Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antiviral पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स रिग, मैं और PKR द्वारा सीमित Protease पाचन और मूल निवासी पृष्ठ की मॉनिटरिंग सक्रियण

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

वायरस के संक्रमण जन्मजात गढ़ पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) से शुरू हो रहे हैं. दो cytoplasmic PRRs रिग, मैं और वायरल हस्ताक्षर RNAs, परिवर्तन रचना, oligomerize, और antiviral संकेतन सक्रिय करने के लिए PKR बाँध. तरीके आसानी से गठनात्मक स्विचिंग और इन cytoplasmic PRRs की oligomerization निगरानी करने की अनुमति जो वर्णित हैं.

Abstract

वायरस के संक्रमण को होस्ट गढ़ सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) द्वारा एक तेजी से पता लगाने पर निर्भर हैं. कोशिका द्रव्य में, PRRs रिग, मैं और विशिष्ट वायरल शाही सेना ligands के लिए PKR बाँध. यह पहला गठनात्मक स्विचिंग और oligomerization mediates, और फिर एक एंटीवायरल इंटरफेरॉन प्रतिक्रिया के सक्रियण सक्षम बनाता है. एंटीवायरल मेजबान जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए तरीकों अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, सीधे रिग, मैं और PKR के सक्रियण राज्यों पर नजर रखने के तरीकों केवल आंशिक रूप से कर रहे हैं और कम अच्छी तरह से स्थापित.

यहाँ, हम एक स्थापित इंटरफेरॉन inducer, दरार घाटी बुखार वायरस उत्परिवर्ती क्लोन 13 (सीएल 13) के साथ संक्रमण पर रिग, मैं और PKR उत्तेजना नजर रखने के लिए दो विधियों का वर्णन. लिमिटेड trypsin पाचन PRRs के गठनात्मक परिवर्तन का संकेत है, प्रोटीज संवेदनशीलता में परिवर्तन का विश्लेषण करने की अनुमति देता है. रिग, मैं और PKR, wherea की एक तेजी से गिरावट में नकली संक्रमित कोशिकाओं के परिणाम से lysates के trypsin पाचनएस सीएल 13 संक्रमण एक प्रोटीज प्रतिरोधी रिग, मैं टुकड़ा के उद्भव की ओर जाता है. इसके अलावा PKR Thr 446 पर अपने बानगी phosphorylation के साथ मेल खाता है, जो trypsin पाचन, एक वायरस प्रेरित आंशिक प्रतिरोध से पता चलता है. रिग, मैं और PKR oligomers देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा मान्य किया गया था का गठन. इन प्रोटीनों नकली संक्रमित नमूनों में monomers के रूप में बने रहे, जबकि संक्रमण पर, रिग, मैं और PKR oligomeric परिसरों की एक मजबूत संचय, वहाँ है.

लिमिटेड प्रोटीज पाचन और देशी पृष्ठ, रिग, मैं और PKR सक्रियण के दो विभिन्न चरणों की एक संवेदनशील और प्रत्यक्ष माप की अनुमति, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए मिलकर दोनों. इन तकनीकों में अपेक्षाकृत आसान और प्रदर्शन करने के लिए जल्दी कर रहे हैं और महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है.

Introduction

एंटीवायरल मेजबान बचाव में एक महत्वपूर्ण घटना तथाकथित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) 1,2 द्वारा रोगज़नक़ का तेजी से पता लगाने है. आरएनए वायरस के संक्रमण के intracellular पता लगाने के दो cytoplasmic आरएनए helicases, रिग, मैं (retinoic एसिड inducible जीन मैं) और MDA5 (मेलेनोमा भेदभाव जुड़े प्रोटीन 5) 3-5 पर निर्भर है. रिग, मैं दो एन टर्मिनल कस्पासे भर्ती डोमेन (कार्ड), एक केंद्रीय Dech बॉक्स प्रकार शाही सेना helicase डोमेन, और एक सी टर्मिनल डोमेन (CTD) 4,6 से बना है. CTD और helicase डोमेन गैर आत्म (वायरल) RNAs की मान्यता के लिए आवश्यक हैं, जबकि कार्ड एक एंटीवायरल मेजबान स्थिति की स्थापना के लिए अग्रणी बहाव के संकेत मध्यस्थता.

रिग, मैं एक विशिष्ट शाही सेना ligand के अभाव में यानी मूक राज्य में है, तो दूसरा कार्ड केंद्रीय helicase डोमेन के साथ सूचना का आदान प्रदान और एक ऑटो निरोधात्मक रचना 7-11 में रिग, मैं रहता है. रिग, मैं कम करने के लिए बांध डबलएक 5'-triphosphate (5'PPP), लंबे dsRNA, और Polyu / यू सी युक्त शाही सेना, कई आरएनए वायरस 12-16 के जीनोम पर मौजूद हैं, जो क्लासिक हस्ताक्षर संरचनाओं असर किनारा (डीएस) आरएनए. रिग, मैं सक्रियण की दो प्रमुख विशेषताएं एक बंद रचना 6,17 और होमोसेक्सुअल oligomerization 6,18,19 के लिए एक स्विच कर रहे हैं. गठनात्मक स्विच, शाही सेना बाध्यकारी बढ़ाता बहाव के संकेत के लिए कार्ड को उजागर करता है, और एक सक्रिय ATPase साइट 8,9,11,20 reconstitutes. oligomeric रिग, मैं परिसरों के गठन एंटीवायरल संकेत पारगमन 11 के लिए एक मंच के लिए फार्म का बहाव के संकेत अनुकूलक अणुओं की बढ़ी भर्ती करने के लिए ले जाता है. रिग, मैं विनियमित संकेत श्रृंखला अंततः प्रतिलेखन कारक सक्रिय हो IRF-3 के लिए ऊपर विनियमन एक पूर्ण antiviral प्रतिक्रिया 21,22 के लिए इंटरफेरॉन (IFN-alpha/beta) जीन और इंटरफेरॉन उत्तेजित जीन की इसलिए जीन अभिव्यक्ति (ISGs) की . सर्वश्रेष्ठ विशेषता ISGs से एक शाही सेना सक्रिय protei हैn kinase (PKR) 23. PKR यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 2 अल्फा (eIF2α) kinases के परिवार के अंतर्गत आता है और एक एन टर्मिनल डबल असहाय शाही सेना बाध्यकारी डोमेन और एक सी टर्मिनल kinase डोमेन से बना है. kinase डोमेन PKR सक्रियण के लिए dimerization इंटरफ़ेस महत्वपूर्ण गठन और प्रोटीन का उत्प्रेरक कार्य करता है. वायरल dsRNA को PKR के बंधन इसके गठनात्मक परिवर्तन अन्य अवशेषों के बीच Thr 446 पर dimerization और ऑटो phosphorylation की अनुमति की ओर जाता है. PKR तो जिससे वायरल mRNAs 23-27 का अनुवाद अवरुद्ध, eIF2α की phosphorylation मध्यस्थता करता है.

रिग, मैं और PKR दोनों, प्रमुख संरचनात्मक rearrangements गुजरना oligomeric परिसरों फार्म और बाद translationally phosphorylation / dephosphorylation और ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29 द्वारा संशोधित कर रहे हैं. वायरल शाही सेना संरचनाओं रिग, मैं और PKR सक्रिय कर रहे हैं (और क्या मंच पर वायरल विरोधी ख सकता है जो की एक बेहतर समझ के लिएई) हस्तक्षेप, यह ठीक सक्रियण स्थिति निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. दोनों PRRs के लिए यह पहले से सक्रियण trypsin प्रतिरोधी प्रोटीन टुकड़े 6,17,30 और उच्च आदेश oligomers 6,18,19 के उद्भव की ओर जाता है कि वर्णित किया गया था. हालांकि, एंटीवायरल मेजबान प्रतिक्रिया 1,2,24 के इन महत्वपूर्ण कारकों पर साहित्य का धन दिया, प्रत्यक्ष तरीकों के आवेदन अपेक्षाकृत दुर्लभ लगता है. व्यापक उपयोग के उत्तेजक की आशा में, हम मजबूती के साथ रिग, मैं और PKR के सक्रियण राज्यों का विश्लेषण करने के लिए सुविधाजनक और संवेदनशील प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. IFN सक्षम मानव कोशिका लाइन A549 रिग, मैं और PKR, तनु दरार घाटी बुखार वायरस उत्परिवर्ती क्लोन 13 (सीएल 13) 31,32 के एक स्थापित उत्प्रेरक से संक्रमित है. एक सरल lysing प्रक्रिया के बाद, संक्रमित कोशिकाओं के अर्क गठनात्मक स्विचिंग का मूल्यांकन करने के लिए सीमित trypsin पाचन / पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया जाता है, और नीले देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) / पश्चिमी धब्बा analys द्वाराoligomers के गठन को मापने के लिए है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

संक्रमण के लिए A549 कोशिकाओं के 1. सीडिंग

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर A549 कोशिकाओं की एक T75 फ्लास्क खेती और 5% सेल संस्कृति माध्यम में सीओ 2 (DMEM 10% एफसीएस, 526.6 मिलीग्राम / एल एल glutamine, 50.000 यू / एल पेनिसिलिन, और 50 मिलीग्राम / एल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक).
  2. कोशिकाओं फसल को शुरू करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पर गरम एक waterbath में सेल संस्कृति माध्यम, पीबीएस और 0.05% trypsin EDTA को गर्म
  3. मध्यम निकालें और 10 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. फिर पीबीएस निकालें.
  4. Trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी में समान रूप से वितरित. 37 डिग्री सेल्सियस के साथ एक मशीन में कुप्पी स्थानांतरण और 5% सीओ 2.
  5. सभी कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं,, सेल संस्कृति के माध्यम से 7 मिलीलीटर जोड़ने कोशिकाओं resuspend, और एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण.
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए 800 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने और 10 मिलीलीटर ताजा सेल संस्कृति माध्यम में गोली resuspend.
  7. एक गिनती चैम्बर के साथ कोशिकाओं की गणना.
  8. दो T25 बोतल प्रत्येक में सेल संस्कृति के माध्यम से 5 एमएल में 2.5 x 10 6 कोशिकाओं जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए सेते हैं और 5% सीओ 2. एक कुप्पी नकली नियंत्रण और सीएल 13 संक्रमण के लिए एक के लिए कार्य करता है.

दरार घाटी बुखार वायरस क्लोन 13 से 2. संक्रमण (सीएल 13)

  1. नोट: CL 13 जर्मनी में बीएसएल 2 शर्तों के तहत नियंत्रित किया जा सकता है जो एक तनु वायरस उत्परिवर्ती है. प्रासंगिक राष्ट्रीय दिशा निर्देशों को देखें. अन्य विशिष्ट IFN inducers सेंडाइ वायरस (तनाव Cantell) या न्यूकासल रोग वायरस होगा.
  2. 5% FCS युक्त पूर्व गर्म पीबीएस, सीरम मुक्त माध्यम है, और सेल संस्कृति माध्यम.
  3. 5 के संक्रमण की बहुलता (MOI) के साथ 2.5 x 10 6 A549 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए सीरम मुक्त माध्यम में क्लोरीन की 13 1.25 10 x 7 pfu / एमएल तैयार करें. के लिए खाते में जरूरत की तुलना में थोड़ा (लगभग 10%) अधिक से अधिक राशि की तैयारी पिपेट त्रुटियों.
  4. 1.3 के तहत वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
  5. 1 सीएल 13 कमजोर पड़ने की मिलीलीटर या जोड़ेंसीरम मुक्त माध्यम से कोशिकाओं को (असंक्रमित नियंत्रण, नकली), और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं. क्रमशः, सी.एल. 13 कमजोर पड़ने और सीरम मुक्त माध्यम के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए हर 15 मिनट ध्यान से फ्लास्क ले जाएँ.
  6. संक्रमण के 1 घंटे के बाद, inocula निकालने के 5% FCS साथ पूर्व गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से 5 एमएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं.

सेल lysates की 3. तैयारी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस / 0.5% ट्राइटन X-100 तैयार करें सेरीन protease inhibitors न जोड़ें.
  2. ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और ताजा पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें.
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 800 XG पर सेल एक बाज़ ट्यूब में निलंबन, और अपकेंद्रित्र हस्तांतरण, कोशिकाओं परिमार्जन.
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 30 μl पीबीएस / 0.5% ट्राइटन X-100 में सेल गोली resuspend. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में lysate स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट के लिए सेते
  5. 10.00 पर lysate अपकेंद्रित्र0 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए XG और एक ताजा ट्यूब में स्पष्ट सेल lysate (सतह पर तैरनेवाला) हस्तांतरण.
  6. कहीं 33 में वर्णित के रूप में ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
  7. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या trypsin पाचन (4.1) या देशी पृष्ठ (5.1) के लिए आगे बढ़ें.

पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स की गठनात्मक परिवर्तन के 4. निर्धारण

  1. सेल lysates की TPCK-trypsin उपचार
    1. 2 ग्राम / μl के अंतिम काम एकाग्रता पीबीएस में एल -1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl कीटोन का इलाज (TPCK) trypsin पतला.
    2. दो नए ट्यूबों पीबीएस के साथ 9 μl के अंतिम मात्रा में (नकली या सीएल 13) प्रत्येक प्रोटीन lysate के 25 ग्राम के अंतिम प्रोटीन एकाग्रता में समायोजित करें. इसलिए, यह दो बार नकली और दो बार सीएल 13 संक्रमण 25 माइक्रोग्राम lysate प्रत्येक के साथ चार ट्यूब, होना चाहिए. एक इनपुट नियंत्रण (इलाज) और TPCK-trypsin के साथ इलाज के लिए एक सेट के रूप में निर्धारित किया है.
    3. पीबीएस के 1 μl जोड़ें (इलाज)या 1 2 ग्राम / μl TPCK-trypsin (अंतिम एकाग्रता: 0.2 माइक्रोग्राम / μl) के μl सेल lysates करने और pipetting द्वारा प्रतिक्रियाओं मिश्रण. यह पाचन की दक्षता समझौता होगा क्योंकि, फ्रीज और TPCK-trypsin aliquots पिघलना नहीं है.
    4. 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर lysates सेते हैं. 5x (250 मिमी Tris-एचसीएल 6.8 पीएच, 10% एसडीएस, 50% ग्लिसरॉल, 25% β-mercaptoethanol, नीले 0.5% bromphenol) नमूना बफर denaturing जोड़कर और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबलते प्रतिक्रिया बंद करो यह trypsin ऊष्मायन समय का विस्तार नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. कोई प्रोटीज प्रतिरोधी टुकड़े detectable हैं मामले में, trypsin पाचन के समय छोटा किया जाना चाहिए.
    5. उबलते के बाद, नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता
  2. एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) और पश्चिमी सोख्ता
    1. एक सोडियम सल्फेट dodecyl एक 12% को हल जेल पर एक 5% स्टैकिंग युक्त (एसडीएस) polyacrylamide जेल पर नमूने लेता है. जब तक जेल प्रति 25 मा प्रोटीन को अलगbromphenol नीले बाहर चलाता है.
    2. मेथनॉल के साथ 30 सेकंड के लिए एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली को सक्रिय करें और हस्तांतरण बफर (48 मिमी Tris, 39 मिमी glycin, 1.3 मिमी एसडीएस, 20% मेथनॉल) में डाल दिया.
    3. एक semidry सोख्ता प्रणाली के साथ सोख्ता तैयार है और 1 घंटे के लिए 10 वी में प्रोटीन के हस्तांतरण की अनुमति है. , झिल्ली बाहर ले जाओ पानी के साथ संक्षिप्त कुल्ला, और इसे सूखा.
    4. शीघ्र ही मेथनॉल में स्थानांतरित करके झिल्ली पुन: सक्रिय. टीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए धो लें. आरटी पर या 4 डिग्री सीओ / एन पर 1 घंटे के लिए टीबीएस में 10% दूध स्किम के साथ ब्लॉक 5 मिनट टीबीएस के साथ प्रत्येक के लिए झिल्ली 3x धो लें.
    5. तालिका 1 में सिफारिश के रूप में एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को तैयार है और आरटी पर या 4 डिग्री सीओ / एन पर 1 घंटे के लिए झिल्ली सेते
    6. 10 मिनट टीबीएस आयकर साथ प्रत्येक के लिए झिल्ली 3x धो लें. टीबीएस में 1% स्किम दूध में एक 1:20,000 कमजोर पड़ने पर हॉर्सरैडिश peroxidase के साथ मिलकर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें. आरटी पर 45 मिनट सेते हैं.
    7. 10 मिनट टीबीएस आयकर साथ प्रत्येक के लिए झिल्ली 3x धो लें, और ओटीबीएस के साथ पूर्वोत्तर के अतिरिक्त समय.
    8. संकेत का पता लगाने के लिए एक वाणिज्यिक chemiluminescense किट और एक डिजिटल जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करें.
  3. Coomassie खूब ब्लू जी 250 धुंधला
    1. 4.2.1 में वर्णित के रूप में एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन करना. Bromphenol नीले बाहर चलाता है जब तक लोड एक एसडीएस polyacrylamide जेल पर नमूने और जेल प्रति 25 मा जेल चला रहे हैं.
    2. आरटी पर Coomassie खूब ब्लू जी 250 धुंधला प्रदर्शन करना. लगातार झटकों के तहत सभी incubations करो.
    3. 40% मेथनॉल और 30 मिनट के लिए 10% एसिटिक एसिड युक्त निर्धारण समाधान के लिए जेल स्थानांतरण.
    4. Destaining समाधान (25% इथेनॉल और 8% एसिटिक एसिड) के लिए बफर एक्सचेंज और 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. 40% मेथनॉल और 1 घंटे के लिए 10% एसिटिक एसिड में 0.2% Coomassie Brillant ब्लू जी 250 के साथ जेल दाग.
    6. Destaining समाधान के साथ जेल destain और 10 मिनट, 30 मिनट और 60 मिनट के बाद बफर का आदान प्रदान.
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25% इथेनॉल, 8% एसिटिक एसिड, और 4% ग्लिसरॉल में जेल स्टोर 4.2.8 के तहत वर्णित के रूप में इमेजिंग और विश्लेषण करते हैं.

पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स की Oligomeric राज्य के 5. विश्लेषण

  1. मूल निवासी पन्ना
    1. पीबीएस के साथ 10 μl के अंतिम मात्रा में सेल lysate के 50 ग्राम को तैयार है और की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5 × देशी नमूना बफर (250 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 6.8, 1% सोडियम deoxycholate, 50% ग्लिसरॉल, नीले 0.5% bromphenol) जोड़ 1x.
    2. Stacking के रूप में 5% और जेल के समाधान के रूप में 8% के साथ एक देशी polyacrylamide जेल पर तुरंत नमूने लेता है. किसी देरी के मूल निवासी परिसरों 34 की हानि में परिणाम होगा.
    3. एनोड और 50 मिमी Tris पीएच 8.3, 384 मिमी glycin, कैथोड बफर के रूप में 1% सोडियम deoxycholate के रूप में 50 मिमी Tris-NaOH पीएच 9.0, 384 मिमी glycin साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल प्रति 20 मा पर जेल चला. 1.5-2 घंटे के बाद वैद्युतकणसंचलन समाप्त हो गया है (bromphenol नीले बैंड लगभग 45 मिनट पहले जेल छोड़ दिया है).
  2. पश्चिमी सोख्ता
    1. एक polyv सक्रियमेथनॉल के साथ 30 सेकंड के लिए फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली inylidene और Towbin बफर (25 मिमी Tris, 192 मिमी glycin, 0.1% एसडीएस, 20% मेथनॉल) में डाल दिया.
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक गीला धब्बा चैम्बर इकट्ठा और Towin बफर के साथ टैंक को भरने.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए 250 मा के साथ सोख्ता प्रदर्शन करना
    4. सोख्ता जब पर 4.2.3 से वर्णित के रूप में आगे बढ़ना समाप्त हो गया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

रिग, मैं या PKR द्वारा एक वायरल एगोनिस्ट की मान्यता गठनात्मक स्विचिंग 6,17,30 और oligomerization 6,18,27 से चलाता है. हम क्रमशः, सीमित प्रोटीज पाचन और देशी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) ने इन दो सक्रियण मार्करों assayed.

मानव A549 कोशिकाओं IFN प्रतिपक्षी एनएसएस 35,36 के एक उत्परिवर्तन के द्वारा होती है जो दरार घाटी बुखार वायरस क्लोन 13 (सीएल 13), से संक्रमित थे. कारण कार्यात्मक एनएसएस के अभाव के क्लोन 13 दृढ़ता से कोशिकाओं 12,31,32,37 में एक मजबूत एंटीवायरल राज्य की स्थापना के लिए अग्रणी, रिग, मैं और PKR लाती है.

RIG-I की एक तेजी से गिरावट में नकली संक्रमित कोशिका lysates परिणाम की trypsin पाचन, सी.एल. 13 संक्रमण एक 30 केडीए प्रतिरोधी रिग, मैं टुकड़ा चित्रा 1 ए की पीढ़ी की ओर जाता है, जबकि. इसके अलावा PKR अपने Phosph के साथ मेल खाता है, जो संक्रमित नमूनों में trypsin पाचन के लिए आंशिक प्रतिरोध से पता चलता हैorylation चित्रा 1 ए. Trypsin पाचन की क्षमता और विशिष्टता की निगरानी करने के लिए, जैल Coomassie खूब ब्लू जी 250 के साथ दाग रहे थे. अनुपचारित नमूने भरी हुई प्रोटीन चित्रा 1 बी के बराबर मात्रा में दिखा. Trypsin पाचन के लिए नकली और सीएल 13 सेल lysates Subjecting वैश्विक प्रोटीन की मात्रा का एक तुलनीय कमी हो जाती है. इस trypsin उपचार नकली और सीएल 13 संक्रमित नमूने के लिए एक ही क्षमता है कि यह दर्शाता है.

oligomeric परिसरों के गठन देशी पृष्ठ से assayed किया गया था. असंक्रमित कोशिकाओं में, रिग, मैं और PKR के केवल monomers चित्रा 2 पता चला रहे थे. के रूप में अतिरिक्त नियंत्रण हम एक monomer के रूप में मौजूद है, लेकिन जैसे, रिग, मैं 38 के माध्यम से सक्रियण पर dimerize के लिए जाना जाता है जो प्रतिलेखन कारक IRF-3, शामिल थे. सीएल 13 संक्रमण एक धब्बा की और PKR और एक परिभाषित प्रोटीन बैंड के रूप में आईआरएफ -3 dimers / oligomers के रूप में रिग, मैं oligomeric परिसरों की एक मजबूत संचय की ओर जाता है.

वर्ग = "jove_content"> इन परिणामों सीमित trypsin पाचन और देशी पृष्ठ गठनात्मक परिवर्तन और संक्रमण पर रिग, मैं और PKR के oligomer गठन की निगरानी के लिए उपयोगी उपकरण हैं कि प्रदर्शित करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. रिग, मैं और PKR के गठनात्मक स्विच. A549 कोशिकाओं नकली थे संक्रमित या 5 घंटे के बाद, कोशिकाओं पीबीएस में lysed थे. 5 के MOI में क्लोरीन 13 से संक्रमित थे 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ पूरक और सेल lysates को मंजूरी दे दी अनुपचारित छोड़ दिया है या trypsin के साथ इलाज या तो. नमूने पश्चिमी (ए) या ​​Coomassie धुंधला (बी) सोख्ता द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ पर किए थे. Blots रिग, मैं, PKR, phosphorylated PKR (THR 446) के खिलाफ और क्रमशः RVFV nucleoprotein (RVFV एन) और संक्रमण और लोडिंग नियंत्रण के रूप में बीटा actin के खिलाफ दाग रहे थे._blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. रिग, मैं, PKR की oligomerization, और IRF-3. नकली और सीएल 13 संक्रमित कोशिका lysates के सेल lysates पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बाद देशी पृष्ठ पर किए थे. धुंधला रिग, मैं, PKR, IRF-3, और लोडिंग नियंत्रण के रूप में बीटा actin के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया था. PKR oligomers सबसे अधिक संभावना dimers 27 प्रतिनिधित्व करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वायरस की उपस्थिति और मैं प्रणाली IFN एंटीवायरल प्रकार की सक्रियता सेंसिंग सफल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 22 के लिए महत्वपूर्ण हैं. वायरस का पता लगाने जिससे एक तेजी से प्रतिक्रिया और antiviral सुरक्षा तंत्र की सक्रियता को सक्षम करने, रिग, मैं और PKR तरह रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स (PRRs) द्वारा मध्यस्थता है. यहाँ, हम सीधे रिग, मैं और PKR के सक्रियण स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए दो विधियों का वर्णन.

रिग, मैं और PKR के गठनात्मक परिवर्तन पहले क्रमशः एम. आंधी जूनियर और टी. फुजिता 6,17, और जीएल कोल 30 के समूहों द्वारा वर्णित किया गया था पर नजर रखने के लिए एक उपकरण के रूप में सीमित प्रोटीज पाचन. यह गठनात्मक परिवर्तन के कारण trypsin उपचार के लिए संवेदनशीलता परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक संवेदनशील विधि का प्रतिनिधित्व करता है. वायरस से संक्रमित कोशिका lysates के trypsin उपचार प्रतिरोधी रिग, मैं टुकड़े trypsin के लिए नेतृत्व जबकि trypsin पाचन लागू है, हम, नकली संक्रमित नमूनों में रिग, मैं और PKR का तेजी से क्षरण का पता चला. SimilArly, एक trypsin प्रतिरोधी PKR टुकड़ा सीएल 13 संक्रमण पर खोजा गया था. इस Thr 446, PKR सक्रियण की एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मार्कर पर PKR phosphorylation के साथ गया था. Coomassie धुंधला द्वारा नकली और सीएल 13 सेल lysates की trypsin पाचन मुकाबले वैश्विक प्रोटीन के स्तर की एक तुलनीय कमी को दर्शाता है. इस प्रतिरोधी टुकड़े के गठन रिग, मैं और PKR जैसे प्रोटीन के लिए विशिष्ट है कि इंगित करता है.

रिग, मैं, PKR और IRF-3 के oligomeric परिसरों के गठन देशी पृष्ठ से नजर रखी थी. इन प्रोटीनों नकली संक्रमित नमूनों में monomers के रूप में बने रहे, जबकि देशी पृष्ठ पर सीएल 13 संक्रमित कोशिका lysates Subjecting, हम, रिग, मैं, PKR और आईआरएफ -3 oligomers का पता चला. रिग, मैं नीचे की ओर रास्ते को सक्रिय करने के लिए oligomers फार्म की जरूरत है. यह रिग, मैं oligomerization antiviral प्रतिक्रिया तंत्र 11 के लिए एक संकेत मंच के लिए फार्म cofactors की भर्ती का समर्थन करता है कि धारणा थी. PKR dimerization का समारोह पूरी तरह से नहीं समझा गया है. सबसे अधिक संभावना है, पीकेडिमर में आर सब यूनिटों एक दूसरे को 25 phosphorylate. मैं IFN प्रकार की प्रणाली कसकर एक transcriptional स्तर पर विनियमित, और आईआरएफ -3 IFN और ISGs 38 के शामिल होने के लिए एक केंद्रीय प्रतिलेखन कारक का प्रतिनिधित्व करता है. सक्रियण की केन्द्रीय पहचान phosphorylation, dimerization, और यह IFN mRNA संश्लेषण 21,39 आरंभ करने के लिए सह activators P300 और CREB बाध्यकारी प्रोटीन (सीबीपी) ट्रांसक्रिप्शनल रंगरूटों नाभिक, जहां के लिए स्थानान्तरण कर रहे हैं. आईआरएफ -3 dimerization के विश्लेषण से मैं प्रतिक्रिया 38 IFN प्रकार की सक्रियता की निगरानी करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल उपकरण है. इसलिए, हम रिग, मैं और PKR oligomerization की oligomerization assays के लिए सिद्धांत का एक सबूत के रूप में आईआरएफ -3 oligomeric परिसरों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. दरअसल, हम सीएल में 13 संक्रमित नमूने आईआरएफ -3 dimerization पता लगाने में सक्षम गैर denaturing परिस्थितियों में प्रोटीन lysates की जुदाई थे अनुमति.

निस्संदेह, प्रत्येक प्रयोगशाला सीमित प्रोटीज DIGE के प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगीstion और देशी पृष्ठ. किसी भी प्रतिरोधी प्रोटीन या बहुत अधिक प्रतिरोधी टुकड़े का कोई पता लगाने के साथ सामना किया, तो एक क्रमशः, पाचन के समय कम या लम्बा हो सकता है. तैयारियों से थोड़ा भिन्न रूप में मतभेद भी, विशिष्ट TPCK-trypsin स्टॉक के कारण हो सकता है. इसलिए, विभिन्न TPCK-trypsin सांद्रता अनुकूलन के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. सेल lysates A549 के अलावा अन्य सेल लाइनों से तैयार किया जा सकता है, लेकिन प्रोटोकॉल के रूपांतरों की आवश्यकता हो सकती है. यह इस विशेष सेल प्रकार में ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार trypsin पाचन और देशी पृष्ठ के लिए कुल प्रोटीन की मात्रा को समायोजित करने की सिफारिश की है. इसके अलावा, सीमित पता लगाने या देशी पृष्ठ से oligomeric परिसरों की कमजोर जुदाई कई कारण हो सकते हैं और बाद के रूप में संबोधित किया जा सकता है:, उपकरण शेष denaturing एजेंटों को दूर करने के लिए साफ है कि सुनिश्चित करें कि 4 डिग्री सेल्सियस पर पृष्ठ के दौरान सभी नमूनों और जेल रखना , और नमूना तैयार करने और एलओए के बीच के समय का विस्तार नहीं हैजेल पर डिंग. लिमिटेड प्रोटीज पाचन और देशी पृष्ठ भी एक और महत्वपूर्ण है, निकट से संबंधित PRR, MDA5 40-42 की सक्रियता की निगरानी करने के लिए नियोजित किया गया है. MDA5 सक्रियण की निगरानी रिग, मैं और PKR की तुलना में अलग प्रयोगात्मक शर्तों की आवश्यकता है, और इसलिए यहाँ शामिल नहीं किया गया था.

संक्षेप में, रिग, मैं और PKR की सक्रियता को मापने के लिए दो उपयोगी और संवेदनशील तरीके के लिए बिंदु से बिंदु प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं. लिमिटेड प्रोटीज पाचन और देशी पृष्ठ, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, गठनात्मक परिवर्तन और oligomerization के परमिट निगरानी, ​​क्रमशः के लिए युग्मित दोनों. इन विधियों का प्रयोग, हम पहले से रिग, मैं सीधे कोशिकाओं 32 में उनके प्रवेश के बाद विभिन्न वायरस के nucleocapsids से सक्रिय किया जा सकता है कि दिखाया गया था.

संक्रमित कोशिकाओं में रिग, मैं और PKR सक्रियण के लिए प्रासंगिक आरएनए प्रजातियों की सही प्रकृति और मूल अभी भी पूरी तरह से हल नहीं कर रहे हैं. इसके अलावा, कई वायरस के साथ हस्तक्षेपरणनीति 12,43-46 की एक विस्तृत विविधता से PRRs का कार्य करता है. प्रस्तुत तकनीक, रिग, मैं और PKR सक्रियण के लिए एक आसान और सीधा माप की अनुमति देकर तरीकों की स्पेक्ट्रम बढ़ाना प्रदर्शन करने के लिए जल्दी कर रहे हैं, और महंगे उपकरण की आवश्यकता नहीं है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम विरोधी दरार घाटी बुखार वायरस सीरा उपलब्ध कराने के लिए CISA-Inia से ऐलेजैंड्रो ब्रुन धन्यवाद. हमारी प्रयोगशालाओं में काम Forschungsförderung मणि द्वारा समर्थित है. 2 पेट §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum गिएस्सेन und मारबर्ग, उभरते वायरल रोगों के लिए लाइबनिट्स ग्रेजुएट स्कूल (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, और DFG Schwerpunktprogramm (एसपीपी) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

संक्रामक रोगों अंक 89 सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया वायरस के संक्रमण रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर रिग मैं PKR IRF-3 सीमित प्रोटीज पाचन गठनात्मक स्विच देशी पृष्ठ oligomerization
Antiviral पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स रिग, मैं और PKR द्वारा सीमित Protease पाचन और मूल निवासी पृष्ठ की मॉनिटरिंग सक्रियण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter