykkes.
Vi har for nylig udviklet en ny Capture Compound massespektrometri (CCMS) baseret teknologi som et effektivt redskab til atbiokemisk identificere og karakterisere c-di-GMP-bindende proteiner. Denne teknik er tidligere blevet rapporteret at være gældende for en lang række organismer 1. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den protokol, vi udnytter at sonden sådanne signalering komponenter. Som et eksempel, bruger vi Pseudomonas aeruginosa, et opportunistisk patogen, hvor c-di-GMP spiller en kritisk rolle i virulens og biofilm kontrol. CCMS identificeret 74% (38/51) af de kendte eller forventede komponenter i C-di-GMP-netværk. Denne undersøgelse forklarer CCMS procedure i detaljer, og etablerer det som et stærkt og alsidigt redskab til at identificere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering.
Introduction
c-di-GMP er en vigtig anden budbringer, der anvendes af de fleste bakterier til at styre forskellige aspekter af deres vækst og adfærd. For eksempel c-di-GMP regulerer cellecyklusprogression, motilitet og ekspressionen af exopolysaccharider og overflade adhæsiner 2-4. Ved koordinering af sådanne processer C-di-GMP fremmer biofilm dannelse, en proces, der er forbundet med kroniske infektioner af en række sygdomsfremkaldende bakterier 5. c-di-GMP syntetiseres af enzymer kaldet diguanylate cyclaser (DGCs), der huser en katalytisk GGDEF domæne 4. Nogle DGCs besidder en hæmmende websted, ned regulerer cyclase aktivitet ved c-di-GMP binding. Nedbrydningen af c-di-GMP katalyseres af to særskilte klasser af phosphodiesteraser (PDE'er), der huser enten en katalytisk EAL eller HD-GUF domæne 6,7.
Størstedelen af de kendte effektor proteiner, der direkte binder c-di-GMP tilhører en af kun tre klasser af proteiner: katalytiskallieret inaktive GGDEF eller EAL domæner og Pilz-domæner, små molekylære kontakter, der gennemgår konformationsændringer upon c-di-GMP binding 8. DGCs, PDE'er og Pilz proteiner er godt karakteriseret, og deres domæner kan forudsiges i silico relativt sikkert. En særlig interesse er nu fokuseret på identifikation af nye klasser af c-di-GMP effektorer. Nogle C-di-GMP effektorer med forskellige bindende motiver blev beskrevet for nylig, såsom CRP / FNR protein familie Bcam1349 i Burkholderia cenocepacia eller den transkriptionelle regulator FleQ i P. aeruginosa 9,10. Desuden blev C-di-GMP-specifikke riboswitches nylig identificeret og vist at styre genekspression i en C-di-GMP-afhængig måde 11. C-di-GMP bindende motiver af forskellige effektorer kun dårligt bevaret gør bioinformatiske forudsigelser af sådanne proteiner vanskelig. For at løse dette problem har vi udviklet en biokemisk metode, som er baseret på anvendelsen af en C-di-GMP spefikke Capture Compound kombineret med massespektrometri 1,12,13.
Vi har for nylig udviklet en ny trivalent C-di-GMP Capture Forbindelse (CDG-CC, figur 1) 1. Denne kemiske stillads er sammensat af: 1) en C-di-GMP del anvendes som madding til at fange C-di-GMP-bindende proteiner, 2) en UV-fotoaktiverbart reaktiv gruppe anvendes til at tværbinde CDG-CC til de bundne proteiner og 3) et biotin til at isolere de indfangede proteiner under anvendelse af streptavidin-coatede magnetiske perler. CDG-CC kan anvendes til direkte og specifikt fange c-di-GMP effektorer fra kompleks blanding af makromolekyler som cellelysater. Capture Compound baseret og kemiske proteomics tilgange er tidligere blevet rapporteret at være gældende for en lang række organismer, f.eks Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium og P. aeruginosa 1,14.
I denne metodologiske dokument,vi giver en dybtgående beskrivelse af CCMS procedure ved hjælp ekstrakter af P. aeruginosa som et eksempel. Denne undersøgelse fastslår CCMS som et stærkt og alsidigt værktøj til biokemisk identificere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysate Forberedelse
- Grow P. aeruginosa celler i LB til den ønskede OD.
BEMÆRK: For vejledning: Brug ≈ 100 ml kultur / prøve til stationære kulturer fase og ≈ 500 ml cultur / prøve til log fase kulturer (OD 600 nm = 0,5). - Pellet ved centrifugering i 20 minutter ved 5.000 x g.
- Resuspender 0,5-1 g pellet i 1 ml lysisbuffer (6,7 mM MES, 6,7 mM Hepes, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAC, DDT 1 mM, pH 7,5) og tilsæt proteaseinhibitor (komplet mini, EDTA-fri) såvel som DNasel.
- Lyse cellerne ved 3 passager gennem en French trykcelle, ved 20.000 psi (se Materialer List).
- Ultra-centrifuge cellelysatet ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Gem supernatanten (gå til trin 2).
- Vask pelleten med 1 ml 1x lysepuffer ved pipettering op og ned.
- Ultracentrifuge ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Flash-fryse pellet iflydende nitrogen og opbevares ved -20 ° C indtil anvendt til fangst af membranproteiner (se trin 3).
2. Fjernelse af frie C-di-GMP og Andre nucleotider (opløselig fraktion Only)
- Vask en PD10 afsaltningssøjle (se Materialer List) med 10 ml kold lysisbuffer.
- Hæld supernatanten (≈ 1 ml) på PD10 for at fjerne nukleotider.
- Elueres med 4 ml kold lysisbuffer (500 trin pi).
- Vælg de mest koncentrerede fraktioner som bestemt ved Bradford assay, og samle dem.
3. Pellet resuspension og Solubilisering (membranfraktion Only)
- Resuspender pellet i 500 til 1.000 pi 1x capture buffer (uden detergent) (se tabel 1).
BEMÆRK: Pillen er svært at resuspendere. Det tilrådes at første pipette op og ned med en pipette til ca. pellet resuspenderes derefter at anvende en sprøjte 27 G godt homogenisere opløsningen. - Tilsæt 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM).
- Inkuber ved 4 ° C i mindst 2 timer (eller O / N) på et roterende hjul.
- Ultracentrifuge ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Høst supernatanten.
4. Protein koncentrationsmåling
- Mål proteinkoncentration ved Bradford-assay (ved BCA-assay for membranfraktionen).
- Indstil det totale proteinkoncentration til 10 mg / ml.
5. Capture
- Bland 300 ug protein med 1 mM af BNP, GTP, ATP, CTP, og 20 pi 5x capture buffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glycerol, pH 7,5) (tabel 1). Juster reaktionen volumen til 100 pi med H 2 O.
BEMÆRK: det samlede volumen omfatter lydstyrken for CDG-CC og C-di-GMP i forbindelse med konkurrencen kontrol (se trin 5.3 og tabel 2).
BEMÆRK: Alle eksperimenter blev udført i 200 &# 181; l 12-rør PCR strips (Thermo Scientific).
BEMÆRK: for membranfraktionen, så sørg for altid at holde den DDM koncentration over den kritiske koncentration micelle (0,01% w / v), indtil proteinet solubiliseringstrin i 8 M urea (Trin 7.1). - Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter på et roterende hjul.
- Tilsæt 10 uM CDG-CC (slutkoncentration).
BEMÆRK: omfatter en kontrol uden CDG-CC (benævnt som "perle kontrol"), og en kontrol suppleret med 1 mM c-di-GMP ("konkurrence kontrol") (se tabel 2).
Bemærk: CDG-CC-koncentration kan indstilles fra 1 til 10 uM. - Inkuber ved 4 ° C i mindst 2 timer (O N for fraktion / membranen) på et roterende hjul, i mørke.
- Efter en kort centrifugering, cross-link ved aktivering af den reaktive del med CDG-CC med UV-lys i 4 minutter ved hjælp af en CaproBox (se Materialer List, λ = 310 nm, udstråling ≥10 mW / cm, afstand fra kilden = 2 cm). BEMÆRK: Fjern låget på strimlerne forudgående tværbinding.
- 25 pi 5x vaskepuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) og 50 pi godt resuspenderede streptavidin magnetiske perler forsigtigt homogeniseres.
- Inkuber ved 4 ° C i 1 time på et roterende hjul.
6. vasketrin
BEMÆRK: (Magnet: se Materialer List). Start med en opsamling af de magnetiske perler i PCR striben låg, med magneten. Derefter erstatte PCR strimmel med en ny, der indeholder den næste vask løsning. Fjern magneten og resuspendere perlerne, og inkuber 2 min. Spin ned og erstatte låget af en ny låg.
- Vasketrin (opløselig fraktion kun)
- Vask 6 gange i 200 pi 1x vaskebuffer.
- Vaskes én gang i 200 pi af HPLC-kvalitet H 2 O.
- Vask 6 gange i 200 pi 80% acetonitril.
- Vask 2 gange i 200 pi HPLC-kvalitet H 2 O.
- Vasketrin (membrane fraktion kun)
- Vask 5 gange i 200 pi 1x vaskebuffer + 0,1% DDM.
- Vask 2 gange i 200 pi 1x vaskebuffer + 0,05% DDM.
- Vaskes én gang i 200 pi 1x vaskebuffer + 0,025% DDM.
- Vaskes én gang i 200 pi 1x vaskebuffer + 0,0125% DDM.
- Vask 3 gange i 200 pi 100 mM ABC (ammoniumbicarbonat NH4 CO 3) + 2 M urinstof.
7. MS Sample Preparation
- Resuspender perlerne (direkte i låget) i 20 pi 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M urea for membranfraktionen) og overføres til 1,5 ml rør.
- Membranfraktion kun: inkuber ved 60 ° C i 5 minutter under omrystning ved 500 rpm.
- Tilsæt 0,5 pi 200 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphin) og inkuber ved 60 ° C i 1 time under omrystning ved 500 rpm. Køle ned til 25 ° C.
- Tilsæt 0,5 pi frisk fremstillet 400 mM iodacetamid og inkuberes ved 25 ° C i 30 minutter, rystert 500 rpm og i mørke.
- Tilsæt 0,5 pi 0,5 M N-acetyl-cystein og inkuberes ved 25 ° C i 10 minutter under omrystning ved 500 rpm.
- Membranfraktion kun: tilføje 1 pi Lys-C og inkuberes ved 37 ° C, O / N.
- Tilsæt 2 ug trypsin og inkuberes O / N ved 37 ° C, under omrystning ved 500 rpm (wrap i Parafilm at forhindre udtørring).
BEMÆRK: prøverne kan opbevares ved -20 ° C på dette tidspunkt.
BEMÆRK: membran fraktion kun: tilføje 100 mM ABC for at justere urinstofkoncentration til <2 M før tilsætning af trypsin. - Kort spin ned rørene og indsamle perler med magneten.
- Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml rør (gentage dette trin, hvis perlerne er til venstre).
- Tilsæt 5 pi 5% TFA (trifluoreddikesyre) + 1 pi 2 M HCI (15 pi 5% TFA + 5 pi 2 M HCI i membranfraktionen).
- Tilstand C18 MicroSpin-søjler (The Nest Group, MA, USA) med 150 pi acetonitril (spin-20 sekunder ved 2.400 rpm).
- Equilibrate C18 kolonne 2 gange med 150 pi 0,1% TFA (centrifugering 20 sek, 2400 rpm).
- Læg prøven og spin 2 min, 2.000 rpm.
- Opdater gennemløbet på søjlen og gentag centrifugeringen (2 min, 2000 rpm).
- Vask 3 gange med 150 pi 0,1% TFA, 5% acetonitril (20 sek, 2400 rpm).
- Tag et nyt rør, og der elueres to gange med 150 pi 0,1% TFA, 50% acetonitril (2 min, 2000 rpm).
- Tør peptider i en speed-vac.
- Resuspender i 40 pi 98% H2 O, 2% acetonitril, 0,15% myresyre.
- Soniker 20 sek (puls cyklus 0,5, amplitude 100%; se Materialer List) og spin ned 5 sek, 12.000 rpm (bordcentrifuge). Vortex 10 sek, og spin ned 5 sek, 12.000 rpm. Overførsel i en HPLC hætteglas til LC-MS / MS analyse.
- Fryser ved -20 ° C.
BEMÆRK: prøverne kan opbevares ved -20 ° C på dette tidspunkt.
8. LC-MS / MS-analyse
- Kør en nano-LC (nano-LC-systemer) equipped med en RP-HPLC-søjle (75 um x 37 cm) pakket med C18 harpiks (Magic C18 AQ 3 um) under anvendelse af en lineær gradient fra 95% opløsningsmiddel A (0,15% myresyre, 2% acetonitril) og 5% opløsningsmiddel B ( 98% acetonitril, 0,15% myresyre) til 35% opløsningsmiddel B i løbet af 60 minutter ved en strømningshastighed på 0,2 ul / min.
- Analyser peptiderne ved LC-MS / MS (dual tryk LTQ-Orbitrap Velos massespektrometer forbundet til en elektrospray ionkilde).
BEMÆRK: Den tilstand dataopsamling blev sat for at opnå en høj opløsning MS scanning i FT del af massespektrometer med en opløsning på 60.000 FWHM efterfulgt af MS / MS scanninger i den lineære ionfælde af de 20 mest intense ioner. For at øge effektiviteten af MS / MS forsøg blev den opladet tilstand screening modus aktiveret for at udelukke ikke-tildelt og enkeltvis afgifter ioner. Aftalt spil dissociation blev udløst, da forstadiet oversteg 100 ion tæller. Den dynamiske udelukkelse varighed blev sat til 30 sek. Den ion akkumulering tid blev sat til 300 ms (MS) og 50msek (MS / MS).
9. Database Søg
- Download P. aeruginosa NCBI-database via NCBI hjemmeside ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Konverter MS rå spektre i Mascot generiske filer (MGF) ved hjælp af MassMatrix konverteringsværktøj ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Søg denne MGF fil ved hjælp MASCOT version 2.3 mod P. aeruginosa NCBI-database med frem og bak-lokkefugle protein poster.
- Udfør en in silico trypsinfordøjelse efter lysin og arginin (medmindre efterfulgt af prolin) tolerere to savnede kløfter i fuldt tryptiske peptider.
- Indstil database søgeparametre at tillade oxiderede methioniner (15,99491 Da) som variable ændringer og carboxyamidomethylation (57,021464 Da) af cysteinrester som fast modifikation. For MASCOT søger osing høj opløsning scanninger, skal du indstille forløber masse tolerance over 15 ppm og indstil fragmentet masse tolerance over 0,6 Da. Endelig indstilles proteinet FDR til 1%.
- Importer Mascot søgninger i P. aeruginosa CCMS eksperimenter i Stillads (Proteomesoftware, version 3), indstille parametrene for at opnå et protein FDR tæt på 1%, og udtrække de samlede spektrale tæller.
- For de repræsentative resultater præsenteres i dette papir, vi brugte en parret T-test til at sammenligne forsøget med konkurrencen kontrol og kun betragtes hits med en p-værdi under 0,1, og en spektral tæller ligger over 2 (eksperimentere spektrale tællinger / konkurrence kontrol spektrale tællinger).
- Data kan eksporteres i alle regneark til yderligere analyse.
10. Label-fri Kvantificering
- Importer de rå filer i Progenesis LC-MS software (Nonlinear Dynamics, version 4.0).
- Udfør LC-MS tilpasning og funktion opdagelse i standard SettiNGS.
- Eksportere data i MGF format fra Progenesis LC-MS.
- Søg i MS / MS spektre ved hjælp af MASCOT mod NCBI P. aeruginosa database indeholdende frem og bak-lokkefugle protein poster.
- Importer database søgeresultater i Progenesis LC-MS og kortlægge peptider identifikationer til MS1 funktioner.
- For data evaluering (beregning af signifikansniveauer, fold-change-forhold) den ProteinSQAnalysis manuskriptet til SafeQuant blev anvendt (tærskel: q-værdi under 0,1, spektral tæller forholdet over 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At identificere nye c-di-GMP effektorer i P. aeruginosa vi systematisk brugt CCMS til at analysere de opløselige og membran fraktioner af P. aeruginosa stamme PAO1 fra en log fase kultur (OD 600 = 0,5). Her opsummere og diskutere repræsentative resultater af denne fisketur. Fire uafhængige biologiske replikaer blev anvendt. For hvert eksperiment blev anvendt to forskellige CDG-CC koncentrationer (5 uM og 10 uM). For at undersøge for specificitet, blev forsøg udført i nærvær eller fravær af 1 mM C-di-GMP som konkurrent, og endelig med en vulst kontrol (dvs. uden CDG-CC) (tabel 1).
Når fremgangsmåden beskrevet i detaljer ovenfor (Figur 2) metode producerede vi en liste over tilfangetagne proteiner i et stillads format. Sandsynlige forureninger blev fjernet. Dette omfattede ribosomale proteiner, streptavidin, trypsin, serumalbumin, keratin og andre humane proteiner. Proteinetidentifikation falsk opdagelse sats (FDR) blev sat til 1% ved anvendelse stilladset software, og de data, der eksporteres til Excel. Tiltrædelsen nummer fra Stillads kan omdannes til locus numre ved hjælp af VLOOKUP funktion i Excel knyttet til en liste over de P. aeruginosa locus numre. På dette stadium, hitlisten omfatter 768 proteiner til den opløselige fraktion og 433 proteiner til membranfraktionen. Imidlertid er de fleste proteiner ikke væsentligt beriget i capture eksperiment. Således blev proteiner, der sandsynligvis tilfangetagne ikke-specifikt (positive i perlen kontrol eller kun i nærvær af c-di-GMP konkurrent) fjernes. Vi beregnede en spektral tæller forhold mellem capture eksperimentet og konkurrencen kontrol og kun betragtes proteiner med et forhold større end to. Derudover beskæftigede vi en parret t-test på spektrale tæller til at give en signifikans foranstaltning mellem capture eksperiment og konkurrence kontrol, og sæt en eftergivende tærskel på 0,1. EndeligVi betragtede kun robuste hits med mindst fire peptider identificeret i fire forsøg med 2 capture forbindelseskoncentrationer truffet helt. Disse kriterier bør tilpasses efter behov og ved hjælp af den verificeret og forudsagte C-di-GMP bindende proteiner som standard at indstille tærsklen. Efter sortering blev listen reduceret til 76 hits for den opløselige fraktion og 133 proteiner til membranfraktionen. Dette omfattede 13 opløselige og 21 membranproteiner fra P. aeruginosa, som er kendt eller forventet at binde C-di-GMP (tabel 2). De øvrige 63 opløselige og 112 membranproteiner er nye formodede C-di-GMP-bindende proteiner, der ikke indeholder en af de kendte C-di-GMP bindingsdomæner. Disse hits nu skal valideres ved at teste deres specifikke binding til c-di-GMP.
I en tidligere skærm fisket vi GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) og Gsp69 (PA1127) 1. Disse 3-proteiner blev klonet, overudtrykt og oprenset fraE. coli og kan valideres at binde C-di-GMP i UV-krydsbinding forsøg med 33 P-mærket C-di-GMP 15. KD s blev bestemt til 1,0, 2,0 og 6,9 uM henholdsvis angiver, at faktisk nye effektorer kan identificeres ved hjælp af CCMS.
Ud over denne repræsentativt eksempel anvendte vi CCMS med ekstrakter af celler, der er høstet fra forskellige vækstbetingelser og med forskellige intracellulære c-di-GMP-koncentrationer (n = 24). Samlede vi fanget 74% (38/51) af det kendte eller forudsagte P. aeruginosa PAO1 C-di-GMP signalering komponenter (24/32 opløselige proteiner, 14/19 membranproteiner). Da mindst ni af disse gener viste sig at blive transskriberet under særlige betingelser (oxidativ stress, quorum sensing, biofilm) 16, og at nogle ikke kan binde C-di-GMP overhovedet, kan dette dækningsgraden være tæt på mætning. Dette sammen med den observation, at de fleste af disse komponenter were fanget med høj specificitet (tabel 2) stærkt hævder, at denne teknik er effektiv og kraftfuld.
Figur 1: Kemisk struktur af c-di-GMP Capture Compound.
Figur 2:. CCMS workflow Oversigt efter mekanisk lysis de frie nukleotider fjernes med en PD10 udelukkelse kolonne. Proteiner fra den opløselige eller membranfraktioner inkuberes med CDG-CC, og blandingen udsættes for UV-bestråling for at tværbinde tilfangetagne proteiner. Trin i barske vask udføres med forbindelser der er bundet til streptavidin-coatede magnetiske perler. On-perle tryptisk fordøjelse tilvejebringer peptider,som derefter skilles fra perlerne og protoneret for deres massespektrometri identifikation. Klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 3: Volcanoplots af P. aeruginosa proteiner betydeligt beriget af CCMS. Efter LC-MS / MS-analyse og etiket-fri kvantificering blev proteiner sorteret som beskrevet i teksten. Log2 intensitet forholdet opdaget peptid mellem opsamling og konkurrencemæssige eksperimenter blev beregnet og plottet versus værdier afledt af signifikans analyse (modificeret t-statistik, empirisk Bayes metode 17). Proteiner i betydning tærskler for P-værdier <0,05 og intensitetsforhold> 1,5-fold er angied i en grå boks. De 4 replikater for den opløselige fraktion (A) og membranfraktionen (B) blev udført i nærvær af 10 uM C-di-GMP-CC, og konkurrencen eksperiment med 1 mM C-di-GMP. I cirklen prikker svarer til kendte C-di-GMP-bindende proteiner. Klik her for at se en større udgave af figuren.
| Capture: | Buffer | Kemisk | Kilde | Koncentration | |||||
| Bakteriel Lysis Buffer 10x | MES | Sigma | 67 mm | ||||||
| pH 7,5 | HEPES | Sigma | 67 mm | ||||||
| NaCl | MigRCK | 2 M | |||||||
| Na-acetat | Merck | 67 mm | |||||||
| DTT | Fluka | 10 mM | |||||||
| DNasel | Roche | 20 U / ml | |||||||
| Komplet proteaseinhibitorcocktail | Roche | 1 fane / 10 ml | |||||||
| Capture Buffer 5x | HEPES | Sigma | 100 mM | ||||||
| KAc | Sigma | 250 mM | |||||||
| MgAc (vandfri) | Sigma | 50 mM | |||||||
| Glycerol | Sigma | 50% (V / V) | |||||||
| BNP, GTP, ATP, CTP | sigma | 1 mM hver | Vaskepuffer 5x | Tris-HCI | Merck | 1 M | |||
| (For den opløselige fraktion) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| n-octyl-β-D-glucopyranosid | Anagrade (Affymetrix) | 42,5 uM | |||||||
| Vaskepuffer 5x | Tris-HCI | Merck | 1 M | ||||||
| (For membranfraktionen) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| Andre kemikalier: | Ammoniumhydrogencarbonat (ABC) | Fluka | |||||||
| Urea | AppliChem | ||||||||
| MS prøve forberedelse: | Buffer | Kemisk | Kilde | Koncentration | |||||
| C18 Buffer A | TFA | Pierce | 0,1% (V / V) | ||||||
| H2O HPLC-kvalitet | 99,9% (V / V) | ||||||||
| C18 Buffer B | TFA | Pierce | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 49,9% (V / V) | |||||||
| H2O HPLC-kvalitet | 50% (V / V) | ||||||||
| C18 BufferC | TFA | Pierce | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 5% (V / V) | |||||||
| H2O HPLC-kvalitet | 94,9% (V / V) | ||||||||
| LC Buffer A | Myresyre | Sigma | 0,15% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 2% | |||||||
| H2O HPLC-kvalitet | 97,85% | ||||||||
| Andre kemikalier: | tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) | Sigma | |||||||
| iodacetamid (IAA) | Sigma | ||||||||
| N-acetyl-cystein | Sigma | ||||||||
| Endoproteinase Lys-C | Wako | ||||||||
| Trypsin | Promega |
Tabel 1: Puffere sammensætning Resumé af buffere sammensætning, kemikalier og leverandører.. C-di-GMP-capture forbindelse, c-di-GMP (for konkurrence kontrol), streptavidin-coatede magnetiske perler, capture buffer og vaskebuffer er inkluderet i caproKit.
| Bead kontrol | Capture eksperiment | Konkurrence kontrol | |
| Protein ekstrakt (10 mg / ml) | 30 pi | 30 pi | 30 pi |
| c-di-GMP (10 mM) | 0 pi | 0 pi | 10 pi |
| Nukleotider (10 mM af hver nucleotid) | 10 pi | 10 pi | 10 pi |
| Capture buffer 5x | 20 pi | 20 pi | 20 pi |
| H2O | 42 pi | 32 pi | 22 pi |
| 30 min inkubation | |||
| c-di-GMP ~ CC (lager 100 uM) | 0 pi | 5-10 pi | 5-10 pi |
| Endelige koncentrationer: | Bead kontrol | Capture eksperiment | Konkurrence kontrol |
| c-di-GMP ~ CC (uM) | 0 uM | 5-10 uM | 5-10 uM |
| Konkurrent C-di-GMP (uM) | 0 uM | 0 uM | 1.000 uM |
Tabel 2:. Capture reaktionsblanding Sammendrag af reaktionsblandingen for perlen kontrol (dvs. uden capture forbindelse) indfangning eksperimentet (med C-di-GMP-CC), og konkurrencen kontrol, som indeholder et stort overskud af c- di-GMP. C-di-GMP-CC slutkoncentration kan justeres, og indstilles typisk mellem 5 og 10 um.
| Protein navn | Locus ID | Domæne arkitektur | capture eksperiment / konkurrence eksperiment 1 | ||||||||||||||||||
| a) opløselig fraktion | CDG-CC = 5 uM | CDG-CC = 10 uM | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WspR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ Td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | Pilz | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | Pilz | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-Asnef-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b) membranfraktion | CDG-CC = 5 uM | CDG-CC = 10 uM | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| MORA | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| Bifa | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF domæne indeholdende en I stedet | ||||||||||
| 1 antal spektrale tællinger af identificerede peptider | |||||||||||||||||||||
Tabel 3: P. aeruginosa kendt C-di-GMP signalering komponenter specifikt fanget. Identificerede proteiner blev først sorteret som beskrevet i teksten. Proteiner identificeret med deres navn og locus nummer, og vi angiver deres arkitektur forudsiges med NCBI Conserved Domain Database online-værktøj (n = 4, CDG-CC = 5 pm eller 10 uM) for at vise fange specificitet og reproducerbarhed af fremgangsmåden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Særlig forsigtighed bør tages på flere trin i protokollen. Proteinkoncentrationen er en kritisk parameter med en koncentration på 10 mg / ml er vanskeligt at nå, når cellerne dyrkes under særlige vækstbetingelser (f.eks biofilm eller små kolonier varianter). Således bør pellet resuspension udføres i et lille volumen lysisbuffer. Proteinkoncentrationer kan reduceres til 8 mg / ml. Sammenlignet med metoden offentliggjort af Nesper et al. 1, har vi tilføjet forskellige nukleotider til indfangning reaktion for at minimere ikke-specifik indfangning af nukleotid- bindende proteiner. Selv om tilsætning af nukleotider forbedret specificitet, kan det på samme tid forhindre indfangning af proteiner, der binder forskellige nukleotider på samme sted. For eksempel effektor FleQ, som for nylig viste sig at binde ATP og c-di-GMP 18 blev fisket specielt i fravær af ATP i vores tidligere forsøg 1, men ikke længere i data præsenteres her i nærvær af et overskud af ATP.
CDG-CC bør nøje beskyttet mod lys. Selv omgivende lys indeholder kun en lille brøkdel af UV, anbefales det at holde indfangningsforbindelse lager indpakket i aluminiumsfolie, samt opsamling mix før aktivering af UV-bestråling. De vask efterfølgende trin kan være meget strenge at øge specificitet, da de erobrede proteiner kovalent bindes til CDG-CC. Med hensyn til LC-MS / MS-analyse, bør forsøgene gennemføres i et rent keratin frit miljø. Desuden bør der anvendes HPLC kompatible buffere, især efter vasketrinene. Kandidatlisten omfatter typisk mellem 300 og 800 proteiner (for en firdobbelt), med lave variationer mellem gentagelser (se tabel 2 som et eksempel).
Nogle parametre som proteinet og CDG-CC-koncentration skal muligvis optimeres afhængig af organismerne analyzed. Da lave rigelige proteiner eller proteiner udtrykt kun under særlige betingelser kan nemt blive savnet, der skal sørges vedrørende dyrkningsbetingelser anvendes. Dette problem kan løses ved at sammenligne hitlisten med et globalt protein ATLAS indsamlet for de samme dyrkningsbetingelser. Endelig kan optimering af detergent være udfordrende, som det skal optimeres med hensyn til dets evne til at solubilisere membranproteiner og skal også være MS kompatible.
Man skal huske på, at c-di-GMP molekyle CC er kemisk modificeret, som det er forbundet via 2'OH gruppe af en ribose til resten af stilladset. Denne ændring kan ændre sin evne til at binde til nogle effektorer derved leverer falsk-negativer. I denne sammenhæng er det bemærkelsesværdigt, at vi aldrig fanget proteiner, som skjuler en EAL domæne, men mangler en GGDEF domæne i P. aeruginosa, selv EAL proteiner blev fanget i andre arter, som netmaveobacter crescentus. Dette kan skyldes en dårlig adgang eller en lav affinitet for CDG-CC til bindingsstedet, eller nedbrydningen af CDG-CC ved EAL proteiner. I modsætning hertil var der mange nucleotid-bindende proteiner fanget med en relativt lav specificitet og, i høj grad, er sandsynligvis falske positiver. Yderligere validering af specifik binding til c-di-GMP ved hjælp af teknikker såsom DRaCALA 20, UV cross-linking 15 differential scanning fluorimetri (DSF) 21 Individuel thermophoresis (MST) 22, isotermisk kalorimetri (ITC) 23-24 ... er derfor nødvendigt.
Det er også muligt, at en del af den C-di-GMP delen af capture forbindelsen nedbrydes af phosphodiesteraser fra cellelysatet. Dette er en af grundene til, at proceduren skal udføres ved 4 ° C, således at begrænse phosphodiesteraser aktivitet før tværbinding.
Den Procedure kan tilpasses til mange bakteriearter, og er med succes blevet anvendt til 3 forskellige bakteriearter med meget mindre modifikationer 1. Capture Compound baseret teknologi kan reducere falsk-positive ved hjælp af grundig vask (f.eks 1 M salt, høj detergentkoncentration, 2 M urea i tilfælde af membranproteiner, 80% acetonitril), i forhold til andre teknikker, som ikke er afhængige af kovalent binding. Da validering af kandidaterne kan være en kedelig og tidskrævende proces, det er en stor fordel for alternative metoder som kemiske proteomics tilgange 14.
Dette illustrerede video metode etablerer CCMS som et stærkt og alsidigt værktøj til at identificere og karakterisere nye komponenter involveret i lille molekyle signalering. I fremtiden kan lignende Capture Forbindelser huser andre selektivitet grupper anvendes til at indfange proteiner involveret i lille molekyle signalering, såsom de hidtil ukendte C-di-AMP effektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R.
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
