Abstract
Betydelig fremskritt er blitt gjort i løpet av det siste tiåret mot identifikasjonen og karakteriseringen av enzymer som er involvert i syntesen (diguanylate cyclases) og nedbrytnings (fosfodiesterase) av den andre budbringer c-di-GMP. I kontrast, er lite informasjon tilgjengelig om de molekylære mekanismer og cellulære komponenter der dette signaliserer molekyl regulerer en rekke ulike cellulære prosesser. De fleste av de kjente effektor proteiner tilhører Pilz familie eller utartet diguanylate cyclases eller fosfodiesterase som har gitt opp på katalyse og har vedtatt effektorfunksjonen. Således, for bedre å definere den cellulære c-di-GMP-nettverk i et bredt spekter av bakterier eksperimentelle metoder er nødvendige for å identifisere og validere nye effektorer som pålitelig i silikofluorid prediksjoner mislykkes.
Vi har nylig utviklet en ny Capture forbindelse massespektrometri (CCMS) basert teknologi som et kraftig verktøy for åbiokjemisk identifisere og karakterisere c-di-GMP bindende proteiner. Denne teknikk er tidligere blitt rapportert å være anvendbar på et bredt spekter av organismer 1. Her gir vi en detaljert beskrivelse av protokollen som vi bruker for å sondere slike signalkomponenter. Som et eksempel, bruker vi Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk patogen der c-di-GMP spiller en avgjørende rolle i virulens og biofilm kontroll. CCMS identifisert 74% (38/51) av de kjente eller antatte komponenter av c-di-GMP-nettverk. Denne studien forklarer CCMS prosedyren i detalj, og etablerer det som et kraftig og allsidig verktøy for å identifisere nye komponentene som er involvert i lite molekyl signalering.
Introduction
c-di-GMP er en nøkkel andre messenger brukes av de fleste bakterier for å kontrollere ulike aspekter av deres vekst og atferd. For eksempel c-di-GMP regulerer cellesyklusprogresjon, motilitet og ekspresjon av exopolysaccharides og overflate adhesiner 2-4. Ved koordinering av slike prosesser c-di-GMP fremmer biofilmdannelse, en prosess som er assosiert med kroniske infeksjoner av en rekke patogene bakterier 5. c-di-GMP er syntetisert av enzymer som kalles diguanylate cyclases (DGCs) som havn en katalytisk GGDEF domene 4. Noen DGCs har en hemmende nettsted som ned regulerer syklaseaktivitet på c-di-GMP bindende. Nedbrytning av c-di-GMP katalyseres av to forskjellige klasser av fosfodiesterase (PDE) skjuler enten en katalytisk EAL eller HD-GYP domene 6,7.
De fleste av de kjente effektor proteiner som direkte binder c-di-GMP tilhører en av tre klasser av proteiner: katalytiskalliert inaktive GGDEF eller EAL domener og Pilz domener, små molekylære brytere som gjennomgår konformasjonsendringer ved c-di-GMP bindende 8. DGCs, PDE'er og Pilz proteiner er godt karakterisert og sine domener kan forutsies i silico relativt trygt. En spesiell interesse er nå fokusert på identifisering av nye klasser av c-di-GMP effektorer. Noen c-di-GMP effektorer med forskjellige bindingsmotiver ble beskrevet nylig eksempel CRP / FNR protein familie Bcam1349 i Burkholderia cenocepacia eller transkripsjons regulator FleQ i P. aeruginosa 9,10. I tillegg ble C-di-GMP-spesifikke riboswitches nylig identifisert og vist for å kontrollere genekspresjon i en c-di-GMP-avhengig måte 11. De c-di-GMP bindende motiver av ulike effektbokser er bare dårlig bevart lage bioinformatiske spådommer om slike proteiner vanskelig. For å løse dette problemet, har vi utviklet en biokjemisk metode, som er basert på bruk av en c-di-GMP specific Capture Compound kombinert med massespektrometri 1,12,13.
Vi har nylig utviklet en roman trivalent c-di-GMP Capture Compound (CDG-CC, figur 1) 1. Denne kjemiske Stillaset består av: 1) en c-di-GMP-del anvendes som agn for å fange opp c-di-GMP-bindende proteiner, 2) en UV-photoactivatable reaktive gruppe som brukes for å tverrbinde den CDG-CC til de bundne proteiner og 3) et biotin å isolere de fangede proteiner ved anvendelse av streptavidin-belagte magnetiske kuler. CDG-CC kan brukes til direkte og spesifikt ta c-di-GMP effektorer fra kompleks blanding av makromolekyler som cellelysater. Capture Compound basert og kjemiske proteomikk baserte tilnærminger har tidligere blitt rapportert å være knyttet til et bredt spekter av organismer, f.eks Caulobacter crescentus, Salmonella ente serovar typhimurium og P. aeruginosa 1,14.
I denne metode papir,vi gi en grundig beskrivelse av CCMS prosedyren med ekstrakter av P. aeruginosa som et eksempel. Denne studien etablerer CCMS som et kraftig og allsidig verktøy til biokjemisk identifisere nye komponentene som er involvert i lite molekyl signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysatfremstilling
- Grow P. aeruginosa-celler i LB til ønsket ytre diameter.
MERK: For veiledning: bruk ≈ 100 ml kultur / prøve for stasjonære fase kulturer og ≈ 500 ml cultur / prøve for log fase kulturer (OD 600nm = 0,5). - Pellet ved sentrifugering i 20 minutter ved 5000 x g.
- Resuspender 0,5-1 g pellet i 1 ml lyseringsbuffer (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, DDT 1 mM, pH 7,5) og tilsett protease inhibitor (komplett mini, EDTA-fri) samt som DNaseI.
- Lyse cellene ved tre passasjer gjennom en fransk press celle, på 20.000 psi (se Materials List).
- Ultra-sentrifuge cellelysatet ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Lagre supernatanten (gå til trinn 2).
- Vask pelleten med 1 ml lyseringsbuffer 1x ved å pipettere opp og ned.
- Ultrasentrifuge ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Flash-fryse pellet iflytende nitrogen og oppbevares ved -20 ° C inntil brukes til fangst av membran proteiner (se punkt 3).
2. Fjerning av Free c-di-GMP og Andre Nukleotider (vannløselig fraksjon Only)
- Vask en PD10 avsaltingskolonne (se Materialer List) med 10 ml kald lyseringsbuffer.
- Hell av supernatanten (≈ 1 ml) på PD10 for å fjerne nukleotider.
- Elueres med 4 ml kald lyseringsbuffer (500 ul trinn).
- Velg de mest konsentrerte fraksjoner som bestemmes av Bradford assay, og basseng dem.
3. Pellet Resuspensjon og Solubilisering (membranfraksjonen Only)
- Resuspender pelleten i 500 til 1000 ul 1x fangst buffer (uten vaskemiddel) (se tabell 1).
MERK: Den pellet er vanskelig å suspendere. Det anbefales å først pipetten opp og ned med en pipette til omtrent resuspender pelleten, og deretter å bruke en sprøyte 27 G til godt homogenisere oppløsningen. - Tilsett 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM).
- Inkuber ved 4 ° C i minst 2 timer (eller O / N) på et roterende hjul.
- Ultrasentrifuge ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C.
- Høste supernatant.
4. Protein konsentrasjonsmåling
- Måle proteinkonsentrasjon ved Bradford-analyse (ved BCA-assay for membranfraksjon).
- Sett den totale proteinkonsentrasjon på 10 mg / ml.
5. Capture
- Bland 300 ug protein med 1 mM GDP, GTP, ATP, CTP, og 20 ul 5x fangst-buffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glycerol, pH 7,5) (tabell 1). Juster reaksjonsvolumet til 100 ul med H 2 O.
MERK: det totale volum omfatter volumet i CDG-CC og c-di-GMP i tilfelle av konkurransen kontroll (se trinn 5.3 og Tabell 2).
MERK: alle forsøkene ble utført i 200 &# 181; l 12-tube PCR strimler (Thermo Scientific).
MERK: for membranfraksjonen, sørg for å alltid holde DDM konsentrasjon over den kritiske micellekonsentrasjonen (0,01% w / v) til protein solubiliseringstrinnet i 8 M Urea (trinn 7.1). - Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter på et roterende hjul.
- Legg 10 mm CDG-CC (endelig konsentrasjon).
MERK: inkluderer en kontroll uten CDG-CC (betegnet som "perle kontroll"), og en styre supplementert med 1 mM c-di-GMP ("konkurranse kontroll") (se tabell 2).
MERK: CDG-CC konsentrasjon kan justeres fra 1 til 10 mikrometer. - Inkuber ved 4 ° C i minst 2 timer (O / N for membranfraksjon) på et roterende hjul, i mørket.
- Etter en kort sentrifugering, kryssbinde ved aktivering av den reaktive del av CDG-CC med UV-lys i 4 minutter ved hjelp av en CaproBox (se Materialer List, λ = 310 nm, Irradians ≥10 mW / cm, avstanden fra kilden = 2 cm). MERK: Fjern lokket av stripene før cross-linking.
- Tilsett 25 ul 5x vaskebuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) og 50 ul brønn suspendert på nytt streptavidin magnetiske kuler, forsiktig homogeniseres.
- Inkuber ved 4 ° C i 1 time på et roterende hjul.
6. Vaskeråd Steps
MERK: (Magnet: se Materials List). Begynn med en fangst av de magnetiske perler i PCR-bånd lokket, med magneten. Deretter erstatte PCR stripe av en ny en som inneholder den neste vaskeløsning. Fjerne magneten og resuspender perlene, og inkuber 2 min. Spinne ned og sett på lokket av en frisk lokk.
- Vasketrinn (løselig fraksjon only)
- Vask 6 ganger 200 pl 1 x vaskebuffer.
- Vask en gang i 200 mL HPLC grade H 2 O.
- Vask seks ganger i 200 mL 80% acetonitril.
- Vask to ganger i 200 mL HPLC grade H 2 O.
- Vasketrinn (membranne brøkdel only)
- Vask 5 ganger i 200 pl 1 x vaskebuffer + 0,1% DDM.
- Vask to ganger i 200 mL 1x vaskebuffer + 0,05% DDM.
- Vask en gang i 200 mL 1x vaskebuffer + 0,025% DDM.
- Vask en gang i 200 mL 1x vaskebuffer + 0,0125% DDM.
- Vask tre ganger i 200 mL 100 mM ABC (ammonium bicarbonate, NH 4 CO 3) + 2 M Urea.
7. MS Prøvepreparering
- Resuspendere kulene (direkte i lokket) i 20 ul 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M Urea for membranfraksjon) og overfør til 1,5 ml rør.
- Membranfraksjon bare: inkuber ved 60 ° C i 5 minutter, risting ved 500 rpm.
- Tilsett 0,5 ul 200 mM TCEP (tris (2-karboksyetyl) fosfin) og inkuberes ved 60 ° C i 1 time, risting ved 500 rpm. Kjøle ned til 25 ° C.
- Legg 0,5 mL av nylaget 400 mM iodoacetamide og inkuberes ved 25 ° C i 30 min, riste ent 500 rpm og i mørket.
- Tilsett 0,5 mL 0,5 M N-acetyl-cystein og inkuber ved 25 ° C i 10 minutter, risting ved 500 rpm.
- Membranfraksjonen bare: tilsett 1 mL Lys-C og inkuberes ved 37 ° C, O / N.
- Tilsett 2 ug trypsin og inkuberes O / N ved 37 ° C risting ved 500 rpm (wrap i Parafilm for å hindre tørking).
MERK: prøvene kan lagres ved -20 ° C på dette stadiet.
MERK: membranfraksjonen bare: tilsett 100 mM ABC for å justere urea konsentrasjon til <2 M før tilsetting av trypsin. - I korthet spinne ned rør og samle perler med magneten.
- Overfør supernatanten til en ny 1,5 ml tube (gjenta dette trinnet hvis perler er igjen).
- Tilsett 5 ul 5% TFA (trifluoreddiksyre) + 1 ul 2 M HCl (15 mL 5% TFA + 5 ul 2 M HCl til membranfraksjonen).
- Tilstand C18 MicroSpin kolonner (The Nest Group, MA, USA) med 150 mL acetonitril (spin 20 sek ved 2400 rpm).
- Equilibrate C18 kolonne 2 ganger med 150 ul 0,1% TFA (spin 20 sek, 2400 rpm).
- Laste prøven og spinne 2 min, 2000 rpm.
- Last gjennomstrømning i kolonnen, og gjenta spinnetrinnet (2 min, 2 000 rpm).
- Vask 3 ganger med 150 ul 0,1% TFA, 5% acetonitril (20 s, 2400 rpm).
- Ta et nytt rør, og eluere to ganger med 150 ul 0,1% TFA, 50% acetonitril (2 min, 2 000 rpm).
- Tørk peptider i en speed-vac.
- Resuspender i 40 mL 98% H 2 O, 2% acetonitril, 0,15% maursyre.
- Sonikere 20 sek (puls syklus 0,5, amplitude 100%; se Materials List) og spinne ned 5 sek, 12 000 rpm (benkeplate Bøk sentrifuge). Vortex 10 sek, og spinne ned 5 sek, 12 000 rpm. Overfører i en HPLC-ampulle for LC-MS / MS-analyse.
- Fryses ved -20 ° C.
MERK: prøvene kan lagres ved -20 ° C på dette stadiet.
8. LC-MS / MS analyse
- Kjør en nano-LC (nano-LC-systemer) equippsert med en RP-HPLC-kolonne (75 um x 37 cm) pakket med C18-harpiks (magiske C18 AQ 3 um) ved bruk av en lineær gradient fra 95% oppløsningsmiddel A (0,15% maursyre, 2% acetonitril) og 5% løsningsmiddel B ( 98% acetonitril, 0,15% maursyre) til 35% løsningsmiddel B i løpet av 60 min ved en strømningshastighet på 0,2 mL / min.
- Analysere peptider ved hjelp av LC-MS / MS (dual press LTQ-Orbitrap Velos massespektrometer, koblet til en elektro ion kilde).
MERK: datainnsamling modus ble satt til å oppnå en høy oppløsning MS skanne i FT del av massespektrometer med en oppløsning på 60.000 FWHM fulgt av MS / MS-skanninger i den lineære ion felle av de 20 mest intense ioner. For å øke effektiviteten av MS / MS-forsøk, ble belastet tilstand screening modus aktivert for å utelukke tilordnet og enkeltvis belaster ioner. Sammensvergelser indusert dissosiasjon ble utløst da forløperen oversteg 100 ion teller. Den dynamiske varighet uttrekk ble satt til 30 sek. Lone akkumulering tid ble satt til 300 msek (MS) og 50ms (MS / MS).
9. Database Search
- Last ned P. aeruginosa NCBI-database via NCBI hjemmeside ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Konvertere MS rå spektra inn maskot generiske filer (MGF) ved hjelp av MassMatrix konverteringsverktøy ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Søk i dette mgf fila med MASCOT versjon 2.3 mot P. aeruginosa NCBI-database som inneholder forover og bakover-lokke protein oppføringer.
- Utfør en i silico trypsin fordøyelsen etter lysin og arginin (med mindre etterfulgt av prolin) tolerer to savnet splittelser i fullt tryptiske peptider.
- Still database søkeparametre for å tillate oksidering methioniner (15,99491 Da) som variable modifikasjoner og carboxyamidomethylation (57,021464 Da) av cysteinresidier som fast modifikasjon. For MASCOT søker ossing høyoppløselige skanninger, sett forløper masse toleranse til 15 ppm og sette fragment masse toleranse til 0,6 Da. Endelig satt proteinet FDR til 1%.
- Importere Mascot søk i P. aeruginosa CCMS eksperimenter i Stillas (Proteomesoftware, versjon 3), definerer parametrene for å få en protein FDR nær 1%, og trekke den totale spektrale teller.
- For de representative resultatene presentert i denne artikkelen, vi brukte en paret t-test for å sammenligne eksperimentet med konkurransen kontroll, og bare betraktet treff med en p-verdi under 0,1, og en spektral count ratio over 2 (eksperimentere spektrale tellinger / konkurranse kontroll spektral teller).
- Data kan eksporteres i noen regneark programvare for videre analyse.
10. Etikett-free Kvantifisering
- Importere rå filer inn Progenese LC-MS-programvare (lineære Dynamics, versjon 4.0).
- Utfør LC-MS justering og funksjonen deteksjon misligholdt settiNGS.
- Eksportere data i MGF format fra Progenese LC-MS.
- Søk i MS / MS spektra bruker MASCOT mot NCBI P. aeruginosa database som inneholder forover og bakover-lokke protein oppføringer.
- Importere database søkeresultatene til Progenese LC-MS og kartlegge peptider identifikasjoner til MS1 funksjoner.
- (: Q-verdi under 0,1, spektral count ratio over 2 terskel) for dataanalyse (beregning av signifikansnivåer, fold-endring forholdstall) den ProteinSQAnalysis manus av SafeQuant ble brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å identifisere nye c-di-GMP effektorer i P. aeruginosa vi brukte systematisk CCMS å analysere de løselige og membran fraksjoner av P. aeruginosa-stamme PAO1 fra en log fase kultur (OD 600 = 0,5). Her vi oppsummere og diskutere representative resultatene av denne fisketur. Fire uavhengige biologiske kopier ble anvendt. For hvert forsøk to forskjellige CDG-CC konsentrasjoner ble brukt (5 mikrometer og 10 mm). For å undersøke med hensyn til spesifisitet, ble eksperimenter utført i nærvær eller fravær av 1 mM c-di-GMP som konkurrent, og til slutt med en vulst kontroll (dvs. uten CDG-CC) (tabell 1).
Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i detalj ovenfor (figur 2) produserte vi en liste over fangede proteiner i en Stillas format. Sannsynlige forurensninger ble fjernet. Dette inkluderte ribosomale proteiner, streptavidin, trypsin, serumalbumin, keratin og andre humane proteiner. Proteinetidentifikasjon falsk funnrate (FDR) ble satt til 1% ved hjelp av Stillas programvare og data eksporteres til Excel. Sjonsnummer levert av Stillas kan konverteres til locus numre ved hjelp av FINN.RAD-funksjonen i Excel knyttet til en liste av P. aeruginosa locus tall. På dette trinn, innbefatter trefflisten 768 proteiner for den løselige fraksjon og 433 proteiner for membranfraksjonen. Imidlertid er de fleste proteiner som ikke i vesentlig grad anriket på fangst eksperimentet. Således ble proteiner som sannsynligvis fangede ikke-spesifikt (positive i vulsten kontrollen eller bare i nærvær av c-di-GMP konkurrent) fjernes. Vi beregnet en spektral telling forholdet mellom fangst eksperiment og konkurransen kontroll og bare betraktet proteiner med en ratio større enn to. I tillegg har vi ansatt en paret t-test på spektrale teller for å gi en betydning tiltaket mellom fangst eksperiment og konkurransen kontroll, og sette en givende terskel på 0,1. Til sluttVurderte vi bare robuste treff med minst fire peptider identifisert i de fire eksperimentene for 2 fangst sammensatte konsentrasjoner tatt helt. Disse kriteriene bør justeres etter behov og bruker verifisert og spådde c-di-GMP bindende proteiner som standard for å sette terskelen. Etter sortering ble listen redusert til 76 treff for den løselige fraksjon, og 133 proteiner for membranfraksjonen. Dette inkluderte 13 løselig og 21 membran proteiner fra P. aeruginosa som er kjent eller forutsagt til å binde c-di-GMP (tabell 2). De andre 63 oppløselige og 112 membranproteiner er nye antatte c-di-GMP-bindende proteiner som ikke inneholder en av de kjente c-di-GMP-bindende domener. Disse treff nå må valideres ved å teste deres spesifikk binding til c-di-GMP.
I et tidligere skjermbilde fisket vi GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) og Gsp69 (PA1127) 1. Disse tre proteinene ble klonet, overuttrykt, og renset fraE. coli og kunne valideres å binde c-di-GMP i UV-cross linking eksperimenter med 33 P-merket c-di-GMP 15. K D S ble bestemt til 1,0, 2,0 og 6,9 pM henholdsvis, noe som indikerer at faktisk nye effektorer kan identifiseres ved hjelp av CCMS.
I tillegg til dette representativt eksempel brukte vi CCMS med ekstrakter av celler høstet fra forskjellige vekstbetingelser, og med forskjellige intracellulære c-di-GMP konsentrasjoner (n = 24). Samlet vi fanget 74% (38/51) av kjent eller spådd P. aeruginosa PAO1 c-di-GMP signalkomponenter (24/32 løselige proteiner, 14/19 membran proteiner). Gitt at minst ni av disse genene ble vist å bli transkribert under spesielle forhold (oksidativt stress, quorum sensing, biofilm) 16, og at noen ikke kan binde c-di-GMP i det hele tatt, kan dette Dekningsgraden være nær metning. Dette sammen med observasjonen om at de fleste av disse komponentene were tatt med høy spesifisitet (tabell 2) sterkt argumenterer for at denne teknikken er effektiv og kraftig.
Figur 1: Kjemisk struktur av c-di-GMP Capture Compound.
Figur 2:. CCMS arbeidsflyt oppsummering Etter mekanisk lyse de frie nukleotider er fjernet ved hjelp av en PD10 utelukkelse kolonne. Proteiner fra de oppløselige eller membranfraksjoner ble inkubert med CDG-CC, og blandingen blir utsatt for UV-bestråling for å kryssbinde proteiner fanget. Trinn på harde vasking utføres med forbindelser bundet til streptavidin belagte magnetiske kuler. On-perle tryptic fordøyelse gir peptider,som deretter skilt fra perlene og proton for deres massespektrometri identifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
Figur 3: Volcanoplots av P. aeruginosa proteiner betydelig beriket av CCMS. Etter LC-MS / MS-analyse og etikett-fri kvantifisering ble sortert proteiner som beskrevet i teksten. Log2-intensitet forholdet mellom oppdaget peptid mellom fangst og konkurranse eksperimenter ble beregnet og plottet mot verdier avledet fra betydning analyse (modifisert t-statistikken, empirisk Bayes metode 17). Proteiner i betydningen tersklene for p-verdier <0,05 og intensitetsforhold> 1,5 ganger er .indikatorered i en grå boks. De fire replikater for den løselige fraksjon (A) og membranfraksjonen (B) ble utført i nærvær av 10 pM c-di-GMP-CC, og konkurranseeksperiment med 1 mM c-di-GMP. I sirklene prikker tilsvarer kjente c-di-GMP bindende proteiner. Klikk her for å se en større versjon av figuren.
| Capture: | Buffer | Kjemisk | Kilde | Konsentrasjon | |||||
| Bakteriell Lysis Buffer 10x | MES | Sigma | 67 mm | ||||||
| pH 7.5 | HEPES | Sigma | 67 mm | ||||||
| NaCl | Megrck | 2 M | |||||||
| Na Acetate | Merck | 67 mm | |||||||
| DTT | Fluka | 10 mm | |||||||
| DNaseI | Roche | 20 U / ml | |||||||
| Komplett proteasehemmer Cocktail | Roche | 1 tab / 10 ml | |||||||
| Capture Buffer 5x | HEPES | Sigma | 100 mM | ||||||
| KAc | Sigma | 250 mm | |||||||
| MgAc (vannfri) | Sigma | 50 mM | |||||||
| Glyserol | Sigma | 50% (V / V) | |||||||
| BNP, GTP, ATP, CTP | sigma | 1 mm hver | Vask buffer 5x | Tris-HCl | Merck | 1 M | |||
| (For den løselige fraksjon) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7.5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| n-oktyl-β-D-glukopyranosid | Anagrade (Affymetrix) | 42.5 mikrometer | |||||||
| Vask buffer 5x | Tris-HCl | Merck | 1 M | ||||||
| (For det membran fraksjon) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7.5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| Andre kjemikalier: | Ammoniumbicarbonat (ABC) | Fluka | |||||||
| Urea | Applichem | ||||||||
| MS prøveopparbeidelse: | Buffer | Kjemisk | Kilde | Konsentrasjon | |||||
| C18 Buffer A | TFA | Pierce | 0,1% (V / V) | ||||||
| H 2 O HPLC grad | 99,9% (V / V) | ||||||||
| C18 Buffer B | TFA | Pierce | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 49,9% (V / V) | |||||||
| H 2 O HPLC grad | 50% (V / V) | ||||||||
| C18 BufferC | TFA | Pierce | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 5% (V / V) | |||||||
| H 2 O HPLC grad | 94.9% (V / V) | ||||||||
| LC Buffer A | Maursyre | Sigma | 0,15% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 2% | |||||||
| H 2 O HPLC grad | 97,85% | ||||||||
| Andre kjemikalier: | tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) | Sigma | |||||||
| iodoacetamide (IAA) | Sigma | ||||||||
| N-acetyl-cystein | Sigma | ||||||||
| Endoproteinase Lys-C | Wako | ||||||||
| Trypsin | Promega |
Tabell 1: Buffere sammensetning Oppsummering av buffere sammensetning, kjemikalier og leverandører.. Den c-di-GMP-capture forbindelsen, c-di-GMP (for konkurranse kontroll), streptavidin belagte magnetiske kuler, fange buffer, og vaskebuffer er inkludert i caproKit.
| Perlene kontroll | Capture eksperiment | Konkurranse kontroll | |
| Protein-ekstrakt (10 mg / ml) | 30 pl | 30 pl | 30 pl |
| c-di-GMP (10 mm) | 0 mL | 0 mL | 10 pl |
| Nukleotider (10 mM av hver nukleotid) | 10 pl | 10 pl | 10 pl |
| Capture buffer 5x | 20 mL | 20 mL | 20 mL |
| H 2 O | 42 mL | 32 mL | 22 mL |
| 30 min inkubasjon | |||
| c-di-GMP ~ CC (lager 100 mm) | 0 mL | 5-10 mL | 5-10 mL |
| Sluttkonsentrasjoner: | Perlene kontroll | Capture eksperiment | Konkurranse kontroll |
| c-di-GMP ~ CC (mikrometer) | 0 mikrometer | 5-10 mikrometer | 5-10 mikrometer |
| Konkurrent c-di-GMP (mikrometer) | 0 mikrometer | 0 mikrometer | 1000 mikrometer |
Tabell 2:. Capture reaksjonsblandingen Oppsummering av reaksjonsblandingen for vulsten kontroll (dvs. uten fangst forbindelse), utløser eksperimentet (med c-di-GMP-CC), og konkurransen kontroll som inneholder et stort overskudd av c- di-GMP. C-GMP-di-CC endelig konsentrasjon kan justeres, og er vanligvis ligger mellom 5 og 10 uM.
| Protein navn | Locus ID | Domene arkitektur | fangst eksperiment / konkurranse eksperiment 1 | ||||||||||||||||||
| a) Løselig fraksjon | CDG-CC = 5 mikrometer | CDG-CC = 10 mikrometer | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WspR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ Td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | Pilz | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | Pilz | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b) Membran brøkdel | CDG-CC = 5 mikrometer | CDG-CC = 10 mikrometer | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| Mora | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| Bifa | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF domene som inneholder en I stedet | ||||||||||
| En rekke spektrale tellinger av identifiserte peptider | |||||||||||||||||||||
Tabell 3: P. aeruginosa kjent c-di-GMP aliserte komponenter spesifikt fanget. Disse proteinene ble først sortert som beskrevet i teksten. Proteiner er identifisert med deres navn og locus nummer, og vi indikere deres arkitektur spådd med NCBI konservert Domain Database nettbasert verktøy (n = 4, CDG-CC = 5 mikrometer eller 10 mm) for å vise fangst spesifisitet og reproduserbarhet av fremgangsmåten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spesiell forsiktighet bør utvises ved flere trinn i protokollen. Proteinkonsentrasjonen er en kritisk parameter med en konsentrasjon på 10 mg / ml er vanskelige å komme til når celler dyrkes under visse vekstbetingelser (f.eks biofilmer eller liten koloni varianter). Således bør pelleten resuspensjon utføres i et lavt volum av lyseringsbuffer. Proteinkonsentrasjonene kan reduseres til 8 mg / ml. I forhold til fremgangsmåten publisert av Nesper et al. 1, la vi forskjellige nukleotider til fangst reaksjonen for å minimere ikke-spesifikk fange av nukleotid-bindende proteiner. Selv om tilsetning av nukleotider forbedret spesifisitet, kan det på samme tid hindre innfanging av proteiner som binder forskjellige nukleotider på samme sted. For eksempel effektor FleQ, som nylig ble vist å binde ATP og c-di-GMP 18 ble fanget spesielt i fravær av ATP i vårt tidligere eksperiment 1, men ikke lenger i data presentert her, i nærvær av et overskudd av ATP.
CDG-CC bør være nøye beskyttet mot lys. Selv om det omgivende lys inneholder bare en liten brøkdel av UV, anbefales det å holde fangstforbindelsen lager pakket inn i aluminiumsfolie, så vel som av fangst blanding før aktivering ved hjelp av UV-bestråling. Vasketrinnene som følger kan være svært strenge for å øke spesifisiteten, som de fangede proteiner er kovalent bundet til CDG-CC. Angående LC-MS / MS-analyse, bør forsøkene utføres i et rent keratin fritt miljø. Videre bør HPLC kompatible buffere kan brukes, spesielt etter vasketrinnene. Kandidatlisten består vanligvis mellom 300 og 800 proteiner (for en fire eksemplarer), med lave variasjoner mellom replikater (se tabell 2 som et eksempel).
Noen parametere som protein og CDG-CC konsentrasjonen må kanskje være optimalisert avhengig av organismene ennalyzed. Siden lave rikelig proteiner eller proteiner uttrykt bare under spesielle forhold kan lett bli savnet, bør man være forsiktig angående kulturbetingelser. Dette problemet kan løses ved å sammenligne trefflisten med et globalt protein ATLAS samlet inn for de samme dyrkningsforhold. Endelig kan optimalisering av vaskemiddel være utfordrende, da det må være optimalisert med hensyn til sin evne til å oppløseliggjøre membranproteiner og må være kompatibel MS også.
Man må huske på at c-di-GMP molekyl av CC er kjemisk modifisert, som det er knyttet via 2'OH gruppe med ett ribose til resten av stillaset. Denne modifikasjon kan forandre dets evne til å binde seg til noen effektorer for derved å gi falsk-negative. I denne sammenheng er det verdt å merke seg at vi aldri fanget proteiner som havn en EAL domene men mangler en GGDEF domene i P. aeruginosa, selv om EAL proteiner ble tatt til fange i andre arter, som pressobacter crescentus. Dette kan skyldes en dårlig tilgang eller en lav affinitet av CDG-CC til bindingsstedet, eller til nedbrytning av CDG-CC etter EAL proteiner. I motsetning til dette, var det mange nukleotid-bindende proteiner som er tatt med en forholdsvis lav spesifisitet og, i stor grad, sannsynligvis falske positiver. Ytterligere kontroll av den spesifikke binding til c-di-GMP ved hjelp av teknikker som DRaCALA 20, UV-kryssbindings 15, differensial scanning fluorimetri (DSF) 21 mikro thermophoresis (MST) 22, isoterm kalorimetri (ITC) 23 - er 24 ... derfor nødvendig.
Det er også mulig at en brøkdel av c-di-GMP-delen av fangst forbindelsen blir nedbrutt av fosfodiesterase fra cellelysatet. Dette er en av grunnene til at fremgangsmåten har til å bli utført ved 4 ° C, og derfor begrense fosfodiesteraser aktivitet før tverrbinding.
Den procedure kan tilpasses til mange bakteriearter, og har vært brukt med hell for tre forskjellige bakteriearter med meget små modifikasjoner 1. Capture Forbindelse basert teknologi kan redusere falske-positive ved hjelp av grundig vask (f.eks 1 M salt, høy konsentrasjon vaskemiddel, 2 M urea i tilfelle av membranproteiner, 80% acetonitril), sammenlignet med andre teknikker som ikke er avhengige av kovalent binding. Gitt at validering av kandidater kan være en langtekkelig og tidkrevende prosess, er dette en stor fordel til alternative metoder som kjemiske proteomikk basert tilnærminger 14.
Dette illustreres video metoden etablerer CCMS som et kraftig og allsidig verktøy for å identifisere og karakterisere nye komponentene som er involvert i lite molekyl signalering. I fremtiden kan liknende Capture Forbindelser skjuler andre selektivitet grupper benyttes for å fange opp proteiner involvert i lite molekyl signalering, for eksempel de nye c-di-AMP effektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R.
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
