Abstract
Betydande framsteg har gjorts under det senaste decenniet mot identifiering och karakterisering av enzymer involverade i syntesen (diguanylate cyclases) och nedbrytnings (fosfodiesteraser) av den andra budbäraren c-di-GMP. I motsats härtill finns lite information om de molekylära mekanismer och cellulära komponenter genom vilka denna signalmolekyl reglerar en rad olika cellulära processer. De flesta av de kända effektorproteiner tillhör Pilz familjen eller degenererade diguanylate cyclases eller fosfodiesteraser som har gett upp på katalys och har antagit effektorfunktion. Således, för att bättre definiera cellulära c-di-GMP-nätverk i ett brett spektrum av bakterier experimentella metoder krävs för att identifiera och validera nya effektorer som tillförlitliga i silico förutsägelser misslyckas.
Vi har nyligen utvecklat en ny Capture Compound masspektrometri (CCMS) baserad teknik som ett kraftfullt verktyg för attbiokemiskt identifiera och karakterisera c-di-GMP bindande proteiner. Denna teknik har tidigare rapporterats vara tillämplig på ett brett spektrum av organismer 1. Här ger vi en detaljerad beskrivning av det protokoll som vi använder för att sondera sådana signaleringskomponenter. Som ett exempel, använder vi Pseudomonas aeruginosa, en opportunistisk patogen där c-di-GMP spelar en avgörande roll i virulens och biofilmkontroll. CCMS identifierade 74% (38/51) av de kända eller förutsagda komponenter av c-di-GMP-nätverk. Denna studie förklarar CCMS förfarandet i detalj, och etablerar den som en kraftfull och mångsidigt verktyg för att identifiera nya komponenter som små signalmolekyl.
Introduction
c-di-GMP är en viktig andra budbärare som används av de flesta bakterier för att styra olika aspekter av deras tillväxt och beteende. Till exempel, c-di-GMP reglerar cellcykelprogression, motilitet och uttrycket av exopolysackarider och ytbehandlings adhesiner 2-4. Genom samordning av sådana processer c-di-GMP främjar biofilmbildning, en process som är associerad med kroniska infektioner av olika patogena bakterier 5. c-di-GMP syntetiseras av enzymer som kallas diguanylate cyclases (DGCs) som hyser en katalytisk GGDEF domän 4. Vissa DGCs besitter en hämmande webbplats som nedreglerar cyklas aktivitet vid c-di-GMP bindande. Nedbrytningen av c-di-GMP katalyseras av två distinkta klasser av fosfodiesteraser (PDE) hyser antingen en katalytisk EAL eller HD-GYP domän 6,7.
Majoriteten av de kända effektorproteiner som direkt binder c-di-GMP tillhör en av endast tre klasser av proteiner: katalytiskallierad inaktiva GGDEF eller EAL-domäner och Pilz domäner, små molekylära switchar som genomgår konformationsförändringar vid c-di-GMP bindande 8. DGCs, PDE och Pilz proteiner är väl karakteriserade och deras domäner kan förutsägas in silico relativt säkert. En särskilt intresse är nu inriktad på att identifiera nya klasser av c-di-GMP effektorer. Vissa c-di-GMP effekten med olika bindningsmotiv beskrevs nyligen som CRP / FNR proteinfamiljen Bcam1349 i Burkholderia cenocepacia eller transkriptionsregulator FleQ i P. aeruginosa 9,10. Dessutom har c-di-GMP-specifika riboswitches nyligen identifierats och visat att kontrollera genuttrycket i en c-di-GMP-beroende sätt 11. De c-di-GMP bindande motiv av olika effekten bara dåligt bevarade göra bioinformatiska förutsägelser om sådana proteiner svårt. För att lösa detta har vi utvecklat en biokemisk metod, som bygger på användningen av en c-di-GMP specifik Capture Compound kombinerad med masspektrometri 1,12,13.
Vi har nyligen engineered en roman trevärd c-di-GMP Capture Förening (CDG-CC, fig 1) en. Denna kemiska byggnadsställningen är sammansatt av: en) en c-di-GMP-delen används som bete för att fånga c-di-GMP-bindande proteiner, 2) en UV-fotoaktiverbar reaktiv grupp som används för att tvärbinda CDG-CC till de bundna proteinerna och 3) en biotin till isolera de infångade proteinerna med användning av streptavidinbelagda magnetiska pärlor. CDG-CC kan användas för att direkt och specifikt fånga c-di-GMP effektorer från komplex blandning av makromolekyler som cellysat. Capture Compound baserad och kemiska proteomik baserade metoder har tidigare rapporterats vara tillämplig på ett brett spektrum av organismer, t.ex. Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium och P. aeruginosa 1,14.
I detta metodpapper,vi ger en djupgående beskrivning av CCMS proceduren med extrakt av P. aeruginosa som ett exempel. Denna studie etablerar CCMS som ett kraftfullt och mångsidigt verktyg för att biokemiskt identifiera nya komponenter som små signalmolekyl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lysat Framställning
- Grow P. aeruginosa celler i LB till önskad OD.
OBS: För vägledning: använd ≈ 100 ml kultur / prov för stationära fas kulturer och ≈ 500 ml cultur / prov för log fas kulturer (OD 600 nm = 0,5). - Pellets genom centrifugering under 20 min vid 5000 x g.
- Resuspendera 0,5-1 g pelleten i 1 ml lyseringsbuffert (6,7 mM MES, 6,7 mM HEPES, 200 mM NaCl, 6,7 mM Kac, DDT 1 mM, pH 7,5) och tillsätt proteasinhibitor (fullständig mini, EDTA-fri) såväl som DNasI.
- Lyse cellerna genom 3 passager genom en fransk tryckcell, vid 20.000 psi (se Material List).
- Ultra-centrifug cellysatet vid 100000 x g under 1 h vid 4 ° C.
- Spara supernatanten (gå till steg 2).
- Tvätta pelleten med 1 ml 1x lysbuffert genom pipettering upp och ned.
- Ultracentrifug vid 100000 x g under 1 h vid 4 ° C.
- Flash-frysa pelleten iflytande kväve och förvara vid -20 ° C tills de användes för avskiljning av membranproteiner (se steg 3).
2. Borttagning av Free c-di-GMP och Andra nukleotider (löslig fraktion Only)
- Tvätta en PD10 avsaltningskolonn (se Material List) med 10 ml kall lysbuffert.
- Häll supernatanten (≈ 1 ml) på PD10 för att avlägsna nukleotider.
- Eluera med 4 ml kall lysbuffert (500 mikroliter steg).
- Välj de mest koncentrerade fraktionerna som bestäms av Bradford-analys, och förena dem.
(Endast membranfraktionen) 3. Pellet resuspension och Solubilisering
- Återsuspendera pelleten i 500 till 1000 | il 1x infångningsbuffert (utan rengöringsmedel) (se tabell 1).
OBS: Pellets är svår att suspendera. Det rekommenderas att första pipett upp och ner med en pipett till grovt suspendera pelleten, sedan använda en spruta 27 G till väl homogenisera lösningen. - Lägg ett% (vikt / volym) n-dodekyl-β-D-maltopyranosid (DDM).
- Inkubera vid 4 ° C under minst 2 h (eller O / N) på ett roterande hjul.
- Ultracentrifug vid 100000 x g under 1 h vid 4 ° C.
- Skörda supernatanten.
4. Proteinkoncentrationsmätning
- Mät proteinkoncentrationen genom Bradford-analys (genom BCA-analys för membranfraktionen).
- Ställ den totala proteinkoncentrationen till 10 mg / ml.
5. Fånga
- Blanda 300 ^ g protein med 1 mM av BNP, GTP, ATP, CTP, och 20 ul av 5x infångningsbuffert (100 mM HEPES, 250 mM KAc, 50 mM MgAc, 5% glycerol, pH 7,5) (tabell 1). Justera reaktionsvolymen till 100 | al med H2O
OBS: den totala volymen innehåller volymen på CDG-CC och c-di-GMP vid tävlingskontroll (se steg 5.3 och tabell 2).
OBS: alla experiment utfördes i 200 &# 181; l 12-tube PCR remsor (Thermo Scientific).
OBS: för membranfraktionen, se till att alltid hålla DDM koncentration över den kritiska micellkoncentrationen (0,01% vikt / volym) tills protein solubiliseringssteget i 8 M urea (steg 7,1). - Inkubera vid 4 ° C under 30 min på ett roterande hjul.
- Lägg 10 pM CDG-CC (slutlig koncentration).
OBS: inkluderar en kontroll utan CDG-CC (hänvisad som "strängstyrning"), och en kontroll kompletterad med 1 mM c-di-GMP ("konkurrens kontroll") (se tabell 2).
OBS: CDG-CC koncentration kan justeras från 1 till 10 um. - Inkubera vid 4 ° C under minst 2 h (O / N för membranfraktionen) på ett roterande hjul, i mörker.
- Efter en kort centrifugering, tvärbinda genom aktivering av den reaktiva gruppen av CDG-CC med UV-ljus under 4 minuter, med användning av en CaproBox (se Material List, λ = 310 nm, irradians ≥10 mW / cm ^, avståndet från källan = 2 cm). OBS: ta bort locket av remsorna före tvärbindning.
- Lägg 25 pl 5x tvättbuffert (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7,5) och 50 pl av väl återsuspenderade streptavidin magnetiska pärlor, försiktigt homogenisera.
- Inkubera vid 4 ° C under 1 tim på ett roterande hjul.
6. tvättsteg
OBS: (Magnet: se Material List). Börja med en fångst av de magnetiska kulor i remsor locket PCR, med magneten. Sedan ersätta PCR strip med en ny som innehåller nästa tvättlösningen. Ta magneten och resuspendera kulorna, och inkubera 2 min. Spinn ner och tillbaka locket av en fräsch lock.
- Tvättsteg (löslig fraktion endast)
- Tvätta 6 gånger i 200 l 1x tvättbuffert.
- Tvätta en gång i 200 | il HPLC-kvalitet H2O
- Tvätta 6 gånger i 200 | il 80% acetonitril.
- Tvätta 2 gånger i 200 pl HPLC-kvalitet H2O
- Tvättsteg (Membrane fraktion endast)
- Tvätta 5 gånger i 200 ul 1x tvättbuffert + 0,1% DDM.
- Tvätta 2 gånger i 200 ul 1x tvättbuffert + 0,05% DDM.
- Tvätta en gång i 200 pl 1x tvättbuffert + 0,025% DDM.
- Tvätta en gång i 200 pl 1x tvättbuffert + 0,0125% DDM.
- Tvätta 3 gånger i 200 pl 100 mM ABC (ammoniumbikarbonat, NH 4 CO 3) + 2 M urea.
7. MS Provberedning
- Resuspendera kulorna (direkt i locket) i 20 pl 100 mM ABC (100 mM ABC + 8 M urea för membranfraktion) och överför till 1,5 ml rör.
- Endast membranfraktion: inkubera vid 60 ° C under 5 min, under skakning vid 500 rpm.
- Lägg 0,5 pl 200 mM TCEP (tris (2-karboxietyl) fosfin) och inkubera vid 60 ° C under 1 h, skakning vid 500 rpm. Kyl ned till 25 ° C.
- Lägg 0,5 pl av nyframställd 400 mM jodacetamid och inkubera vid 25 ° C under 30 min, skakar ent 500 rpm och i mörker.
- Lägg 0,5 pl 0,5 M N-acetyl-cystein och inkubera vid 25 ° C under 10 min, skakning vid 500 rpm.
- Endast membranfraktion: tillsätt 1 pl Lys-C och inkubera vid 37 ° C, O / N.
- Lägg 2 ug trypsin och inkubera O / N vid 37 ° C, skakning vid 500 rpm (wrap i Parafilm för att förhindra uttorkning).
OBS: proverna kan lagras vid -20 ° C vid detta skede.
OBS: membranfraktion bara: lägg 100 mM ABC att justera ureakoncentrationen till <2 M före tillsats av trypsin. - Snurra korthet ner rören och samla pärlor med magneten.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör (upprepa detta steg om pärlor är kvar).
- Lägg 5 pl 5% TFA (trifluorättiksyra) + 1 ^ il 2 M HCl (15 | il 5% TFA + 5 | il 2 M HCl för membranfraktionen).
- Skick C18 Micro kolumner (The Nest Group, MA, USA) med 150 ^ acetonitril (spin 20 sek vid 2400 rpm).
- Equilibrate C18 kolumnerna 2 gånger med 150 pl 0,1% TFA (spinn 20 sek, 2400 rpm).
- Ladda provet och snurra 2 min, 2000 rpm.
- Ladda genomströmning på kolonnen och upprepa spinningssteget (2 min, 2000 rpm).
- Tvätta tre gånger med 150 | il 0,1% TFA, 5% acetonitril (20 sek, 2400 rpm).
- Ta ett nytt rör och eluera två gånger med 150 | il 0,1% TFA, 50% acetonitril (2 min, 2000 rpm).
- Torka peptiderna i en speed-vac.
- Resuspendera i 40 ul 98% H2O, 2% acetonitril, 0,15% myrsyra.
- Ultraljudsbehandla 20 sek (pulscykel 0.5, amplitud 100%; se Material List) och spinn ner 5 sek, 12000 rpm (bordscentrifug). Vortex 10 sek, och spinn ner 5 sek, 12.000 rpm. Transfer i en HPLC-flaska för LC-MS / MS-analys.
- Freeze vid -20 ° C.
OBS: proverna kan lagras vid -20 ° C vid detta skede.
8. LC-MS / MS-analys
- Kör en nano-LC (nano-LC-system) equipped med en RP-HPLC-kolonn (75 | im x 37 cm) packad med C18-harts (Magi C18 AQ 3 um) med användning av en linjär gradient från 95% lösningsmedel A (0,15% myrsyra, 2% acetonitril) och 5% lösningsmedel B ( 98% acetonitril, 0,15% myrsyra) till 35% lösningsmedel B under 60 min vid en flödeshastighet av 0,2 | j, l / min.
- Analysera peptiderna använder LC-MS / MS (dual tryck LTQ-Orbitrap Velos masspektrometer, som är ansluten till en elektrospray-jonkälla).
OBS: Datainsamlings läget var inställt på att skaffa ett högupplösande MS skanna i FT delen av masspektrometer med en upplösning på 60.000 FWHM följt av MS / MS skannar i den linjära jonfälla av de 20 mest intensiva joner. För att öka effektiviteten i MS / MS försök, var det laddade tillståndet screening modus aktiverat för att utesluta otilldelat och ensamma laddar joner. Maskopi dissociation utlöstes när gångaren översteg 100 ion räknas. Den dynamiska utanförskap tiden var satt till 30 sekunder. Jonen ackumulering tiden var inställd på 300 ms (MS) och 50msek (MS / MS).
9. Databas Sök
- Hämta P. aeruginosa NCBI-databasen via NCBI hemsida ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
- Konvertera MS råa spektra i maskot generiska filer (MGF) med hjälp av MassMatrix konverteringsverktyg ( http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
- Sök denna MGF fil med MASKOT version 2.3 mot P. aeruginosa NCBI-databas med framåt och bakåt-lockproteinposter.
- Utför en in silico trypsindigerering efter lysin och arginin (såvida följt av prolin) tolerera två missade klyvningar i fullt tryptiska peptider.
- Ställ in databas sökparametrar för att möjliggöra oxiderade metioniner (15,99491 Da) som variabla modifieringar och carboxyamidomethylation (57,021464 Da) cysteinrester som fast modifikation. För MASCOT söker ossing högupplösta skannar, ställ gångaren mass tolerans mot 15 ppm och ställa fragmentet mass tolerans mot 0,6 Da. Slutligen ställer proteinet FDR till 1%.
- Importera Mascot sökningar i P. aeruginosa CCMS experiment i Ställning (Proteomesoftware, version 3), ställa in parametrarna för att erhålla ett protein FDR nära 1%, och extrahera den totala spektrala räknas.
- För de representativa resultat som presenteras i denna uppsats använde vi en parad T-test för att jämföra experimentet med tävlingen, och endast betraktas hits med ett p-värde under 0,1, och en spektral räkna förhållande över 2 (experimentera spektrala räkningar / konkurrensövervakning spektral räknas).
- Data kan exporteras i något kalkylprogram för vidare analys.
10. Etikett fria Kvantifiering
- Importera råfiler till Progenesis LC-MS mjukvara (Nonlinear Dynamics, version 4.0).
- Utför LC-MS inriktning och funktion upptäckt fallerad settingar.
- Exportera data i MGF format från Progenesis LC-MS.
- Sök MS / MS-spektra använder MASCOT mot NCBI P. aeruginosa databas med framåt och bakåt-lockproteinposter.
- Importera databas sökresultaten i Progenesis LC-MS de och mappa peptider identifieringar till MS1 funktioner.
- För datautvärdering (beräkning av signifikansnivåer, utfällbara förändring nyckeltal) för ProteinSQAnalysis manus av SafeQuant användes (tröskelvärde: q-värde under 0,1, spektral räkna förhållande över 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att identifiera nya c-di-GMP effekten i P. aeruginosa vi systematiskt använt CCMS att analysera de lösliga och membranfraktioner av P. aeruginosa stam PAO1 från en log-fas kultur (OD 600 = 0,5). Här sammanfattar vi och diskuterar representativa resultaten av denna fiskeexpedition. Fyra oberoende biologiska repliker användes. För varje experiment två olika CDG-CC koncentrationer användes (5 | iM och 10 pM). Att söka efter specificitet, utfördes försök i närvaro eller frånvaro av 1 mM c-di-GMP som konkurrent och slutligen, med en pärla kontroll (dvs utan CDG-CC) (tabell 1).
När man följer den metod som beskrivits i detalj ovan (figur 2) producerade vi en lista över fångade proteiner i en Scaffold format. Sannolika föroreningar togs bort. Detta inkluderade ribosomproteiner, streptavidin, trypsin, serumalbumin, keratin och andra mänskliga proteiner. Proteinetidentifiering falska upptäckten hastighet (FDR) sattes till 1% genom att använda Scaffold programvara och data exporteras till Excel. Antalet anslutnings tillhandahålls av Scaffold kan omvandlas till locus nummer med LETARAD i Excel kopplad till en lista av P. aeruginosa locus nummer. I detta skede omfattar träfflistan 768 proteiner för den lösliga fraktionen och 433 proteiner för membranfraktionen. Men de flesta proteiner inte signifikant anrikas i infångningsexperiment. Således var proteiner som sannolikt fångas ospecifikt (positiva i pärlan kontroll eller endast i närvaro av c-di-GMP konkurrent) bort. Vi beräknade en spektral räkna förhållandet mellan infångningsexperiment och konkurrensövervakning och endast betraktas proteiner med ett förhållande större än två. Dessutom använde vi ett parat t-test på spektrala punkter för att ge en signifikans mått mellan infångningsexperiment och konkurrensövervakning, och ställ en tillåt tröskel på 0,1. SlutligenVi ansåg bara robusta hits med minst fyra peptider som identifierats i de fyra experimenten för 2 fånga föreningskoncentrationer tagna helt. Dessa kriterier bör anpassas efter de behov och använder den verifierade och förutspådde c-di-GMP bindande proteiner som standard för att sätta gränsen. Efter sortering ades listan minskade till 76 träffar för den lösliga fraktionen och 133 proteiner för membranfraktionen. Detta inkluderade 13 lösliga och 21 membranproteiner från P. aeruginosa som är kända eller förutsedd att binda c-di-GMP (tabell 2). De andra 63 lösliga och 112 membranproteiner är nya förmodade c-di-GMP-bindande proteiner som inte innehåller en av de kända c-di-GMP-bindande domäner. Dessa träffar har nu valideras genom att testa deras specifika bindning till c-di-GMP.
I en tidigare skärm fiskas vi GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) och Gsp69 (PA1127) 1. Dessa tre proteiner klonades, överuttryckt, och renas frånE. coli och kunde valideras för att binda c-di-GMP i UV-tvärbindning experiment med 33 P märkt c-di-GMP 15. Kd s bestämdes till 1,0, 2,0 och 6,9 ^ M, vilket indikerar att faktiskt nya effekten kan identifieras med hjälp av CCMS.
Utöver detta representativt exempel använde vi CCMS med extrakt av celler som skördats från olika tillväxtförhållanden och med olika intracellulära c-di-GMP-koncentrationer (n = 24). Sammantaget vi fångade 74% (38/51) av känd eller förutspådde P. aeruginosa PAO1 c-di-GMP signalerings komponenter (24/32 lösliga proteiner, 14/19 membranproteiner). Med tanke på att minst nio av dessa gener visades transkriberas under särskilda förhållanden (oxidativ stress, quorum sensing, biofilmer) 16 och att vissa inte kan binda c-di-GMP alls, kan detta täckningsgrad vara nära mättnad. Detta tillsammans med observationen att de flesta av dessa komponenter were fångas med hög specificitet (tabell 2) hävdar starkt att denna teknik är effektiv och kraftfull.
Figur 1: Kemisk struktur av c-di-GMP Capture Compound.
Figur 2:. CCMS arbetsflöde sammandrag Efter mekanisk lys de fria nukleotider avlägsnas med hjälp av en PD10 utanförskap kolonn. Proteiner från de lösliga eller membranfraktioner inkuberas med CDG-CC, och blandningen utsätts för UV-bestrålning för att tvärbinda infångade proteiner. Kliver av hårda tvättning sker med föreningar bundna till streptavidinbelagda magnetiska kulor. On-vulst tryptisk digerering tillhandahåller peptider,som sedan separeras från pärlorna och proton för deras massa identifiering spektrometri. Klicka här för att se en större version av bilden.
Figur 3: Volcanoplots av P. aeruginosa proteiner betydligt berikas av CCMS. Efter LC-MS / MS-analys och märkningsfri kvantifiering fördes proteiner sorteras såsom beskrivs i texten. Log2-intensitet förhållandet upptäckta peptid mellan fånga och konkurrensexperiment beräknades och avsattes mot värden härledda från signifikans analys (modifierad t-statistik, empiriska Bayes metod 17). Proteiner inom signifikanströsklar för p-värden <0,05 och intensitetsförhållanden> 1,5 gånger är indicated i en grå ruta. Den fyra replikat för den lösliga fraktionen (A) och membranfraktionen (B) utfördes i närvaro av 10 | iM c-di-GMP-CC, och konkurrensen experimentet med 1 mM c-di-GMP. De inringade prickarna motsvarar kända c-di-GMP bindande proteiner. Klicka här för att se en större version av bilden.
| Capture: | Buffert | Kemisk | Källa | Koncentration | |||||
| Bakteriell Lysis Buffer 10x | MES | Sigma | 67 mM | ||||||
| pH 7,5 | HEPES | Sigma | 67 mM | ||||||
| NaCl | MigRCK | 2 M | |||||||
| Na-acetat | Merck | 67 mM | |||||||
| DTT | Fluka | 10 mM | |||||||
| DNasI | Roche | 20 U / ml | |||||||
| Komplett proteasinhibitorcocktail | Roche | 1 tab / 10 ml | |||||||
| Capture Buffert 5x | HEPES | Sigma | 100 mM | ||||||
| KAc | Sigma | 250 mM | |||||||
| MgAc (vattenfri) | Sigma | 50 mM | |||||||
| Glycerol | Sigma | 50% (V / V) | |||||||
| BNP, GTP, ATP, CTP | sigma | 1 mM vardera | Wash Buffer 5x | Tris-HCl | Merck | 1 M | |||
| (För den lösliga fraktionen) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| n-oktyl-β-D-glukopyranosid | Anagrade (Affymetrix) | 42,5 ^ iM | |||||||
| Wash Buffer 5x | Tris-HCl | Merck | 1 M | ||||||
| (För membranfraktionen) | EDTA | Sigma | 0,5 M | ||||||
| pH 7,5 | NaCl | Sigma | 5 M | ||||||
| Andra kemikalier: | Ammoniumbikarbonat (ABC) | Fluka | |||||||
| Urea | AppliChem | ||||||||
| MS provberedning: | Buffert | Kemisk | Källa | Koncentration | |||||
| C18 Buffert A | TFA | Pierce | 0,1% (vol / vol) | ||||||
| H2O av HPLC-kvalitet | 99,9% (V / V) | ||||||||
| C18 Buffert B | TFA | Pierce | 0,1% (vol / vol) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 49,9% (V / V) | |||||||
| H2O av HPLC-kvalitet | 50% (V / V) | ||||||||
| C18 BuffertC | TFA | Pierce | 0,1% (vol / vol) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 5% (vol / vol) | |||||||
| H2O av HPLC-kvalitet | 94,9% (V / V) | ||||||||
| LC Buffert A | Myrsyra | Sigma | 0,15% (V / V) | ||||||
| Acetonitril | Biosolve | 2% | |||||||
| H2O av HPLC-kvalitet | 97,85% | ||||||||
| Andra kemikalier: | tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) | Sigma | |||||||
| jodacetamid (lAA) | Sigma | ||||||||
| N-acetyl-cystein | Sigma | ||||||||
| Endoproteinas Lys-C | Wako | ||||||||
| Trypsin | Promega |
Tabell 1: Buffert sammansättning Sammanfattning av buffertar sammansättning, kemikalier och leverantörer.. C-di-GMP-infångningsförening, c-di-GMP (för tävlingen kontroll), streptavidinbelagda magnetiska pärlor, fånga buffert och tvättbuffert ingår i caproKit.
| Bead kontroll | Capture experiment | Konkurrenskontroll | |
| Proteinextrakt (10 mg / ml) | 30 | il | 30 | il | 30 | il |
| c-di-GMP (10 mM) | 0 il | 0 il | 10 | il |
| Nukleotider (10 mM av varje nukleotid) | 10 | il | 10 | il | 10 | il |
| Capture buffert 5x | 20 | il | 20 | il | 20 | il |
| H2O | 42 | il | 32 | il | 22 | il |
| 30 min inkubation | |||
| c-di-GMP ~ CC (lager 100 M) | 0 il | 5-10 | il | 5-10 | il |
| Slutliga koncentrationer: | Bead kontroll | Capture experiment | Konkurrenskontroll |
| c-di-GMP ~ CC (pM) | 0 ^ M | 5-10 pM | 5-10 pM |
| Konkurrent c-di-GMP (pM) | 0 ^ M | 0 ^ M | 1.000 uM |
Tabell 2:. Capture reaktionsblandning Sammanfattning av reaktionsblandningen för den strängstyrning (dvs. utan infångningsförening), infångningsexperiment (med c-di-GMP-CC), och konkurrensen kontroll som innehåller ett stort överskott av c- di-GMP. Den c-di-GMP-CC slutkoncentration kan justeras, och är normalt inställd mellan 5 och 10 ^ M.
| Proteinnamn | Locus ID | Domän arkitektur | capture experiment / tävling experiment 1 | ||||||||||||||||||
| a) Löslig fraktion | CDG-CC = 5 | iM | CDG-CC = 10 | iM | |||||||||||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF * | 14/0 | 14/0 | 13/0 | 11/0 | 14/0 | 12/0 | 14/0 | 14/0 | |||||||||||
| WspR | PA3702 | REC-GGEEF * | 9/0 | 9/0 | 10/0 | 9/0 | 11/0 | 10/0 | 11/0 | 11/0 | |||||||||||
| - | PA2567 | GAF-SPTRF-EAL | 8/0 | 4/0 | 9/0 | 0/0 | 7/0 | 3/0 | 8/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 11/0 | 12/0 | 13/0 | 12/0 | 12/0 | 10/0 | 11/0 | 12/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 5/0 </ Td> | 3/0 | 6/0 | 5/0 | 8/0 | 5/0 | 6/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA5295 | GDDEF-EAL | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 1/0 | 6/0 | 6/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| Fimx | PA4959 | PAS-GDSIF-EVL | 23/1 | 21/0 | 21/0 | 11/0 | 24/3 | 23/2 | 22/0 | 20/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 3/0 | 3/0 | 3/0 | 0/0 | 3/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 3/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 3/0 | 3/0 | ||||||||||||
| - | PA4324 | Pilz | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3177 | GGEEF | 2/0 | 1/0 | 3/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4396 | REC-DEQHF | 0/0 | 1/0 | 4/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 5/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0169 | GGEEF * | 3/0 | 2/0 | 6/0 | 7/0 | 1/7 | 2/6 | 1/9 | 1/7 | |||||||||||
| - | PA2799 | Pilz | 1/0 | 0/0 | 2/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA5017 | PAS-GAF-PAS-ASNEF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 3/2 | 0/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA5487 | GGEEF * | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| b) Membranfraktion | CDG-CC = 5 | iM | CDG-CC = 10 | iM | |||||||||||||||||||
| - | PA2072 | CHASE4-TM-PAS-GGDEF-EAL | 13/1 | 25/0 | 27/0 | 19/0 | 36/0 | 36/0 | 31/0 | 23/0 | |||||||||||
| - | PA0861 | TM-PAS-GGDEF-ELL | 6/1 | 14/0 | 13/0 | 10/0 | 17/0 | 18/0 | 13/0 | 8/0 | |||||||||||
| - | PA3353 | Pilz | 6/0 | 10/0 | 9/0 | 7/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 5/0 | |||||||||||
| - | PA3343 | 5TM-GGDEF | 3/0 | 7/0 | 7/0 | 4/0 | 12/0 | 10/0 | 7/0 | 7/0 | |||||||||||
| - | PA1181 | MASE1-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-ELL | 3/0 | 6/0 | 9/0 | 3/0 | 12/0 | 12/0 | 5/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA0847 | TM-CHASE4-HAMP-PAS-GGDEF | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 1/0 | 15/0 | 13/0 | 8/0 | 6/0 | |||||||||||
| - | PA0575 | PBPb-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 1/0 | 7/0 | 6/0 | 3/0 | 10/0 | 10/0 | 6/0 | 2/0 | |||||||||||
| yfiN | PA1120 | 2TM-Hamp-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 3/0 | 5/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA0290 | PAS-GGDEF | 1/0 | 4/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 5/0 | 1/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4929 | 7TMR: DISMED2-7TMR: DISMED2-GGDEF | 2/0 | 4/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 2/0 | 1/0 | |||||||||||
| Mora | PA4601 | TM-TM-PAS-PAS-PAS-PAS-GGDEF-EAL | 3/0 | 7/0 | 3/7 | 5/0 | 9/0 | 10/0 | 5/0 | 4/0 | |||||||||||
| - | PA1851 | 5TM-GGDEF | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 4/0 | 3/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA2870 | TM-GGDEF | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 0/0 | 4/0 | 4/0 | 4/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA3311 | TM-MHYT-MHYT-MHYT-AGDEF-EAL | 1/1 | 5/0 | 1/7 | 4/0 | 8/0 | 8/0 | 1/5 | 3/0 | |||||||||||
| Bifa | PA4367 | TM-GGDQF-EAL | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/0 | 2/0 | 1/2 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4608 | Pilz | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | 3/0 | 3/0 | 2/0 | 2/0 | |||||||||||
| - | PA4332 | 5TM-GGEEF | 1/0 | 3/0 | 2/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 2/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA0012 | Pilz | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | |||||||||||
| - | PA2989 | Pilz | 4/0 | 8/0 | 7/0 | 7/0 | 2/5 | 02/11 | 7/2 | 8/3 | |||||||||||
| - | PA1433 | Hamp-RGGEF-KVL | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | 1/0 | |||||||||||
| - | PA4843 | REC-REC-GGEEF | 0/0 | 0/0 | 1/1 | 1/0 | 0/0 | 1/0 | 1/0 | 0/0 | * = GGDEF domän innehållande en I-ställe | ||||||||||
| 1 antal spektrala räkningar av identifierade peptider | |||||||||||||||||||||
Tabell 3: P. aeruginosa känd c-di-GMP signalering komponenter som särskilt fångade. Identifierade proteiner först sorteras som beskrivs i texten. Proteiner är identifierade med deras namn och locus nummer, och vi visar sin arkitektur förutsägas med NCBI bevarad domän Database onlineverktyg (n = 4, CDG-CC = 5 ^ M eller 10 M) för att visa fångst specificitet och reproducerbarhet av metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Särskild försiktighet bör iakttas vid flera steg i protokollet. Proteinkoncentrationen är en kritisk parameter med en koncentration av 10 mg / ml är svårt att nå när celler odlas under särskilda odlingsbetingelser (t.ex. biofilmer eller små koloni varianter). Sålunda bör pellets resuspension utföras i en låg volym av lysbuffert. Proteinkoncentrationer kan minskas till 8 mg / ml. Jämfört med den metod som publicerats av et al. Nesper 1, tillade vi olika nukleotider till fånga reaktionen att minimera ospecifik upptagning av binding protein. Även tillsats av nukleotider förbättrade specificitet, kan det samtidigt förhindra fångst av proteiner som binder olika nukleotider på samma plats. Exempelvis effektor FleQ, som nyligen visades binda ATP och c-di-GMP 18 fiskades specifikt i frånvaro av ATP i våra tidigare experiment 1, men inte längre i data presenteras här i närvaro av ett överskott av ATP.
CDG-CC ska noggrant skyddas från ljus. Även omgivande ljus innehåller endast en liten del av UV, rekommenderas att hålla infångningsförening lager insvept i aluminiumfolie, liksom fånga mix före aktivering av UV-strålning. De tvättsteg som följer kan vara mycket stränga att öka specificiteten, såsom de infångade proteinerna är kovalent bundna till den CDG-CC. Beträffande LC-MS / MS-analys, skall försöken utföras i en ren keratin fri miljö. Dessutom bör HPLC kompatibla buffertar användas, särskilt efter tvättstegen. Kandidatlistan omfattar typiskt mellan 300 och 800 proteiner (för en fyra exemplar), med låga variationer mellan replikaten (se tabell 2 som exempel).
Vissa parametrar som proteinet och CDG-CC koncentration kan behöva optimeras beroende på organismerna analyzed. Eftersom låga rikliga proteiner eller proteiner som uttrycks endast under särskilda förhållanden kan lätt missas, bör försiktighet iakttas när det gäller villkoren kultur används. Detta problem kan övervinnas genom att jämföra träfflistan med en global protein ATLAS samlats för samma odlingsbetingelser. Slutligen kan optimering av tvättmedels vara utmanande, eftersom den måste optimeras med avseende på dess förmåga att lösa membranproteiner och måste vara MS-kompatibel också.
Man måste komma ihåg att c-di-GMP molekyl av CC är kemiskt modifierade, eftersom den är kopplad via 2'OH gruppen av en ribos till resten av schavotten. Denna ändring kan förändra dess förmåga att binda till vissa effekten därmed ger falskt negativa. I detta sammanhang är det värt att notera att vi aldrig fångat proteiner som hyser en EAL-domän, men saknar en GGDEF domän i P. aeruginosa, även om EAL proteiner fångades i andra arter, som Caulobacter crescentus. Detta kan bero på en dålig tillgång eller en låg affinitet av CDG-CC till bindningsstället, eller till nedbrytning av CDG-CC genom EAL proteiner. I motsats härtill var det många nucleotide bindande proteiner fångas med en relativt låg specificitet och, i stor utsträckning, är troligen falska positiva. Ytterligare validering av den specifika bindningen till c-di-GMP med hjälp av tekniker såsom DRaCALA 20, UV tvärbindning 15, differentialavsökande fluorimetri (DSF) 21, Micro thermophoresis (MST) 22, isoterma kalorimetri (ITC) 23 - är 24 ... således nödvändigt.
Det är också möjligt att en fraktion av c-di-GMP-delen av infångnings föreningen bryts ned av fosfodiesteraser från cellysatet. Detta är en av anledningarna till att förfarandet måste utföras vid 4 ° C, vilket begränsar den fosfodiesteraser aktivitet innan tvärbindning.
Den procedure kan anpassas till många bakteriearter, och har med framgång använts i 3 olika bakteriearter med mycket mindre modifieringar 1. Capture Compound baserad teknik kan minska falskt positiva genom användning av noggrann tvättning (t.ex. 1 M salt, hög koncentration detergent, 2 M urea i händelse av membranproteiner, 80% acetonitril), jämfört med andra tekniker som inte är beroende på kovalent bindning. Med tanke på att validering av kandidater kan vara en mödosam och tidskrävande process, är detta en stor fördel för alternativa metoder som kemiska proteomik baserade närmar sig 14.
Detta illustreras videometod etablerar CCMS som ett kraftfullt och mångsidigt verktyg för att identifiera och karakterisera nya komponenter som små signalmolekyl. I framtiden kan liknande Capture Föreningar hyser andra selektivitet grupper användas för att fånga proteiner involverade i små signalmolekyl, såsom de nya c-di-AMP effektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You've come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O'Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
