Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Мониторинг Активация противовирусной Распознавание Рецепторы RIG-I И PKR По ограниченной протеазы Пищеварение и Native СТРАНИЦЕ

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

Врожденные защиты в вирусных инфекций вызываются распознающих рецепторов (РРСС). Два цитоплазматические РРСС RIG-I и PKR связываются с вирусными подписи РНК, изменение конформации, олигомеризоваться и активируйте антивирусную сигнализацию. Описаны методы, которые позволяют легко контролировать конформационное переключение и олигомеризации этих цитоплазматических PRRS.

Abstract

Защитные силы организма вирусной инфекции зависят от быстрого обнаружения по распознающих рецепторов (РРСС) врожденной иммунной системы. В цитоплазме, что РРСС RIG-I и PKR связываются со специфическими вирусными РНК лигандов. Этот первый посредником конформационную коммутации и олигомеризации, а затем позволяет активацию противовирусного ответа интерферона. В то время как методы измерения противовирусной экспрессию генов хозяина, хорошо известны, методы непосредственно отслеживающие активации состояния RIG-I и PKR лишь частично и не прижилось.

Здесь мы описываем два метода для мониторинга RIG-I и PKR стимуляции при инфицировании установленном индуктор интерферона, вирус лихорадки долины Рифт мутант клона 13 (Cl 13). Общество с ограниченной трипсин-переваривание позволяет анализировать изменения в чувствительности протеазы, указывая конформационные изменения в PRRS. Трипсин переваривание лизатов макет инфицированных клеток приводит к быстрой деградации RIG-I и PKR, где ас Cl 13 инфекция приводит к появлению протеазы устойчивостью RIG-I фрагмента. Также PKR показывает вирус-индуцированной частичное сопротивление трипсина пищеварения, который совпадает с Его отличительной чертой фосфорилирования в Thr 446. Формирование RIG-I и PKR олигомеры была подтверждена с помощью электрофореза родной полиакриламидном геле (PAGE). При заражении существует сильная накопление RIG-I и PKR олигомерных комплексов, в то время как эти белки оставались в качестве мономеров в ложном зараженных образцов.

Общество с ограниченной протеазы пищеварение и родной СТР, как в сочетании с Вестерн-блоттинга, позволяют чувствительный и прямое измерение двух различных ступенях RIG-I и PKR активации. Эти методы могут быть сравнительно легко и быстро выполнять и не требует дорогостоящего оборудования.

Introduction

Важнейшим событием в противовирусной защиты организма является быстрое обнаружение возбудителя на так называемых распознающих рецепторов (РРСС) 1,2. Внутриклеточный обнаружение вируса РНК-инфекции зависит от двух цитоплазматической РНК геликаз, RIG-I (ретиноевой кислоты индуцируемый ген I) и MDA5 (дифференциация меланома ассоциированный белок 5) 3-5. RIG-I состоит из двух N-концевых доменов набора каспазы (карты), центрального типа Dech ящик РНК геликазы области, и С-концевого домена (CTD) 4,6. В то время как КТР и геликазного домена необходимы для признания неавтомодельных (вирусных) РНК, карты посредником нижестоящую передачу сигналов, ведущих к созданию противовирусного статуса хозяина.

Если RIG-I находится в состояние молчания, то есть в отсутствие конкретного РНК лиганда, вторая карта взаимодействует с центральной области геликазы и держит RIG-I в автомобильной ингибирования конформации 7-11. RIG-I связывается с коротким дваждынить (DS) РНК, несущий 5'-трифосфат (5'PPP), длинные дцРНК, и полиУ / UC-богатую РНК, классические подписи структур, которые присутствуют на геномах многих РНК-содержащих вирусов 12-16. Два основных характеристики активации RIG-I являются переход к закрытой конформации 6,17 и гомо-олигомеризации 6,18,19. Конформационное переключатель усиливает связывание РНК, предоставляет карты для передачи сигнала, и воссоздает активное АТФазную сайт 8,9,11,20. Формирование олигомерных комплексов RIG-I приводит к увеличению набора последующих молекул адаптера сигнализации, чтобы сформировать платформу для противовирусной передачи сигнала 11. RIG-I-регулируется цепи сигнализации в конечном счете активирует фактор транскрипции IRF-3 для повышающей регуляции интерферона (IFN-alpha/beta) генов и, следовательно, экспрессии генов интерферона стимулируется генов (ISGs) для полного противовирусного ответа 21,22 . Один из лучше всего характеризует ISGs является РНК-активированный Протейн киназы (PKR) 23. PKR принадлежит к семейству эукариотической инициации трансляции фактор 2 альфа (eIF2α) киназ и состоит из N-концевого двухцепочечной РНК-связывающего домена и С-концевого домена киназы. Киназный домен представляет собой интерфейс димеризации решающее значение для PKR активации и осуществляет каталитические функции белка. Связывание PKR вирусной дсРНК приводит к ее изменение конформации разрешений димеризацию и авто-фосфорилирования в Thr 446 среди других остатков. PKR затем согласует фосфорилирования eIF2α, тем самым блокируя перевод вирусной мРНК 23-27.

Оба RIG-I и PKR претерпит серьезных структурных перестроек, образуют олигомерные комплексы и посттрансляционно изменены фосфорилирования / дефосфорилирования и убиквитинирования 10,11,19,23,24,26-29. Для лучшего понимания которых вирусные РНК структуры активации RIG-I и PKR (и на какой стадии вирусные антагонисты могли Bе вмешательства), важно, чтобы точно определить состояние активации. Для обоих РРСС было ранее описано, что активация приводит к появлению трипсиноподобных устойчивы фрагментов белков 6,17,30 и более высокого порядка олигомеров 6,18,19. Однако, учитывая богатство литературы об этих ключевых факторов противовирусного ответа хозяина 1,2,24, применение прямых методов кажется сравнительно редко. В надежде стимулирования более широкого использования, мы предоставляем удобные и чувствительные протоколы решительно анализирующих активации состояния RIG-I и PKR. ИФН компетентным А549 линия клеток человека заражен с установленным активатором RIG-I и PKR, в ослабленный вирус лихорадки долины Рифт мутантного клона 13 (Cl 13) 31,32. После простой процедуры лизирующего, экстракты из инфицированных клеток испытаны ограниченной трипсин-переваривание / Вестерн-блот анализ, чтобы оценить конформационное переключение, и синим электрофореза в полиакриламидном геле с нативной (PAGE) / Western блот Analysзаключается в измерении образование олигомеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Посев А549 для инфекции

  1. Культивируйте T75 колбу клетках А549 при 37 ° С и 5% СО 2 в среде культуры клеток (DMEM с добавлением 10% FCS, 526,6 мг / л L-глутамина, 50,000 ед / л пенициллина и 50 мг / л стрептомицина).
  2. Перед началом сбора клеток, разогреть среду клеточной культуры, PBS и 0,05% трипсин-ЭДТА в водяной бане, нагретой до 37 ° С.
  3. Снимите среды и промыть клетки с 10 мл PBS. Снимите PBS снова.
  4. Добавить 3 мл трипсин-ЭДТА и распространять в равной степени в колбе. Перенесите колбу в инкубаторе с 37 ° С и 5% СО 2.
  5. Когда все клетки отделяют, добавляют 7 мл среды культуры клеток, ресуспендирования клеток, и передачи клеточной суспензии в 15 мл сокола трубки.
  6. Центрифуга клетки при 800 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл свежей среды культуры клеток.
  7. Граф клеток с счетной камере.
  8. Добавить 2,5 х 10 6 клеток в 5 мл среды культуры клеток в двух флаконах T25 каждый. Инкубировать в течение 16 часов при 37 ° С и 5% СО 2. Один флакон служит для макета управления и один для Cl 13 инфекции.

2. Заражение Лихорадка Рифт-Валли Вирус Clone 13 (Cl 13)

  1. ПРИМЕЧАНИЕ: Cl 13 ослабленный вирус мутант, который в Германии могут быть обработаны в соответствии с BSL-2 условий. Пожалуйста, обратитесь к соответствующим национальным рекомендациям. Другие типичные индукторов ИФН будет вирус Сендай (штамм Кантелл) или вирус болезни Ньюкасла.
  2. Предварительно теплой PBS, содержащей сыворотки среде, и клеточная культуральная среда, содержащей 5% FCS.
  3. Подготовить 1,25 х 10 7 PFU / мл Cl 13 в среде без сыворотки, чтобы заразить 2,5 х 10 6 клеток А549 с множественностью заражения (МВД) 5. Подготовьте несколько (примерно 10%) большее количество, чем необходимо для учета ошибки пипеток.
  4. Промывают клетки с PBS, как описано в 1.3.
  5. Добавьте 1 мл разведения Cl 13 илибессывороточной среде (контроль неинфицированных, макет) к клеткам и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С и 5% CO 2. Перемещение колбу тщательно каждые 15 мин, чтобы обеспечить равномерное распределение Cl 13 разбавления и сыворотки среде, соответственно.
  6. Через 1 ч инфекции, удалить инокулята, добавляют 5 мл подогретого клеточной культуральной среде с 5% FCS, и инкубировали в течение 5 ч при 37 ° С и 5% CO 2.

3. Подготовка клеточных лизатов

  1. Подготовка PBS / 0,5% Triton X-100 при 4 ° С. Не добавляйте ингибиторы серин-протеазы.
  2. Промывают клетки с холодным PBS и добавляют 10 мл свежей PBS.
  3. Собрать клетки с, передачи клеточной суспензии в трубки сокола, и центрифуге при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 30 мкл PBS / 0,5% Triton X-100. Передача лизата в свежую 1,5 мл пробирку и инкубируют в течение по крайней мере 10 мин при 4 ° С.
  5. Центрифуга лизата в 10.000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и передавать осветленной лизата клеток (надосадочную) в свежую пробирку.
  6. Определить концентрацию белка по Бредфорда, как описано в другом месте 33.
  7. Хранить при -20 ° С или перейти к трипсина пищеварения (4.1) или родной СТР (5.1).

4. Определение конформационные изменения распознаванию рецепторов

  1. ТРСК-трипсин Лечение клеточных лизатов
    1. Развести L-1-tosylamido-2-фенилэтил хлорметилкетона обработке (ТРСК) трипсин в PBS до конечной рабочей концентрации 2 мкг / мкл.
    2. Регулировка в двух новых труб конечной концентрации белка 25 мкг каждого белкового лизата (макет или Cl 13) в конечном объеме 9 мкл ЗФР. Следовательно, она должна быть в четыре пробирки с 25 мкг лизата каждой, два раза макет и два раза Cl 13 инфекции. Один установлен как входного контроля (необработанной) и один набор для лечения ТРСК-трипсина.
    3. Добавить 1 мкл PBS (без лечения)или 1 мкл 2 мкг / мкл ТРСК-трипсином (конечная концентрация: 0,2 мкг / мкл) к клеточных лизатов и смешивать реакции с помощью пипетки. НЕ замораживать и оттаивать ТРСК-трипсин аликвоты, потому что это поставит под угрозу эффективность пищеварения.
    4. Инкубируйте лизатов при 37 ° С в течение 25 мин. Остановить реакцию, добавив 5x денатурации образца буфера (250 мМ Трис-HCl рН 6,8, 10% SDS, 50% глицерина, 25% β-меркаптоэтанол, 0,5% бромфенолового синего) и кип чением в течение 5 мин при 95 ° С. Это важно, чтобы не продлить время трипсин инкубации. В случае, если нет протеазы устойчивостью фрагменты не могут быть обнаружены, время трипсина пищеварения должен быть сокращен.
    5. После кипячения образцы можно хранить при -20 ° С.
  2. SDS полиакриламидном геле (PAGE) и вестерн-блоттинга
    1. Загрузка образцов на додецилсульфата натрия (SDS) полиакриламидном геле, содержащем 5% укладку над 12% разрешающей геле. не Отделите белки при 25 мА на гель, покабромфенолового синего иссякнут.
    2. Активировать поливинилиденфторид (PVDF) мембрану в течение 30 сек с метанолом и поместить его в буфере для переноса (48 мМ Трис, 39 мМ глицина, 1,3 мМ SDS, 20% метанол).
    3. Подготовьте блоттинга с полусухого системы промокательной и позволяют передавать белков на 10 В в течение 1 часа. Возьмите мембрану из ополосните кратко водой, и дайте ему высохнуть.
    4. Повторная активация мембрану кратковременным передачи в метанол. Вымойте в течение 5 мин с TBS. Блок 10% обезжиренным молоком в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре или при 4 ° CO / N. Вымойте мембраны 3 раза в течение 5 мин каждого с TBS.
    5. Подготовка разбавления антител, как рекомендовано в таблице 1 и инкубировать мембрану в течение 1 часа при комнатной температуре или при 4 ° CO / N.
    6. Промыть 3 раза мембраны в течение 10 мин с каждой TBS-T. Добавить соответствующий вторичного антитела в сочетании с пероксидазой хрена в разведении 1:20000 в 1% обезжиренным молоком в TBS. Инкубировать 45 мин при комнатной температуре.
    7. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с TBS-T, и опе дополнительное время с TBS.
    8. Для обнаружения сигнала использования коммерческого набора хемилюминесценции и цифровой системы визуализации гель.
  3. Кумасси бриллиантовый синий G-250 Окрашивание
    1. Выполните SDS-PAGE, как описано в п. 4.2.1. Образцы нагрузка на полиакриламидном геле SDS и запустить гель при 25 мА на гель, пока бромфенолового синего не иссякнут.
    2. Выполните Кумасси Бриллиантовый окрашивание Синий G-250 при комнатной температуре. Все ли инкубации при постоянном встряхивании.
    3. Передача гель для фиксации раствором, содержащим 40% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 30 мин.
    4. Заменить буфер обесцвечивани раствора (25% этанола и 8% уксусной кислоты) и инкубируют в течение 5 мин.
    5. Пятно гель с 0,2% кумасси голубой Brillant G-250 в 40% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 1 часа.
    6. Destain гель с обесцвечивани раствора и обмена буфера через 10 мин, 30 мин, и 60 мин.
    7. Хранить гель в 25%-ном этаноле, 8% уксусной кислоты и 4% глицерина при 4 ° С. Выполните визуализацию и анализ, как описано в 4.2.8.

5. Анализ олигомерных Штатов распознаванию рецепторов

  1. Родной СТРАНИЦА
    1. Подготовка 50 мкг клеточного лизата в конечном объеме 10 мкл с PBS и добавляют 5 × родной буфер выборки (250 мМ Трис-HCl рН 6,8, 1% дезоксихолат натрия, 50% глицерина, 0,5% бромфенолового синего) до конечной концентрации 1x.
    2. Загрузите образцы НЕМЕДЛЕННО на родном полиакриламидном геле с 5% в качестве укладки и 8% в качестве решения гель. Любая задержка приведет к потере родных комплексов 34.
    3. Запуск гель при 20 мА на гель при 4 ° С с 50 мМ трис-NaOH рН 9,0, 384 мМ глицин как в качестве анода и 50 мМ Трис, рН 8,3, 384 мМ глицина, 1% дезоксихолата натри в качестве катода буфера. После 1,5-2 часов (бромфенолового синяя полоса покинул гель примерно 45 мин раньше) электрофорез закончена.
  2. Вестерн блот
    1. Активировать polyvinylidene (ПВДФ) мембрану в течение 30 сек с метанолом и поместить его в Towbin буфера (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1% SDS, 20% метанол).
    2. Соберите мокрый пятно камеру в соответствии с инструкциями изготовителя и заполнить бак с Towin буфера.
    3. Выполните блоттинга с 250 мА в течение 1,5 ч при 4 ° С.
    4. Когда промокательной закончена действуйте, как описано в п. 4.2.3 на.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Признание вирусной агониста по RIG-I или PKR вызывает конформационные переключение 6,17,30 и олигомеризацию 6,18,27. Мы анализировали эти два маркера активации ограниченным пищеварения протеазы и электрофореза родной полиакриламидном геле (PAGE), соответственно.

Клетки человека А549 были инфицированы вирусом лихорадки долины Рифт клона 13 (Cl 13), который характеризуется мутацией антагониста IFN АПЛ 35,36. В связи с отсутствием функциональной НЗ, клон 13 сильно индуцирует RIG-I и PKR, что приводит к созданию надежной антивирусной государства в клетках 12,31,32,37.

Трипсин переваривание макет инфицированных клеточных лизатов приводит к быстрой деградации RIG-I, в то время как Cl 13 инфекция приводит к генерации 30 кДа стойкого RIG-I фрагмент фиг.1А. Также PKR показывает частичное сопротивление трипсина пищеварения в зараженных образцов, совпадающей с его Phosphorylation рис. 1А. Чтобы контролировать эффективность и специфичность трипсина пищеварения, гели окрашивали кумасси бриллиантовым голубым G-250. Необработанные образцы показывают равные количества загруженных белков Рисунок 1B. Подвергая макет и Cl 13 клеточных лизатов в трипсина пищеварения приводит к сопоставимому снижению глобальных количествах белка. Это показывает, что обработка трипсином имеет такую ​​же эффективность для пробных и Cl 13-зараженных образцов.

Формирование комплексов олигомерных анализировали с помощью нативного PAGE. В неинфицированных клеток, только мономеры RIG-I и PKR были обнаружены Рисунок 2. Как дополнительный контроль мы включили фактор транскрипции IRF-3, который присутствует в качестве мономера, но, как известно, димеризуются при активации через, например, RIG-I 38. Cl 13 инфекция приводит к сильному накоплению RIG-I олигомерных комплексов в виде мазка и от PKR и IRF-3 димеров / олигомеров как определенной полосы белка.

класс = "jove_content"> Эти результаты показывают, что ограниченное пищеварения трипсин и родной СТРАНИЦА являются полезными инструментами для мониторинга конформационные изменения и образование олигомеров из RIG-I и PKR При заражении.

Рисунок 1
Рисунок 1. Конформационный переключатель RIG-I и PKR. Клетки А549 макет зараженного или заражены Cl 13 на МВД 5. Через 5 часов клетки лизировали в ФБР с добавкой 0,5% Triton X-100 и очистили Клеточные лизаты либо не лечить или лечить трипсином. Образцы подвергали SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга (а) или Кумасси окрашивания (B). Кляксы окрашивали против RIG-I, PKR, фосфорилированным PKR (Thr 446) и против RVFV нуклеопротеина (RVFV N) и бета-актина, как инфекции и контроля загрузки, соответственно._blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Олигомеризация RIG-I, PKR, и IRF-3. Клеточные лизаты из макетов и Cl 13-инфицированных клеточных лизатов были подвергнуты родной ПААГ с последующим Вестерн-блоттинга. Окрашивание проводили с антителами против RIG-I, PKR, IRF-3 и бета-актина в качестве управления загрузкой. PKR олигомеры, скорее всего, представляют димеры 27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Почувствовав присутствие вирусов и активацию противовирусного IFN типа I системы имеют решающее значение для успешных врожденных иммунных реакций 22. Обнаружение Вирус тем самым опосредовано рецепторами распознавания патогена (РРСС), как RIG-I и PKR, что позволяет в кратчайшие сроки и активацию противовирусных защитных механизмов. Здесь мы описываем два метода, чтобы непосредственно оценить состояние активации RIG-I и PKR.

Общество с ограниченной протеазы пищеварения в качестве инструмента для мониторинга конформационные изменения RIG-I и PKR был впервые описан групп М. Gale младший и Т. Фуджита 6,17 и JL Коул 30, соответственно. Она представляет собой чувствительный метод для оценки изменения чувствительности к трипсина обращения, вызванного конформационных изменений. Применение трипсина пищеварение, мы обнаружили быстрой деградации RIG-I и PKR в макет инфицированных образцов, в то время как трипсин лечение инфицированных вирусом клеточных лизатов привело к трипсином устойчивых фрагментов RIG-I. Similарли, трипсин устойчивы фрагмент PKR был обнаружен на Cl 13 инфекции. Это сопровождалось PKR фосфорилирования в Thr 446, широко используемого маркера PKR активации. Сравнивая трипсина переваривание макет и Cl 13 клеточных лизатов окрашиванием кумасси демонстрирует сравнимую снижение глобальных уровней белка. Это означает, что формирование устойчивых фрагментов является специфическим для белков, как RIG-I и PKR.

Формирование олигомерных комплексов RIG-I, PKR и IRF-3 контролировали родной СТР. Подвергая Cl 13-инфицированные лизатов клеток в родной СТР, мы обнаружили RIG-I, PKR и IRF-3 олигомеры, в то время как эти белки остались в качестве мономеров в макет инфицированных образцов. RIG-I должен образованием олигомеров, чтобы активировать нижестоящие пути. Было высказано предположение, что RIG-я олигомеризации поддерживает вербовку кофакторов, чтобы сформировать платформу сигнализации для антивирусных механизмов реагирования 11. Функция PKR димеризации не совсем понял. Скорее всего, ПКR подразделения в димера фосфорилируют друг друга 25. IFN типа I система жестко регулируется на уровне транскрипции, и IRF-3 представляет собой один центральный фактор транскрипции для индукции ИФН и ISGs 38. Центральные признаки активации являются фосфорилирования, димеризации, и перемещение в ядро, где он вербует транскрипционный коактиваторов p300 и CREB-связывающий белок (СВР) инициировать ИФН мРНК синтез 21,39. Анализ IRF-3 димеризации является широко используемым инструментом для контроля активацию типа I IFN ответ 38. Поэтому мы использовали обнаружение IRF-3 олигомерных комплексов как доказательство принципа для олигомеризации анализов RIG-I и PKR олигомеризации. В самом деле, что позволяет разделение белковых лизатов в условиях неденатурирующем, мы смогли обнаружить IRF-3 димеризации в Cl 13 зараженных образцов.

Несомненно, каждый лаборатории нужно будет оптимизировать протоколы ограниченной протеазы DigeStion и родной СТР. Если сталкивается с не обнаружения любых устойчивых белков или слишком много устойчивых фрагментов, можно сократить или продлить время пищеварения, соответственно. Различия также может быть связано с конкретным ТРСК-трипсин складе, как препараты незначительно отличаются. Таким образом, различные концентрации ТРСК-трипсина должны быть проверены на оптимизации. Клеточные лизаты могут быть получены из других клеточных линий, чем А549, но может потребоваться адаптации протокола. Рекомендуется, чтобы регулировать количество общего белка в трипсин-переваривание и родной ПААГ в соответствии с уровнем экспрессии интересующего белка в данном конкретном типе клеток. Кроме того, ограничены обнаружения или слабый разделение олигомерных комплексов по родной страница может иметь несколько причин, и могут быть решены как следует: убедиться, что оборудование очищают от оставшихся денатурирующих агентов, сохранить все образцы и гель в течение странице при 4 ° С , и не продлить время между пробоподготовки и лоаДин на гель. Общество с ограниченной протеазы пищеварение и родной СТР также применялись для мониторинга активацию другой важной, тесно связанной ПРР, MDA5 40-42. Мониторинг активации MDA5 требуется различные экспериментальные условия по сравнению с RIG-I и PKR, и поэтому не включены.

Таким образом, точка за точкой протоколы для двух полезных и чувствительных методов для измерения активации RIG-I и PKR представлены. Общество с ограниченной протеазы пищеварение и родной СТР, как в сочетании с Вестерн-блоттинга, разрешение мониторинга конформационных изменений и олигомеризации, соответственно. Используя эти методы, мы ранее показали, что RIG-I может быть активирован нуклеокапсидов различных вирусов непосредственно после их вступления в клетках 32.

Точная природа и происхождение видов РНК, имеющих значение для активации RIG-I и PKR в инфицированных клетках до сих пор не совсем решена. Кроме того, многие вирусы мешаютфункции PRRS по широкому кругу стратегий 12,43-46. Представленные методы увеличить спектр методов, позволяя легко и прямое измерение RIG-I и PKR активации, быстры, чтобы выполнять, и не требует дорогостоящего оборудования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Алехандро Brun от CISA-INIA для обеспечения защиты от лихорадки Рифт-Валли Вирус сывороток. Работа в нашей лаборатории поддерживается Forschungsförderung камень. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Университетская Гиссен унд Марбург, Лейбниц Высшая школа для развивающихся вирусных заболеваний (Эйдис), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, и DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

Инфекционные заболевания выпуск 89 врожденного иммунного ответа вирусные инфекции рецептор распознавания патогена RIG-I PKR IRF-3 ограничен протеазы пищеварение конформационные переключатель родной СТР олигомеризации
Мониторинг Активация противовирусной Распознавание Рецепторы RIG-I И PKR По ограниченной протеазы Пищеварение и Native СТРАНИЦЕ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter