Summary
바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다.
Abstract
바이러스 감염에 대한 숙주 방어는 타고난 면역 시스템의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의한 신속한 검출에 따라 달라집니다. 세포질에서, PRRS RIG-I 및 특정 바이러스 성 RNA의 리간드 PKR 바인딩. 이것은 첫 번째 구조적 전환 및 올리고머를 중재하고 항 바이러스 인터페론 반응의 활성화를 가능하게한다. 바이러스 숙주 유전자 발현을 측정하는 방법은 잘 확립되어 있지만, 직접 RIG-I 및 PKR의 활성 상태를 모니터링하는 방법은 부분적으로 만 이하이며 잘 확립.
여기, 우리는 설립 인터페론 유도, 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) 감염시 RIG-I과 PKR 자극을 모니터링하는 두 가지 방법을 설명합니다. 제한 트립신 소화 PRRS의 구조적 변화를 나타내는 단백질 분해 효소의 감도 변화를 분석 할 수 있습니다. RIG-I과 PKR, wherea의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 결과에서 해물의 트립신 소화망할 CIA의 13 감염은 단백질 분해 효소 내성 RIG-I 조각의 출현에 이르게한다. 또한 PKR은의 Thr 446에 그것의 특징 인산화와 일치 트립신 소화에 바이러스에 의한 부분적인 저항을 보여줍니다. RIG-I과 PKR 올리고머 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 확인 된의 형성. 이 단백질은 모의 감염된 샘플 단량체로 남아있는 반면 감염되면, RIG-I과 PKR 올리고머 단지의 강한 축적이있다.
제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지는 RIG-I과 PKR 활성화의 두 다양한 단계의 민감하고 직접 측정을 허용, 웨스턴 블롯 분석을 결합 둘. 이 기술은 상대적으로 쉽게 수행 할 수 신속하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다.
Introduction
항 바이러스 숙주 방어에서 중요한 이벤트는 소위 패턴 인식 수용체 (PRRS) 1,2에 의해 병원균의 신속한 검출입니다. RNA 바이러스 감염 세포 내 검출은 두 가지 세포 내 RNA의 헬리, RIG-I (레티노 산 유도 유전자 I) 및 MDA5 (흑색 종 분화 관련 단백질 5) 3-5에 따라 달라집니다. RIG-I은 두 개의 N-말단 카스파 모집 도메인 (카드), 중앙 DECH 박스 타입 RNA 헬리 케이즈 도메인과 C-말단 도메인 (CTD) 4,6로 구성되어있다. CTD 및 헬리 케이즈 도메인이 아닌 자기 (바이러스) RNA를 인식에 필요한 반면, 카드는 항 바이러스 호스트 상태의 설립에 이르는 다운 스트림 신호를 중재.
RIG-I가 특정 RNA 리간드의 부재 즉 무음 상태에있는 경우, 제 CARD는 중앙 헬리 케이즈 도메인과 상호 작용하고 자동 억제 입체 7-11 RIG-I를 유지한다. RIG-I는 짧은에 바인딩 더블5'-트리 포스페이트 (5'PPP), 긴 dsRNA에, 그리고 polyU / UC 풍부한 RNA, 많은 RNA 바이러스 12-16의 게놈에 존재하는 고전적인 서명 구조 베어링 가닥 (DS) RNA. RIG-I 활성화의 두 가지 주요 특성은 닫힌 형태 6,17 및 호모 올리고머 6,18,19로 전환합니다. 구조적 스위치, RNA 바인딩 향상 다운 스트림 신호의 카드를 노출하고 활성 ATP 아제 사이트 8,9,11,20을 재구성한다. 올리고머 RIG-I 복합체의 형성은 항 바이러스 신호 전달 (11)를위한 플랫폼을 형성하도록 하류 시그널링 어댑터 분자의 향상된 모집에 이르게한다. RIG-I-조절 신호 체인은 결국 전사 인자를 활성화 IRF-3 위로 규칙 전체 바이러스 반응 (21, 22)에 대한 인터페론 (IFN-alpha/beta) 유전자와 인터페론 자극 유전자의 따라서 유전자 발현 (ISGs)의 . 최고의 특성화 ISGs 중 하나는 RNA 활성화 PROTEI입니다N 키나제 (PKR) 23. PKR은 진핵 번역 개시 인자 2 알파 (eIF2α) 키나아제의 가족에 속하는 N-말단 이중 가닥 RNA 결합 도메인과 C-말단 키나제 도메인으로 구성되어 있습니다. 키나아제는 PKR 활성화를위한 이량 인터페이스 중요한 구성하고 단백질의 촉매 기능을 수행한다. 바이러스를 dsRNA에 PKR의 바인딩의 구조적 변화가 다른 잔류 물 사이의 Thr 446에 이합체 및 자동 인산화를 허용로 연결됩니다. PKR는 따라서 바이러스의 mRNA 23-27의 번역을 차단 eIF2α의 인산화를 중재.
RIG-I와 PKR 모두 주요 구조 재 배열을 받아야 올리고머 단지를 형성하고 포스트 병진 인산화 / 탈 인산화와 유비퀴틴 10,11,19,23,24,26-29에 의해 수정됩니다. 바이러스 성 RNA의 구조는 RIG-I과 PKR 활성화 (그리고 어떤 단계에서 바이러스 성 길항제 ㄴ 수있는의 더 나은 이해를위한E) 간섭, 그것은 정확하게 활성화 상태를 결정하는 것이 중요하다. 모두 PRRS를 위해 이전에 활성화가 트립신 내성 단백질 조각 6,17,30 및 고차 올리고머 6,18,19의 출현에 이르게 설명했다. 그러나, 항 바이러스 호스트 응답 1,2,24 이러한 핵심 요소에 대한 문학의 재산을 주어, 직접 방법의 응용 프로그램은 비교적 드문 것 같다. 광범위한 사용을 촉진의 희망, 우리는 견고 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 분석 할 수있는 편리하고 민감한 프로토콜을 제공합니다. IFN 유능한 인간 세포주 A549은 RIG-I과 PKR, 감쇠 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) (31, 32)의 설립 활성화에 감염된다. 간단한 용해하는 과정을 거친 후, 감염된 세포의 추출물 구조적 전환을 평가하기 위해 제한된 트립신 소화 / 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트되고 파란색 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE) / 웨스턴 블롯 분석가로올리고머의 형성을 측정하는 것이다.
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Protocol
감염 A549 세포의 1. 시드
- 37 ° C에서 A549 세포의 T75 플라스크를 육성하고 5 %는 세포 배양 배지에서 CO 2 (DMEM 10 % FCS, 526.6 ㎎ / ℓ의 L-글루타민, 50.000 U / L 페니실린, 50 ㎎ / ℓ의 스트렙토 마이신과 보충).
- 세포를 수확을 시작하기 전에 37 ℃로 가열 수조에 세포 배양 배지, PBS 0.05 % 트립신-EDTA를 따뜻하게
- 매체를 제거하고 10 ㎖의 PBS로 세포를 씻어. 다시 PBS를 제거합니다.
- 트립신-EDTA의 3 mL를 넣고 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 37 ° C로 인큐베이터에서 플라스크를 전송하고 5 % CO 2.
- 모든 세포가 분리되면, 세포 배양 배지 12 mL를 넣고 세포를 재현 탁하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- RT에서 5 분 동안 800 XG에서 세포를 원심 분리하고 상등액을 10 ㎖의 신선한 세포 배양 배지에 펠렛을 재현 탁.
- 카운팅 챔버와 함께 세포를 카운트.
- 두 T25 플라스크 각 세포 배양 배지 5 ㎖에 2.5 × 10 6 세포를 추가합니다. 37 ° C에서 16 시간 동안 배양하고 5 % CO 2. 한 플라스크 모의 제어 및 망할 CIA 13 감염에 대한 하나 제공합니다.
리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 2. 감염 된 (C1 13)
- 참고 : 망할 CIA (13)가 독일에서 BSL-2 조건에서 처리 할 수있는 약독 화 바이러스의 돌연변이이다. 해당 국가의 지침을 참조하십시오. 다른 일반적인 IFN 유도제 센다이 바이러스 (변형 Cantell) 뉴캐슬 질병 바이러스 일 것입니다.
- 5 % FCS를 함유하는 사전 따뜻한 PBS, 무 혈청 배지 및 세포 배양 배지.
- 5 감염 다중도 (MOI)로 2.5 × 106 A549 세포를 감염 혈청 배지에서 망할 CIA 13 1.25 × 10 7 PFU / ㎖를 준비한다.을 고려하는 데 필요한 것보다 약간 (약 10 %)보다 많은 양을 준비 피펫 오류.
- 1.3에 설명 된대로 PBS로 세포를 씻으십시오.
- 1 망할 CIA 13 ml의 희석 또는 추가무 혈청 배지의 세포 (감염되지 않은 제어, 모의), 37 ° C에서 1 시간 5 % CO 2 알을 품다. 각각 망할 CIA 13 희석 혈청 배지의 동등한 분배를 보장하기 위해 매 15 분 조심스럽게 플라스크를 이동합니다.
- 감염의 1 시간 후, 접종을 제거 5 % FCS로 예열 된 세포 배양 배지 5 ㎖를 추가하고, 37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 알을 품다.
세포 용 해물의 3. 준비
- 4 ℃에서 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100을 준비 세린 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오.
- 차가운 PBS로 세포를 세척하고 신선한 PBS의 10 ML을 추가합니다.
- RT에서 5 분 800 XG에서 세포 팔콘 튜브 서스펜션, 원심 분리기를 전송하고, 세포를 긁어.
- 상층 액을 제거하고 30 ㎕의 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100에있는 세포 펠렛을 resuspend. 새로운 1.5 ML 튜브에 해물을 전송하고 4 ℃에서 적어도 10 분 동안 품어
- 10.00 해물을 원심 분리기0 ~ 4 ° C에서 10 분 동안 XG와 신선한 튜브에 명확히 세포 용 해물 (상층 액)을 전송합니다.
- 다른 33 설명한대로 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 결정합니다.
- -20 ° C에서 보관 또는 트립신 소화 (4.1) 또는 기본 페이지 (5.1)로 진행합니다.
패턴 인식 수용체의 구조적인 변경 4. 결정
- 세포 용 해물의 TPCK - 트립신 처리
- 2 ㎍ / μL의 최종 작업 농도로 PBS에 L-1-tosylamido-2 - 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 처리 (TPCK) 트립신을 희석.
- 두 개의 새로운 튜브 PBS 9 μL의 최종 볼륨 (모의 또는 망할 CIA 13) 각 단백질의 용해 액의 25 μg의 최종 단백질 농도를 조정합니다. 따라서, 그것은 두 번 모의 두 번 망할 CIA 13 감염 25 μg의 해물을 각각 네 개의 튜브해야합니다. 하나는 입력 제어 (치료) 및 TPCK - 트립신 처리를위한 하나의 세트로 설정합니다.
- PBS의 1 μl를 추가합니다 (치료)또는 1 ㎍ / ㎕의 TPCK-트립신 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL) ㎕의 세포 용 해물을하고 피펫으로 반응을 섞는다. 그것은 소화의 효율성을 손상하기 때문에, 동결 TPCK-트립신 분주을 해동하지 마십시오.
- 25 분 동안 37 ° C에서 해물을 품어. 배는 (250 MM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 25 %의 β-머 캅토 에탄올, 파랑 0.5 % 브로 모 페놀) 샘플 버퍼를 변성 추가하여 95 ℃에서 5 분간 끓여 반응을 중지 그것은 트립신 보육 시간을 연장하지하는 것이 중요합니다. 더 프로테아제 저항하는 조각이 검출없는 경우, 트립신 소화의 시간을 단축 할 수 있어야합니다.
- 끓는 후, 샘플은 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
- SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)과 웨스턴 블로 팅
- 황산 도데 실 나트륨 12 % 해결 젤에 5 %의 스택을 포함하는 (SDS) 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 샘플을로드합니다. 까지 젤 당 25mA에서 단백질을 분리브로 모 페놀 블루 밖으로 실행됩니다.
- 메탄올로 30 초 동안 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 전송 버퍼 (48 mM 트리스, 39 mM의 글리신, 1.3 mM의 SDS, 20 % 메탄올)에 넣어.
- 반 건조 블로 팅 시스템과 블로 팅을 준비하고 1 시간 동안 10 V에서 단백질의 전송을 할 수 있습니다. 멤브레인을 꺼내 물로 간단히 씻어서 말리면.
- 곧 메탄올로 전송하여 막 활성화하십시오. TBS로 5 분 씻으십시오. 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 TBS에서 10 % 탈지 우유로 차단 5 분 TBS 각각의 막 배를 씻으십시오.
- 표 1에 권장 항체 희석을 준비하고 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 막 부화
- 10 분 TBS-T와 각 막 배를 씻으십시오. TBS의 1 % 탈지 우유 1:20,000 희석에 고추 냉이 퍼 옥시 다제과 함께 적절한 보조 항체를 추가합니다. 실온에서 45 분 알을 품다.
- 10 분 TBS-T와 각 막 배를 세척하고, 오TBS와 네브라스카 추가 시간.
- 신호 검출을위한 상용 chemiluminescense 키트 및 디지털 겔 이미징 시스템을 사용한다.
- 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색법
- 4.2.1에 설명 된대로 SDS-PAGE를 수행합니다. 브로 모 페놀 블루가 소진 될 때까지로드 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 샘플 및 젤 당 25mA에서 젤을 실행합니다.
- RT에서 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색을 수행합니다. 일정한 진탕 모든 배양을한다.
- 40 % 메탄올, 30 분 동안 10 % 아세트산을 함유하는 고정액으로 겔을 전송.
- destaining 용액 (25 % 에탄올과 8 % 아세트산)에 버퍼를 교환하고 5 분 동안 품어.
- 40 % 메탄올로 1 시간 동안 10 % 아세트산 0.2 % 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250으로 겔을 염색.
- destaining 용액 겔을 Destain하고 10 분, 30 분 및 60 분 후에 버퍼를 교환한다.
- 4 ° C에서 25 % 에탄올, 8 % 초산, 4 % 글리세롤에 젤을 저장 4.2.8에 설명 된대로 이미징 및 분석을 수행합니다.
패턴 인식 수용체의 올리고머 미국의 5. 분석
- 기본 페이지
- PBS 10 μL의 최종 부피로 세포 용 해물 50 μg를 준비의 최종 농도 5 × 네이티브 샘플 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 50 % 글리세롤, 블루 0.5 % 브로 모 페놀)를 추가 1X.
- 스태킹 5 % 젤을 해결하는 등의 8 %와 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤에 즉시 샘플을로드합니다. 지연은 네이티브 단지 (34)의 손실이 발생할 것입니다.
- 양극과 50 mM 트리스 산도 8.3, 384 MM의 글리신, 음극 버퍼로 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 등으로 50 mM 트리스 - 수산화 나트륨의 pH 9.0, 384 mM의 글리신과 4 ° C에서 젤 당 20mA에서 젤을 실행합니다. 1.5 시간 후 전기가 완료 (브로 모 페놀 블루 밴드는 약 45 분 이전에 젤 남아있다).
- 웨스턴 블로 팅
- polyv 활성화메탄올 30 초 동안 플루오 라이드 (PVDF) 막을 inylidene 및 Towbin 버퍼 (25 MM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, 20 % 메탄올)에 넣어.
- 제조업체의 지시에 따라 젖은 얼룩 챔버를 조립하고 Towin 버퍼 탱크를 채우십시오.
- 4 ℃에서 1.5 시간 동안 250mA로 블로 팅을 수행합니다
- 모래 바닥 경우는 4.2.3에서 설명 된대로 진행으로 완성되고 있습니다.
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Representative Results
RIG-I 또는 PKR에 의한 바이러스 성 작용제의 인식은 구조적 전환 6,17,30 및 올리고머 6,18,27를 트리거합니다. 우리는 각각 제한된 단백질 분해 효소의 소화와 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해이 두 활성화 마커를 정량.
인간의 A549 세포는 IFN 길항제 NSS (35, 36)의 돌연변이에 의해 특징 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 (망할 CIA 13)에 감염되었다. 때문에 기능 NSS의 부재로, 클론 (13)은 강하게 세포 12,31,32,37에서 강력한 항 바이러스 상태의 설립에 이르는, RIG-I과 PKR을 유도한다.
RIG-I의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 용 해물 결과 트립신 소화, 망할 CIA 13 감염이 30 kDa의 저항 RIG-I 조각 그림 1A의 생성에 이르게 반면. 또한 PKR은 phosph과 일치 감염된 샘플에 트립신 소화 부분 내성을 보여줍니다orylation의 그림 1A. 트립신 소화의 효율성과 특이성을 모니터링하기 위해, 젤 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250으로 염색 하였다. 처리되지 않은 샘플을로드 단백질 그림 1B의 같은 양을 보여줍니다. 트립신 소화에 모의하고 망할 CIA 13 세포 용 해물을 가할 글로벌 단백질 양의 유사한 감소로 연결됩니다. 이 트립신 처리를 모의하고 망할 CIA (13)에 감염된 샘플에 대해 동일한 효율이 있음을 보여줍니다.
올리고머 성 복합체의 형성은 네이티브 PAGE에 의해 분석 하였다. 감염되지 않은 세포에서 RIG-I과 PKR 만 단량체는 그림 2를 발견했다. 같은 추가 컨트롤 우리가 단량체로 존재하지만, 예를 들어, RIG-I (38)을 통해 활성화시 이량 알려진 전사 인자 IRF-3를 포함. CL 13 감염은 얼룩과 PKR과 정의 된 단백질 밴드로 IRF-3 량체 / 올리고머 형태의 RIG-I 올리고머 단지의 강한 축적으로 이어집니다.
도 1. RIG-I 및 PKR의 구조적 스위치. A549 세포 모의되었습니다 감염된 또는 5 시간 후, 세포를 PBS에 용해시켰다. 5 MOI에서 망할 CIA 13에 감염된되었습니다 0.5 % 트리톤 X-100로 보충하고 세포 용 해물을 맑게 치료 왼쪽 또는 트립신으로 처리 하나. 샘플은 서양 (A) 또는 쿠마시 염색 (B)를 내듯 뒤에 SDS 페이지로 하였다. 오 점은 RIG-I, PKR, 인산화 PKR (의 Thr 446)에 대해 각각 RVFV의 핵 단백질 (RVFV N)와 감염 및로드 제어와 같은 베타 - 액틴,에 염색 하였다._blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. RIG-I, PKR의 올리고머 및 IRF-3. 모의와 망할 CIA 13 감염된 세포 용 해물의 세포 용 해물은 웨스턴 블롯 분석에 의해 다음 기본 페이지로 하였다. 염색은 RIG-I, PKR, IRF-3 및로드 제어와 같은 베타 - 액틴에 대한 항체를 수행 하였다. PKR 올리고머가 가장 가능성이 이량 체 (27)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
바이러스의 존재와 I 시스템을 IFN 항 바이러스 유형의 활성화를 감지 성공적으로 타고난 면역 반응 22 중요하다. 바이러스 탐지함으로써 신속한 대응 및 항 바이러스 방어 메커니즘의 활성화를 가능하게 RIG-I와 PKR 같은 병원체 인식 수용체 (PRRS)에 의해 매개된다. 여기, 우리가 직접 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 평가하기 위해 두 가지 방법을 설명합니다.
RIG-I과 PKR의 구조적 변화 첫 각각 M. 게일 주니어와 T. 후지타 6,17 및 JL 콜 (30)의 그룹에 의해 기술 된 모니터링하는 도구로, 제한되는 단백질 분해 효소의 소화. 그것은 구조적인 변화에 따른 트립신 처리에 감도 변경을 평가하는 중요한 방법을 나타냅니다. 바이러스에 감염된 세포 용 해물의 트립신 처리 저항 RIG-I의 조각을 트립신을 주도하는 반면 트립신 소화를 적용, 우리는 모의 감염된 샘플 RIG-I과 PKR의 급격한 저하를 발견했습니다. Simil아 흘리, 트립신 저항 PKR 단편 망할 CIA 13 감염에 검출되었다. 이것은의 Thr 446, PKR 활성화의 널리 사용되는 마커의 PKR 인산화 동행했다. 쿠마시 염색하여 모의하고 망할 CIA 13 세포 용 해물의 트립신 소화를 비교하는 것은 글로벌 단백질 수준의 대등 한 감소를 보여줍니다. 이 저항하는 조각의 형성이 RIG-I와 같은 PKR 단백질에 대한 특정 있음을 나타냅니다.
RIG-I, PKR 및 IRF-3의 올리고머 성 복합체의 형성은 네이티브 PAGE로 모니터링 하였다. 이 단백질은 모의 감염된 샘플 단량체로 남아있는 반면 기본 페이지로 망할 CIA 13 감염된 세포 용 해물을 가할 경우, 우리는 RIG-I, PKR과 IRF-3 올리고머를 발견했습니다. RIG-I 하류 경로를 활성화 올리고머를 형성 할 필요가있다. 그것은 RIG-I의 올리고머가 바이러스 반응 메커니즘 (11)에 대한 신호 플랫폼을 형성하는 보조 인자의 채용을 지원하는 것을 가정했다. PKR 이합체의 기능은 완전히 이해되지 않습니다. 대부분의 경우, PK이합체의 R 서브 유닛은 서로 25 인산화. 내가 IFN 유형은 시스템은 밀접하게 전사 수준에서 조절하고, IRF-3 IFN과 ISGs (38)의 유도를위한 하나의 중앙 전사 인자를 나타냅니다. 활성화의 중앙 품질 증명은 인산화, 이량, 그것은 IFN mRNA의 합성 21,39을 시작하기 위해 공동 활성제 P300 및 CREB-결합 단백질 (CBP) 전사를 모집 핵에 전좌 있습니다. IRF-3 이량 분석 I 응답 38 IFN 분류 활성화를 모니터링하는 널리 사용되는 도구이다. 따라서, 우리는 RIG-I과 PKR의 올리고머의 올리고머의 분석 원리의 증거로 IRF-3 올리고머 단지의 검출을 사용했다. 사실, 우리는 망할 CIA의 13 감염된 샘플을 IRF-3 이합체를 감지 할 수있는 비 변성 조건에서 단백질 해물의 별거 허용.
의심의 여지가없이, 각 실험실은 제한 프로테아제 DIGE의 프로토콜을 최적화해야합니다stion 및 기본 페이지입니다. 어떤 저항 단백질 또는 너무 많은 저항 조각 검출되지 직면하는 경우, 하나는 각각 소화의 시간을 단축 또는 연장 될 수 있습니다. 준비가 약간 다르기 때문에 차이는, 특정 TPCK-트립신 재고로 인해 수 있습니다. 따라서, 다양한 TPCK-트립신 농도는 최적화를위한 테스트해야합니다. 세포 용 해물은 A549 이외의 세포주로부터 제조 될 수 있지만, 프로토콜의 적응이 요구 될 수있다. 이것은이 특정 세포 유형에 대한 관심의 단백질의 발현 수준에 따라 트립신 소화 네이티브 PAGE에 대한 전체 단백질의 양을 조절하도록 권장한다. 또한, 제한된 탐지 또는 기본 페이지에서 올리고머 단지의 약한 분리는 여러 가지 이유가있을 수 있으며, 다음과 같이 해결 될 수 있습니다, 장비가 남아있는 변성제를 제거하는 청소되어 있는지 확인 4 ° C에서 PAGE 동안 모든 샘플 및 젤을 유지 및 샘플 준비 및 LOA 간의 시간을 연장하지젤 위에 땡. 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지에는 또 다른 중요한, 밀접하게 관련 PRR, MDA5 40-42의 활성화를 모니터링하기 위해 사용되었다. MDA5 활성화의 모니터링 RIG-I와 PKR에 비해 다른 실험 조건을 요구하기 때문에 여기에 포함되지 않았다.
요약하면, RIG-I과 PKR의 활성화를 측정하는 두 가지 유용하고 민감한 방법에 대한 포인트 별 프로토콜이 제공됩니다. 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지, 웨스턴 블롯 분석, 구조적 변화와 올리고머의 허가 모니터링, 각각에 결합 된 두. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 이전에 RIG-I가 직접 세포 (32)에 자신의 항목 이후 다양한 바이러스 뉴 클레오 캡시드를 활성화 할 수 있다는 것을 보여 주었다.
감염된 세포에서 RIG-I과 PKR 활성화를위한 관련 RNA 종의 정확한 성격과 기원은 아직 완전히 해결되지 않습니다. 또한, 많은 바이러스가 방해전략 12,43-46의 다양한으로 PRRS의 기능을합니다. 제시된 기술은 RIG-I과 PKR 활성화를 쉽고 직접 측정을 허용함으로써 방법의 스펙트럼을 확대 실시 빠르게, 그리고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 안티 리프트 밸리 열병 바이러스의 혈청을 제공하는 CISA-INIA에서 알레한드로 브룬 감사합니다. 우리의 실험실에서 작업 Forschungsförderung 보석에 의해 지원됩니다. 2 상승률 §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum 기센 운트 마르부르크, 신흥 바이러스 성 질병에 대한 라이프니츠 대학원 (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 및 DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| Antibodies | |||
| Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS |
| Rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA | WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS | |
| Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H.
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
