Abstract
Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het afgelopen decennium in de richting van de identificatie en karakterisering van enzymen die betrokken zijn bij de synthese (diguanylate cyclases) en afbraak (fosfodiesterasen) van de tweede boodschapper c-di-GMP. Daarentegen weinig informatie beschikbaar is over de moleculaire mechanismen en cellulaire componenten waardoor deze signalering molecuul regelt een breed scala van cellulaire processen. De meeste van de bekende effector-eiwitten behoren tot de familie Pilz of zijn gedegenereerd diguanylate cyclases of fosfodiesterases die op katalyse hebben gegeven en effector functie hebben aangenomen. Dus, om beter de cellulaire c-di-GMP netwerk definiëren diverse bacteriën experimentele vereist om nieuwe effectoren die betrouwbaar silico voorspellingen niet identificeren en te valideren.
We hebben onlangs een nieuwe Capture Compound massaspectrometrie (CCMS) gebaseerde technologie als een krachtig instrument om ontwikkeldbiochemisch identificeren en karakteriseren van c-di-GMP-bindende eiwitten. Deze techniek is eerder gerapporteerd voor diverse organismen 1 is. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van het protocol dat we gebruiken om dergelijke signaleringscomponenten sonde. Als voorbeeld, gebruiken we Pseudomonas aeruginosa, een opportunistisch pathogeen, waarbij c-di-GMP speelt een cruciale rol in virulentie en biofilm controle. CCMS geïdentificeerd 74% (38/51) van de bekende of voorspelde elementen van de C-di-GMP netwerk. Deze studie legt de CCMS procedure in detail, en stelt het als een krachtige en veelzijdige tool om nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.
Introduction
c-di-GMP is een belangrijke tweede messenger gebruikt door de meeste bacteriën diverse aspecten van hun groei en gedrag beheersen. Bijvoorbeeld, c-di-GMP reguleert celcyclus, motiliteit en de expressie van exopolysacchariden en oppervlak adhesinen 2-4. Door de coördinatie van dergelijke werkwijzen c-di-GMP bevordert biofilmvorming, een proces dat is geassocieerd met chronische infecties van verschillende pathogene bacteriën 5. c-di-GMP wordt gesynthetiseerd door enzymen genaamd diguanylate cyclases (DGCs) dat een katalytische GGDEF domein 4 haven. Sommige DGCs bezitten een remmende site die naar beneden regelt de cyclase activiteit op c-di-GMP bindend. De afbraak van c-di-GMP wordt gekatalyseerd door twee verschillende klassen van fosfodiësterases (PDE) herbergen ofwel een katalytische EAL of HD-GYP domein 6,7.
De meeste bekende effector eiwitten die direct binden c-di-GMP behoren tot één van drie klassen van eiwitten: katalytischebondgenoot inactief GGDEF of EAL domeinen en Pilz domeinen, kleine moleculaire schakelaars die vormveranderingen op c-di-GMP bindend 8 ondergaan. DGCs, PDE's en Pilz eiwitten zijn goed gekarakteriseerd en hun domeinen kunnen worden voorspeld in silico relatief veilig. Een bijzonder belang is nu gericht op de identificatie van nieuwe klassen van c-di-GMP effectoren. Sommige c-di-GMP effectoren met verschillende bindingsmotieven werden onlangs zoals beschreven als de CRP / Achterwaarts- eiwit familie Bcam1349 in Burkholderia cenocepacia of de transcriptionele regulator FleQ in P. aeruginosa 9,10. Bovendien werden c-di-GMP-specifieke riboswitches recent geïdentificeerd en naar genexpressie in een C-di-GMP-afhankelijke wijze 11. De c-di-GMP binding motieven van verschillende effectoren worden alleen slecht geconserveerd maken bioinformatic voorspellingen van dergelijke eiwitten moeilijk. Om dit probleem, een biochemische werkwijze, die is gebaseerd op het gebruik van een c-di-GMP spe ontwikkelden wefieke Capture Compound in combinatie met massaspectrometrie 1,12,13.
We hebben onlangs een nieuw ontworpen driewaardig c-di-GMP invangverbinding (CDG-CC figuur 1) 1. Deze chemische steiger bestaat uit: 1) een C-di-GMP eenheid gebruikt als aas voor c-di-GMP vangen bindende eiwitten, 2) een UV-licht activeerbare reactieve groep gebruikt verknopen de CDG-CC de gebonden eiwitten en 3) een biotine aan de gevangen eiwitten met streptavidine beklede magnetische korrels isoleren. De CDG-CC kan worden gebruikt om direct en specifiek vangen c-di-GMP effectoren van complex mengsel van macromoleculen zoals cellysaten. Invangverbinding gebaseerde chemische proteomics benaderingen zijn eerder gerapporteerd toepasbaar is op een groot aantal organismen, bijvoorbeeld Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium en P. aeruginosa 1,14.
In deze methodologische paper,Wij bieden een diepgaande beschrijving van het CCMS procedure met behulp van extracten van P. aeruginosa als voorbeeld. Deze studie stelt CCMS als een krachtige en veelzijdige tool om biochemisch nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysate Voorbereiding
- Groeien P. aeruginosa cellen in LB aan de gewenste OD.
LET OP: Voor de begeleiding: gebruik ≈ 100 ml cultuur / monster voor stationaire fase culturen en ≈ 500 ml cultur / monster voor logfase culturen (OD 600 nm = 0,5). - Pellet door centrifugatie gedurende 20 min bij 5000 x g.
- Hersuspendeer 0,5-1 g pellet in 1 ml lysis buffer (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM KAc, DDT 1 mM, pH 7,5) en voeg proteaseremmer (compleet mini, EDTA-vrij) alsook als DNasel.
- Lyse de cellen door 3 passages door een Franse druk cel, 20.000 psi (zie Materials List).
- Ultra-centrifuge het cellysaat bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Sla het supernatant (ga naar stap 2).
- Was de pellet met 1x lysis buffer 1 ml op en neer te pipetteren.
- Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Flash-bevriezen de pellet invloeibare stikstof en bewaar bij -20 ° C tot gebruik voor de vangst van membraaneiwitten (zie stap 3).
2. verwijdering van vrije c-di-GMP en andere nucleotiden (oplosbare fractie Only)
- Was een PD10 ontzoutingskolom (zie Materials List) met 10 ml koude lysisbuffer.
- Giet het supernatans (≈ 1 ml) op de PD10 om nucleotiden te verwijderen.
- Elueer met 4 ml koude lysisbuffer (500 ui treden).
- Selecteer de meest geconcentreerde fracties zoals bepaald door Bradford assay, en bundelen ze.
3. Pellet Resuspensie en Oplossen (membraanfractie Only)
- Resuspendeer de pellet in 500 tot 1000 pl 1x capture buffer (zonder detergens) (zie tabel 1).
OPMERKING: De pellet is moeilijk te mengen. Het is aangeraden om eerst pipet op en neer met een pipet om ruwweg resuspendeer de pellet, dan naar een spuit 27 G gebruiken om goed te homogeniseren van de oplossing. - Voeg 1% (w / v) n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM).
- Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur (of O / N) op een roterend wiel.
- Ultracentrifuge bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Oogst van het bovenstaande.
4. Eiwit meting van de concentratie
- Meet de eiwitconcentratie van Bradford assay (door BCA assay voor de membraanfractie).
- Stel het totale eiwitconcentratie 10 mg / ml.
5. Capture
- Meng 300 ug eiwit met 1 mM BBP, GTP, ATP, CTP, en 20 gl 5x capture buffer (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glycerol, pH 7,5) (Tabel 1). Stel het reactievolume van 100 ul met H2O
Opmerking: het totale volume omvat het volume van de CDG-CC en C-di-GMP bij de controle concurrentie (zie stap 5.3 en Tabel 2).
Opmerking: Alle experimenten werden uitgevoerd in 200 &# 181; l 12-tube PCR-strips (Thermo Scientific).
LET OP: voor het membraan fractie, zorg ervoor om altijd de DDM concentratie boven de kritische micel concentratie (0,01% w / v) totdat het eiwit solubilisatiestap in 8 M ureum (Stap 7.1). - Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min op een roterend wiel.
- Voeg 10 uM CDG-CC (eindconcentratie).
OPMERKING: onder controle zonder CDG-CC (aangeduid als "bead control"), en een controle aangevuld met 1 mM c-di-GMP ("competitie control") (zie tabel 2).
OPMERKING: de CDG-CC concentratie kan worden ingesteld van 1 tot 10 uM. - Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur (O / N voor de membraanfractie) op een roterend wiel in het donker.
- Na een korte centrifuge, verknopen door activering van de reactieve eenheid van de CDG-CC met UV-licht gedurende 4 minuten, met behulp van een CaproBox (zie Materials List, λ = 310 nm, Bestralingssterkte ≥10 mW / cm², afstand van de bron = 2 cm). OPMERKING: verwijder het deksel van de stroken voorafgaande verknoping.
- Voeg 25 ul 5x wasbuffer (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) en 50 pi goed geresuspendeerde streptavidine magnetische korrels, zacht homogeniseren.
- Incubeer bij 4 ° C gedurende 1 uur op een roterend wiel.
6. Wassen Stappen
LET OP: (Magnet: zie Materials List). Begin met een capture van de magnetische korrels in de PCR strip deksel, met de magneet. Vervang dan de PCR-strip door een nieuwe met daarin de volgende wasbeurt oplossing. Verwijder de magneet en resuspendeer de kralen en incubeer 2 minuten. Spin down en plaats het deksel door een frisse deksel.
- Wassen stappen (oplosbare fractie alleen)
- Spoel 6 keer in 200 gl 1 x wasbuffer.
- Was eenmaal met 200 ui HPLC kwaliteit H2O
- Spoel 6 keer in 200 pl 80% acetonitril.
- Was 2 keer in 200 pl HPLC kwaliteit H2O
- Wassen stappen (membrane fractie alleen)
- Was 5 keer in 200 gl 1 x wasbuffer + 0,1% DDM.
- Was 2 keer in 200 gl 1 x wasbuffer + 0,05% DDM.
- Was eenmaal met 200 ui 1 x wasbuffer + 0,025% DDM.
- Was eenmaal in 200 ul 1x wassen buffer + 0,0125% DDM.
- Was 3 maal in 200 ul 100 mM ABC (ammoniumbicarbonaat, NH4 CO 3) + 2 M ureum.
7. MS Monstervoorbereiding
- Resuspendeer de kralen (direct in het deksel) in 20 pi 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M ureum voor de membraanfractie) en zetten in 1,5 ml buizen.
- Alleen membraanfractie: incuberen bij 60 ° C gedurende 5 minuten schudden bij 500 rpm.
- Voeg 0,5 gl 200 mM TCEP (tris (2-carboxyethyl) fosfine) en incubeer bij 60 ° C gedurende 1 uur schudden bij 500 rpm. Afkoelen tot 25 ° C.
- Voeg 0,5 ul van vers bereide 400 mM joodacetamide en incubeer bij 25 ° C gedurende 30 min schudden van eenT 500 rpm en in het donker.
- Voeg 0,5 gl 0,5 M N-acetyl-cysteïne en incubeer bij 25 ° C gedurende 10 minuten schudden bij 500 rpm.
- Membraanfractie slechts: voeg 1 pl Lys-C en incubeer bij 37 ° C, O / N.
- Voeg 2 ug trypsine en incubeer O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 500 rpm (wrap in Parafilm om uitdroging te voorkomen).
OPMERKING: de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in dit stadium.
OPMERKING: membraanfractie alleen: voeg 100 mM ABC aan de ureumconcentratie op <2 M te passen voor toevoeging van trypsine. - Kort spin down de buizen en het verzamelen van kralen met de magneet.
- Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis (herhaal deze stap over als kralen worden gelaten).
- Voeg 5 ul 5% TFA (trifluorazijnzuur) + 1 gl 2 M HCl (15 pl 5% TFA + 5 gl 2 M HCl gedurende de membraanfractie).
- Voorwaarde C18 MicroSpin kolommen (The Nest Group, MA, USA) met 150 ul acetonitril (spin 20 sec bij 2.400 tpm).
- Equitrillen de C18 kolommen 2 maal met 150 ui 0,1% TFA (spin 20 sec, 2400 rpm).
- Laad het monster en spin 2 min, 2000 rpm.
- Laad de doorstroming op de kolom en herhaal de draaiende stap (2 min, 2000 rpm).
- Was 3 maal met 150 ui 0,1% TFA, 5% azijnzuurnitril (20 sec, 2400 rpm).
- Neem een nieuwe buis en elueer tweemaal met 150 pl 0,1% TFA, 50% acetonitril (2 min, 2000 rpm).
- Droog de peptiden in een speed-vac.
- Resuspendeer in 40 ui 98% H2O, 2% acetonitril, 0,15% mierenzuur.
- Sonicaat 20 sec (pulscyclus 0.5, amplitude 100%; zie Materials List) en spin down 5 sec, 12.000 rpm (tafelcentrifuge). Vortex 10 sec, en spin down 5 sec, 12.000 rpm. Transfer in een HPLC flesje voor LC-MS / MS analyse.
- Invriezen bij -20 ° C.
OPMERKING: de monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in dit stadium.
8. LC-MS / MS-analyse
- Voer een nano-LC (nano-LC-systemen) equipped met een RP-HPLC-kolom (75 urn x 37 cm) gepakt met C18 hars (Magic C18 AQ 3 urn) met een lineaire gradiënt van 95% oplosmiddel A (0,15% mierenzuur, 2% acetonitril) en 5% solvent B ( 98% acetonitril, 0,15% mierenzuur) tot 35% oplosmiddel B over 60 minuten bij een stroomsnelheid van 0,2 ul / min.
- Analyseer de peptiden met LC-MS / MS (dubbeldrukschakelaar LTQ-Orbitrap Velos massaspectrometer verbonden met een electrospray ionenbron).
OPMERKING: De data acquisitie actief was een hoge resolutie MS scannen in de FT van de massa spectrometer met een resolutie van 60.000 FWHM gevolgd door MS / MS scans in de lineaire ionenval van de 20 meest intense ionen te verkrijgen. Om de efficiëntie van MS / MS pogingen te verhogen, werd de geladen toestand screening modus ingeschakeld toegewezen te sluiten en alleen laadt ionen. Collusie geïnduceerde dissociatie werd geactiveerd als de voorloper overschreden 100 ion telt. De dynamische duur uitsluiting werd ingesteld op 30 sec. De ion-accumulatie tijd was ingesteld op 300 msec (MS) en 50msec (MS / MS).
9. Database Zoeken
- Download de P. aeruginosa NCBI-databank via de NCBI homepage ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Omzetten van de MS ruwe spectra in mascotte generieke bestanden (MGF) met behulp van de MassMatrix conversie-tool ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Zoek door deze mgf bestand met behulp van MASCOT versie 2.3 ten opzichte van de P. aeruginosa NCBI-database met daarin vooruit en achteruit-decoy eiwit inzendingen.
- Voer een in silico trypsinedigestie na lysine en arginine (tenzij gevolgd door proline) tolereren twee gemiste breuklijnen in volledig tryptische peptiden.
- Stel de database aan naar geoxideerd methionines (15,99491 Da) als variabele wijzigingen en carboxyamidomethylation (57,021464 Da) van cysteïne residuen als vaste modificatie mogelijk te maken. Voor MASCOT zoekt onsing hoge-resolutie scans, stel de voorloper massa tolerantie tot 15 ppm en stel het fragment massa tolerantie tot 0,6 Da. Tenslotte stelt het eiwit FDR tot 1%.
- Importeer de Mascot zoekopdrachten van P. aeruginosa CCMS experimenten in Steiger (Proteomesoftware, versie 3), de parameters aan een eiwit FDR dicht bij 1% te verkrijgen, en haal de totale spectrale telt.
- Voor de representatieve resultaten in dit document, gebruikten we een gepaarde T-test om te vergelijken het experiment met de controle concurrentie, en alleen beschouwd hits met een p-waarde van minder dan 0,1, en een spectrale telling verhouding boven de 2 (experimenteren spectrale tellingen / competition controle spectrale tellingen).
- Gegevens kunnen worden geëxporteerd in een spreadsheet-software voor verdere analyse.
10.-Label gratis Kwantificering
- Importeer de raw-bestanden in Progenesis LC-MS-software (niet-lineaire dynamica, Versie 4.0).
- Voeren LC-MS uitlijning en functie detectie in gebreke settiNGS.
- De gegevens in MGF-formaat te exporteren uit Progenesis LC-MS.
- Zoeken in de MS / MS spectra met behulp van de MASCOT tegen de NCBI P. aeruginosa database met daarin vooruit en achteruit-decoy eiwit inzendingen.
- De database zoekresultaten in Progenesis LC-MS te importeren en in kaart de peptiden identificaties te MS1 functies.
- Voor de evaluatie van gegevens (berekening van betekenis niveaus, vouw-verandering ratio) de ProteinSQAnalysis script van SafeQuant werd gebruikt (drempel: q-waarde onder de 0,1, spectrale telling verhouding boven de 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om nieuwe C-di-GMP effectoren in P. identificeren aeruginosa we systematisch gebruikt CCMS om de oplosbare en membraan fracties van P. analyseren aeruginosa stam PAO1 uit een log-fase cultuur (OD 600 = 0,5). Hier samenvatten en bespreken we representatieve resultaten van deze vissen expeditie. Vier onafhankelijke biologische replica's werden gebruikt. Voor elk experiment twee CDG-CC concentraties werden gebruikt (5 uM en 10 uM). Sonderen van specificiteit werden experimenten uitgevoerd in de aanwezigheid of afwezigheid van 1 mM c-di-GMP als concurrent en tenslotte uitgevoerd met een kraal controle (zonder CDG-CC) (Tabel 1).
Wanneer na de hierboven gedetailleerd beschreven (figuur 2) Werkwijze produceerden we een lijst van gevangen eiwitten in een steiger formaat. Mogelijke contaminanten werden verwijderd. Dit omvatte ribosomale eiwitten, streptavidine, trypsine, serumalbumine, keratine en andere menselijke eiwitten. Het eiwitidentificatie valse ontdekking rate (FDR) werd ingesteld op 1% met behulp van de Steiger van software, en de gegevens geëxporteerd naar Excel. De toetreding nummer verstrekt door Steiger kan worden omgezet in locus nummers met behulp van de functie VERT.ZOEKEN in Excel gekoppeld aan een lijst van de P. aeruginosa locus nummers. In dit stadium resultatenlijst omvat 768 eiwitten voor de oplosbare fractie en 433 eiwitten voor de membraanfractie. Echter, de meeste eiwitten niet verrijkt in de capture experiment. Aldus eiwitten die waarschijnlijk niet specifiek zijn vastgelegd (positief in de kraal control of alleen in de aanwezigheid van c-di-GMP concurrent) verwijderd. We berekenden een spectrale telling verhouding tussen de capture experiment en de controle concurrentie en alleen als eiwitten met een verhouding groter dan twee. Daarnaast werkzaam we een gepaarde t-test op spectrale tellingen naar een betekenis maatregel tussen de vangst experiment en de controle concurrentie te bieden, en stel een tolerante drempel van 0,1. TenslotteWe overwogen alleen robuust hits met minstens vier peptiden die in de vier experimenten voor 2 invangverbinding concentraties geheel genomen. Deze criteria moeten worden aangepast aan de behoeften en met de geverifieerde en voorspelde C-di-GMP bindende eiwitten standaard de drempel. Na het sorteren werd de lijst verlaagd tot 76 hits van de oplosbare fractie, en 133 eiwitten voor de membraanfractie. Dit omvatte 13 oplosbaar en 21 membraaneiwitten uit P. aeruginosa die bekend of voorspeld c-di-GMP (tabel 2) binden. De andere 63 oplosbare en 112 membraaneiwitten zijn nieuw vermeende c-di-GMP bindende eiwitten die niet een van de bekende C-di-GMP bindende domeinen bevatten. Deze treffers nu worden bevestigd door het testen van hun specifieke binding aan c-di-GMP.
In een vorig scherm visten we GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) en Gsp69 (PA1127) 1. Deze 3 eiwitten zijn gekloneerd, tot overexpressie gebracht en gezuiverd uitE. coli en kan worden bevestigd aan c-di-GMP binden UV-cross linking experimenten met 33P gemerkte c-di-GMP 15. De Kd's werden bepaald op 1,0, 2,0 en 6,9 uM wat aangeeft dat inderdaad nieuwe effectoren kunnen worden geïdentificeerd door CCMS.
Daarnaast representatief voorbeeld gebruikten we CUMM met extracten van cellen geoogst van verschillende groeiomstandigheden en met verschillende intracellulaire C-di-GMP concentraties (n = 24). Over het algemeen gevangen we 74% (38/51) van de bekende of voorspelde P. aeruginosa PAO1 c-di-GMP signaleringscomponenten (24/32 oplosbare eiwitten, 14/19 membraaneiwitten). Aangezien ten minste negen van deze genen werden onder specifieke omstandigheden (oxidatieve stress, quorum sensing, biofilms) 16 worden getranscribeerd en sommige C-di-GMP niet kunnen binden helemaal, kan dit dekkingsgraad bijna verzadigd zijn. Dit samen met de constatering dat de meeste van deze componenten were gevangen met een hoge specificiteit (tabel 2) sterk stelt dat deze techniek is effectief en krachtig.
Figuur 1: Chemische structuur van het c-di-GMP invangverbinding.
Figuur 2:. CUMM Werkstroomoverzicht na mechanische lysis de vrije nucleotiden worden verwijderd met een PD10 kolom uitsluiting. Eiwitten van de oplosbare of membraan fracties worden geïncubeerd met de CDG-CC en het mengsel wordt blootgesteld aan UV straling verknoopt gevangen eiwitten. Stappen van harde wassen wordt uitgevoerd met verbindingen gebonden aan streptavidine gecoate magnetische korrels. On-bead tryptische digestie peptiden,die vervolgens worden gescheiden van de kralen en geprotoneerd voor hun massa identificatie spectrometrie. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Volcanoplots P. aeruginosa eiwitten aanzienlijk verrijkt door CCMS. Na LC-MS / MS analyse en labelvrije kwantificering werden eiwitten gesorteerd zoals beschreven in de tekst. Log2-intensiteit verhouding van gedetecteerde peptide tussen de vangst en de competitie-experimenten werden berekend en uitgezet tegen de waarden die zijn afgeleid van significantieanalyse (gewijzigde t-statistiek, empirische Bayes methode 17). Eiwitten in de significantie drempels voor p-waarden <0,05 en intensiteitsverhoudingen> 1,5-voudig zijn indicated in een grijs kader. De 4 replicaten voor de oplosbare fractie (A) en de membraanfractie (B) werden uitgevoerd in de aanwezigheid van 10 uM C-di-GMP-CC en de competitie experiment met 1 mM c-di-GMP. De omcirkelde punten overeen met bekende c-di-GMP-bindende eiwitten. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
| Capture: | Buffer | Chemisch | Bron | Concentratie | |||||
| Bacteriële Lyseerbuffer 10x | MES | Sigma | 67 mM | ||||||
| pH 7,5 | HEPES | Sigma | 67 mM | ||||||
| NaCl | MijRCK | 2 M | |||||||
| Na-acetaat | Merck | 67 mM | |||||||
| DTT | Fluka | 10 mM | |||||||
| DNasel | Roche | 20 U / ml | |||||||
| Compleet Proteaseremmer Cocktail | Roche | 1 tab / 10 ml | |||||||
| Opnamebuffer 5x | HEPES | Sigma | 100 mM | ||||||
| KAc | Sigma | 250 mM | |||||||
| MgAc (watervrij) | Sigma | 50 mM | |||||||
| Glycerol | Sigma | 50% (V / V) | |||||||
| BBP, GTP, ATP, CTP | sigma | 1 mM elk | Wasbuffer 5x | Tris-HCl | Merck | 1 M | |||
| (Voor de oplosbare fractie) | EDTA | Sigma | 0.5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| n-octyl-β-D-glucopyranoside | Anagrade (Affymetrix) | 42,5 uM | |||||||
| Wasbuffer 5x | Tris-HCl | Merck | 1 M | ||||||
| (Voor de membraanfractie) | EDTA | Sigma | 0.5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| Andere chemische stoffen: | Ammoniumbicarbonaat (ABC) | Fluka | |||||||
| Ureum | Applichem | ||||||||
| MS monstervoorbereiding: | Buffer | Chemisch | Bron | Concentratie | |||||
| C18 Buffer A | TFA | Doorboren | 0,1% (V / V) | ||||||
| H2O HPLC-kwaliteit | 99.9% (V / V) | ||||||||
| C18 buffer B | TFA | Doorboren | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 49.9% (V / V) | |||||||
| H2O HPLC-kwaliteit | 50% (V / V) | ||||||||
| C18 BufferC | TFA | Doorboren | 0,1% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 5% (V / V) | |||||||
| H2O HPLC-kwaliteit | 94.9% (V / V) | ||||||||
| LC Buffer A | Mierenzuur | Sigma | 0.15% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 2% | |||||||
| H2O HPLC-kwaliteit | 97.85% | ||||||||
| Andere chemische stoffen: | tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) | Sigma | |||||||
| joodacetamide (IAA) | Sigma | ||||||||
| N-acetyl-cysteïne | Sigma | ||||||||
| Endoproteinase Lys-C | Wako | ||||||||
| Trypsine | Promega |
Tabel 1: Buffers samenstelling Samenvatting van de buffers samenstelling, chemicaliën en leveranciers.. De c-di-GMP-invangverbinding, c-di-GMP (voor controle competitie), streptavidine beklede magnetische korrels capture buffer en wasbuffer zijn in de caproKit.
| Kraal controle | Capture experiment | Competition controle | |
| Eiwit extract (10 mg / ml) | 30 pi | 30 pi | 30 pi |
| c-di-GMP (10 mM) | 0 pi | 0 pi | 10 gl |
| Nucleotiden (10 mM van elk nucleotide) | 10 gl | 10 gl | 10 gl |
| Opnamebuffer 5x | 20 gl | 20 gl | 20 gl |
| H2O | 42 pi | 32 pi | 22 pi |
| 30 min incubatie | |||
| c-di-GMP ~ CC (voorraad 100 uM) | 0 pi | 5-10 pi | 5-10 pi |
| Uiteindelijke concentraties: | Kraal controle | Capture experiment | Competition controle |
| c-di-GMP ~ CC (uM) | 0 uM | 5-10 uM | 5-10 uM |
| Concurrent C-di-GMP (uM) | 0 uM | 0 uM | 1000 uM |
Tabel 2:. Capture reactiemengsel Samenvatting van het reactiemengsel voor de kraal controle (zonder invangverbinding) het vangen experiment (met de c-di-GMP-CC) en de competitie controle die een grote overmaat van c bevat di-GMP. De c-di-GMP-CC eindconcentratie kan worden ingesteld, en wordt typisch ingesteld tussen 5 en 10 uM.
| Eiwit naam | Locus ID | Domein architectuur | capture experiment / competitie experiment 1 | ||||||||||||||||||
| a) oplosbare fractie | CDG-CC = 5 uM | CDG-CC = 10 uM | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WSPR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ Td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| FimX | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | Pilz | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 7/1 | 6/2 | 9/1 | 7/1 | |||||||||||
| - | PA2799 | Pilz | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b) membraanfractie | CDG-CC = 5 uM | CDG-CC = 10 uM | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-HAMP-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| Mora | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 7/3 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 7/1 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 5/1 | 3/0 | |||||||||||
| Bifa | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 2/1 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 5/2 | 11/2 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | HAMP-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF domein dat I plaats | ||||||||||
| 1 aantal spectrale tellingen van geïdentificeerde peptiden | |||||||||||||||||||||
Tabel 3: P. aeruginosa bekende c-di-GMP signaleringscomponenten specifiek vastgelegd. Geïdentificeerde proteïnen werden eerst gesorteerd zoals beschreven in de tekst. Eiwitten worden geïdentificeerd met hun naam en nummer locus, en we geven hun architectuur voorspeld de NCBI Behouden domeindatabase online tool (n = 4, CDG-CC = 5 uM of 10 uM) om de vangst specificiteit en reproduceerbaarheid tonen van de werkwijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Speciale aandacht moet worden genomen op verschillende stappen van het protocol. De eiwitconcentratie is een kritische parameter met een concentratie van 10 mg / ml moeilijk te bereiken wanneer de cellen worden gekweekt onder specifieke kweekomstandigheden (bijvoorbeeld biofilms of kleine kolonie varianten). Aldus zullen pellet resuspensie worden uitgevoerd in een klein volume lysisbuffer. Proteïne concentraties worden verlaagd tot 8 mg / ml. Vergeleken met de werkwijze gepubliceerd door Nesper et al. 1, we verschillende nucleotiden toegevoegd vangstreactie aspecifieke vastleggen van nucleotide bindende eiwitten te minimaliseren. Hoewel de toevoeging van nucleotiden verbeterde de specificiteit, kan het tegelijkertijd voorkomen opname van eiwitten die verschillende nucleotiden op dezelfde plaats binden. Bijvoorbeeld de effector FleQ, dat onlangs is aangetoond dat ATP bindt en c-di-GMP 18 werd specifiek meer gevangen in de afwezigheid van ATP in onze vorige experiment 1, maar niet in het data hier gepresenteerde in aanwezigheid van een overmaat ATP.
De CDG-CC moet zorgvuldig worden beschermd tegen het licht. Hoewel omgevingslicht bevat slechts een kleine fractie van UV, wordt aanbevolen de vangverbinding stock gewikkeld in aluminiumfolie, evenals de opname mengsel vóór activering door UV-bestraling houden. De wasstappen die volgen kan zeer streng om de specificiteit te verhogen, aangezien de gevangen eiwitten covalent gebonden aan de CDG-CC. Wat de LC-MS / MS analyse, worden de proeven uitgevoerd in een schone keratine omgeving. Bovendien moet HPLC verenigbare buffers worden gebruikt, vooral na de wasstappen. De kandidaatslijst omvat typisch tussen 300 en 800 eiwitten (voor een viervoud), met lage variatie tussen de herhalingen (zie tabel 2 als een voorbeeld).
Sommige parameters zoals het eiwit en de CDG-CC concentratie zou moeten worden geoptimaliseerd afhankelijk van de organismen eennalyzed. Sinds lage overvloedige proteïnen of eiwitten uitgedrukt alleen onder specifieke omstandigheden gemakkelijk kan worden gemist, moet ervoor worden genomen ten aanzien van de kweekomstandigheden in dienst. Dit probleem kan worden overwonnen door vergelijking van de trefferlijst een globale eiwit ATLAS verzameld voor dezelfde kweekomstandigheden. Tenslotte kan de optimalisatie van het detergens uitdaging, aangezien het moet worden geoptimaliseerd met betrekking tot zijn vermogen om membraanproteïnen oplosbaar te maken en moet ook MS verenigbaar zijn.
Men moet in gedachten houden dat de c-di-GMP molecuul van de CC chemisch gemodificeerd, omdat het verbonden is via de 2'OH groep van een ribose aan de rest van de steiger. Deze wijziging zou het vermogen te binden aan bepaalde effectoren waardoor vals-negatieven te veranderen. In dit verband is het opmerkelijk dat we nooit gevangen eiwitten die een EAL domeinregistratie haven maar missen een GGDEF domein in P. aeruginosa, hoewel EAL eiwitten werden gevangen in andere soorten, zoals Caulobacter crescentus. Dit kan worden veroorzaakt door een slechte toegang of lage affiniteit van de CDG-CC aan de bindingsplaats, of de afbraak van de CDG-CC by EAL eiwitten. Daarentegen werden vele nucleotide bindende eiwitten die met een relatief lage specificiteit en in hoge mate waarschijnlijk vals positieven. Verdere validatie van de specifieke binding aan c-di-GMP met technieken als DRaCALA 20, UV verknoping 15, differentiële scanning fluorimetrie (DSF) 21 microschaal thermophoresis (MST) 22 isothermische calorimetrie (ITC) 23-24 ... is dus noodzakelijk.
Het is ook mogelijk dat een gedeelte van de c-di-GMP deel van de invangverbinding afbraak van fosfodiësterasen van het cellysaat. Dit is een van de redenen waarom de procedure uitgevoerd bij 4 ° C worden uitgevoerd, dus het beperken van de fosfodiësterasen activiteit voor verknoping.
De procedure kan aan veel bacteriën, en is met succes gebruikt voor 3 verschillende bacteriële species met zeer geringe wijzigingen 1. Invangverbinding gebaseerde technologie vals-positieven te verminderen door grondig wassen (bijvoorbeeld 1 M zout, hoge detergensconcentratie, 2 M ureum bij membraaneiwitten, 80% acetonitril), vergeleken met andere technieken die niet afhankelijk covalente binding. Aangezien validatie kandidaten een vervelend en tijdrovend kan zijn, is dit een groot voordeel om alternatieve methoden zoals proteomics chemische benaderingen 14.
Deze geïllustreerde video methode stelt CCMS als een krachtig en veelzijdig hulpmiddel voor het identificeren en karakteriseren van nieuwe componenten betrokken bij kleine molecule signalering. In de toekomst zouden soortgelijke invangverbindingen huisvesten andere selectiviteit groepen worden gebruikt om eiwitten betrokken bij kleine moleculen signalering, zoals de nieuwe c-di-AMP effectoren vangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R.
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
