Summary
先天防御病毒感染是由模式识别受体（模式识别受体）触发。这两个细胞质模式识别受体RIG-I和PKR结合到病毒签名的RNA，构象变化，低聚，并激活抗病毒信号。方法被描述，其允许方便地监控构象交换和这些细胞质的PRR的低聚。
Abstract
宿主防御病毒感染依赖于快速检测由先天免疫系统的模式识别受体（的PRR）。在细胞质中，PRRS的RIG-I和PKR绑定到特定的病毒RNA配体。该第一介导的构象转换和低聚，然后使活化的抗病毒干扰素应答。而方法来测量抗病毒宿主的基因表达被确立，方法直接监测RIG-I和PKR的激活状态是仅部分和少确立。
在这里，我们描述了两种方法来监测RIG-I和PKR感染刺激后，有一个既定的干扰素诱生剂，裂谷热病毒突变克隆13（以Cl 13）。有限的胰蛋白酶消化使分析改建蛋白酶的敏感性，说明猪蓝耳病的构象变化。裂解液从模拟感染的细胞产生的RIG-I和PKR，wherea的快速降解胰酶消化s氯13感染导致的蛋白酶抗性RIG-I片段的出现。也PKR显示了胰蛋白酶消化，这与其标志的磷酸化苏氨酸在446一致的病毒引起的局部阻力。RIG-I和PKR低聚物是由非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证的形成。一旦感染，有RIG-I和PKR寡聚物的深厚积累，而这些蛋白仍然是模拟感染样本中单体。
有限蛋白酶消化和天然PAGE，既耦合到免疫印迹分析，允许RIG-I和PKR激活两个不同步骤的敏感和直接测量。这些技术是相对容易和快速执行，并且不需要昂贵的设备。
Introduction
在抗病毒的宿主防御的一个关键事件是由所谓的模式识别受体（模式识别受体）1,2的快速检测病原体。细胞内检测的RNA病毒感染是依赖于两个的细胞质RNA解旋酶，RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）3-5。 RIG-I是由两个N-末端caspase募集结构域（卡），一个中央DECH箱型RNA解旋酶结构域和C-末端结构域（CTD）的4,6。而CTD与解旋酶结构域都需要认识到非自（病毒）的RNA，卡介导的下游信号传导，导致建立抗病毒主机的状态。
如果RIG-I是在无声状态下， 即在没有特定的RNA配体，第二张牌交互与中央解旋酶结构域，并保持RIG-I在自动抑制构象7-11。 RIG-I结合，以短双链（DS）的RNA带有5'-三磷酸（5'PPP），长的dsRNA，和理/ UC-丰富的RNA，经典签名结构，其存在于许多RNA病毒12-16的基因组。 RIG-I激活的两个主要特征是一个开关为闭合构象6,17和均聚的低聚6,18,19。构象开关提高了RNA结合，公开卡下游信号，并重新组成一个活跃的ATP酶活性位点8,9,11,20。低聚RIG-I复合物的形成导致下游信号接头分子的增强招募以形成用于抗病毒的信号转导11的一个平台。该RIG-I调节信号链，最终激活转录因子IRF-3的上调对于一个完整的抗病毒反应21,22干扰素（IFN-alpha/beta）基因和干扰素刺激基因，因此该基因的表达（的ISG）的。一个最佳表征ISG的是RNA活化proteiÑ 激酶（PKR）23。 PKR属于真核翻译起始因子2 - α（eIF2α蛋白）激酶家族，它由N-末端的双链RNA结合域和C-末端激酶结构域。激酶结构域构成PKR的激活的二聚化界面的关键，并进行了蛋白质的催化功能。 PKR结合dsRNA病毒导致其构象变化，允许二聚化和自身磷酸化苏氨酸在446等残基中。 PKR介导再eIF2α蛋白磷酸化，从而阻断病毒的mRNA 23-27的翻译。
这两个RIG-I和PKR进行重大的结构重组，形成寡聚复合物，并翻译后磷酸化/去磷酸化和泛素化10,11,19,23,24,26-29修改。为了更好地理解其中的病毒RNA结构被激活RIG-I和PKR（以及在什么阶段病毒拮抗剂可以bë干扰），它精确地确定的激活状态是很重要的。对于这两种的PRR它先前描述的活化导致胰蛋白酶抗性蛋白片段6,17,30和更高阶低聚物6,18,19的出现。然而，由于在抗病毒宿主反应1,2,24这些关键因素的丰富文献，应用直接方法似乎比较罕见的。在刺激更广泛使用的希望，我们提供方便，灵敏协议，以稳健分析RIG-I和PKR的激活状态。干扰素主管人A549细胞感染了RIG-I和PKR，减毒裂谷热病毒突变克隆13（以Cl 13）31,32的既定激活。一个简单的裂解过程后，被感染的细胞的提取物通过有限的胰蛋白酶消化/免疫印迹分析测试，以评估构象转换，并通过蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）/蛋白质印迹analys是测量形成的低聚物。
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Protocol
1，播种A549细胞的感染
- 培养的A549细胞的T75烧瓶，在37℃和5％CO 2在细胞培养基（DMEM补充有10％FCS，526.6毫克/升L-谷氨酰胺，50.000 U /升青霉素和50毫克/升的链霉素）。
- 开始收获细胞前，热身细胞培养基，PBS和0.05％胰蛋白酶-EDTA中加热至37℃的水浴
- 除去培养基并用10ml PBS洗细胞。再次取出PBS。
- 加3毫升胰蛋白酶-EDTA，并在烧瓶中分发平分。传输烧瓶在培养箱37℃和5％CO 2。
- 当所有的细胞分离，增加7 ml的细胞培养液中，悬浮细胞，并且将细胞悬浮液转移入15ml Falcon管中。
- 离心细胞，在800×g离心5分钟，在室温，除去上清液和重悬沉淀在10毫升新鲜的细胞培养基中。
- 计数细胞计数室。
- 添加2.5×10 6细胞在5毫升细胞培养基中每两个T25烧瓶。孵育16小时，在37℃和5％CO 2。一个烧瓶提供的模拟控制，一个用于氯13的感染。
2，感染裂谷热病毒克隆13（以Cl 13）
- 注：氯13是在德国可以BSL-2的条件下进行处理的减毒病毒突变体。请参阅相关的国家指导方针。其他典型的干扰素诱导剂是仙台病毒（株Cantell）或新城疫病毒。
- 含5％FCS的预温PBS，无血清培养基和细胞培养液中。
- 制备1.25×10 7 PFU /氯13的无血清培养基毫升感染2.5×10 6个A549细胞用感染复数5（MOI）。准备一个比需要考虑若干（大约10％）更大的量移液器错误。
- 根据1.3所述，用PBS洗涤细胞。
- 加入1 ml的13氯稀释或无血清培养基（未感染的对照，模拟）到细胞中，并孵育1小时，在37℃和5％CO 2。将烧瓶仔细每隔15分钟，以确保氯13稀释和无血清培养基中均匀分布，分别为。
- 1小时感染后，除去接种物，加入5 ml预热的细胞培养基，用5％FCS，并孵育5小时，在37℃和5％CO 2。
3，制备细胞裂解液的
- 准备PBS / 0.5％的Triton X-100在4°C不要添加丝氨酸蛋白酶抑制剂。
- 用冷PBS洗涤细胞，并加入10ml新鲜的PBS中。
- 刮去细胞脱落，转移细胞悬液在一个falcon管中，并离心分离，在800×g离心5分钟，在室温。
- 去除上清，重悬细胞沉淀在30微升PBS / 0.5％的Triton X-100。转移溶解物成新的1.5毫升管孵育至少10分钟，在4℃下
- 离心裂解物10.000×g下在4℃下10分钟，将澄清的细胞裂解液（上清液）转移到新的管中。
- 通过Bradford法测定蛋白浓度如别处33所述。
- 储存在-20°C或进行胰蛋白酶消化（4.1）或变性PAGE（5.1）。
4，测定的模式识别受体构象变化的
- 细胞裂解液的TPCK-胰蛋白酶处理
- 稀释L-1-tosylamido -2 - 苯基乙基氯甲基酮处理（TPCK）胰蛋白酶的PBS中至最终工作的2微克/微升的浓度。
- 调整两个新管中的最终蛋白质25微克每蛋白裂解液（模拟或Cl 13）中的9微升用PBS的终体积浓度。因此，它应该是四根管与各25微克的溶胞产物，2次模拟和2倍氯13感染。一个设置为输入控制（未处理）和一组与TPCK-胰蛋白酶处理。
- 加入1μl的PBS（未处理）或1微升的2微克/微升TPCK-胰蛋白酶（终浓度为0.2微克/微升）的细胞裂解物，并通过移液混合的反应。不冻结和解冻TPCK-胰蛋白酶等分，因为它会影响消化的效率。
- 孵育的裂解液在37℃下25分钟。停止反应，加入5×变性样品缓冲液（250mM的Tris-盐酸pH为6.8，10％SDS，50％甘油，25％β-巯基乙醇，0.5％溴酚蓝）并通过5分钟，在95℃下沸腾它不延长胰蛋白酶孵育时间是很重要的。在任何情况下，抗蛋白酶片段检测，胰酶消化的时间必须缩短。
- 煮沸后，该样品可以贮存于-20℃。
- SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和Western印迹
- 加载样品上的十二烷基硫酸钠含有5％堆积在12％分离胶（SDS）聚丙烯酰胺凝胶。分离蛋白质，每凝胶25毫安直到对溴酚蓝用完。
- 激活一聚偏氟乙烯（PVDF）膜，持续30秒，用甲醇，放入转移缓冲液（48毫摩尔Tris，39 mM的甘氨酸，1.3 mM的SDS，20％甲醇）。
- 制备的印迹用半干印迹系统和允许蛋白质在10 V转移1小时。就拿膜出来，用水简单地冲洗，并让它干燥。
- 通过不久转移到甲醇中重新激活该膜。洗5分钟，用TBS。用10％脱脂牛奶的TBS为1小时，在室温或4℃的CO / N方框洗膜3次为每个用TBS 5分钟。
- 制备抗体稀释液的建议，在表1和孵育膜1小时，在室温或4℃的CO / N。
- 洗膜3次为每个用TBS-T 10分钟。加偶联有辣根过氧化物酶在1:20,000稀释在1％脱脂牛奶的TBS适当的二级抗体。孵育45分钟，在RT。
- 洗膜3次为每个用TBS-T 10分钟，和邻NE更多的时间用TBS。
- 用于信号检测使用商业化学发光试剂盒和数字凝胶成像系统。
- 考马斯亮蓝G-250染色
- 如在4.2.1中所述进行SDS-PAGE电泳。在SDS聚丙烯酰胺凝胶负载的样品，并在每个凝胶25毫安运行凝胶，直到溴酚蓝用完。
- 在RT下进行考马斯亮蓝G-250染色。做下不断晃动的所有孵化。
- 将凝胶转移到含有40％甲醇和10％乙酸中30分钟固定的解决方案。
- 交换缓冲至脱色液（25％乙醇和8％乙酸）并孵育5分钟。
- 染色的凝胶用0.2％考马斯亮蓝G-250在40％的甲醇和10％乙酸1小时。
- 脱色的凝胶用脱色液和10分钟，30分钟和60分钟后，更换缓冲液。
- 存储该凝胶在25％乙醇，8％醋酸，4％甘油，在4°C。 根据4.2.8所述进行成像和分析。
低聚国家模式识别受体5。分析
- 天然PAGE
- 制备50微克细胞裂解物中的10微升的PBS使终体积，并添加5×原生样品缓冲液（250mM的Tris-盐酸的pH 6.8，1％脱氧胆酸钠，50％甘油，0.5％溴酚蓝）至终浓度1X。
- 装入样品立即在原生聚丙烯酰胺凝胶用5％的堆放和8％的分离胶。任何延误将导致本地络合物34的损失。
- 用50mM的Tris-氢氧化钠pH值为9.0，384 mM的甘氨酸运行的凝胶以每凝胶20毫安在4℃下以作为阳极和50mM的Tris pH值8.3，384 mM的甘氨酸，1％脱氧胆酸钠作为阴极缓冲。后1.5-2小时（溴酚蓝乐队已经离开了凝胶约45分钟更早）电泳结束。
- 蛋白质印迹
- 激活polyvinylidene氟乙烯（PVDF）膜，持续30秒，用甲醇，放入Towbin等缓冲液（25mM的Tris，192 mM的甘氨酸，0.1％SDS，20％甲醇）。
- 根据制造商的说明组装的湿印迹腔和填充罐致远缓冲区。
- 250毫安1.5小时，在4℃下进行杂交
- 当杂交完成后请按从4.2.3中所述的。
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Representative Results
病毒受体激动剂通过RIG-I或PKR的识别触发构象开关6,17,30和齐聚6,18,27。 ，我们检测这两种活化标志物由有限蛋白酶消化和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分别。
人类A549细胞被感染裂谷热病毒克隆13（以Cl 13），其特征在于，干扰素拮抗剂奈米35,36的突变。由于缺乏功能性奈米球，克隆13强诱导RIG-I和PKR，导致细胞12,31,32,37建立一个强大的抗病毒状态。
胰蛋白酶消化的模拟感染的细胞裂解物的结果在RIG-I的快速降解，而氯13感染导致一个30kDa的耐RIG-I片段图1A的生成。还PKR显示受感染的样本，这与其phosph恰逢中胰蛋白酶消化部分抗性过磷酸化图1A中 。以监测效率和特异性的胰蛋白酶消化的，凝胶用考马斯亮蓝G-250。未经处理的样品显示加载的蛋白质图1B等量。遭受嘲笑和Cl 13细胞裂解液中胰蛋白酶消化导致了全球性的蛋白量同比减少。这表明，胰蛋白酶处理具有相同的效率为模拟和Cl 13-感染的样本。
寡聚复合物的形成是通过测定天然PAGE。在未被感染的细胞，RIG-I与PKR的唯一单体，检测图2，作为附加的控制我们包括转录因子IRF-3，这是目前作为单体，但已知通过例如 RIG-I 38二聚化激活时。 CL 13感染导致的RIG-I寡聚物的PKR和IRF-3二聚体/低聚物作为一个定义的蛋白条带的涂片和形式的深厚积累。
图1。RIG-I和PKR的构象开关。A549细胞分别模拟感染或在5的MOI感染与Cl 13。5小时后，裂解细胞，在PBS中补充有0.5％的Triton X-100和清除细胞裂解物要么不治疗或者用胰蛋白酶处理。样品进行SDS-PAGE随后通过Western印迹法（A）或考马斯染色（B）。印迹染色对RIG-I，PKR，磷酸化PKR（苏氨酸446）和反对RVFV核蛋白（RVFV N）和β-肌动蛋白作为感染和装载控制，分别。_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
图2。齐聚RIG-I，PKR，而IRF-3的模拟和Cl 13-感染的细胞裂解液将细胞裂解物进行变性PAGE随后通过Western印迹分析。用抗RIG-I，PKR，IRF-3和β-肌动蛋白作为上样对照进行染色。 PKR寡聚体最有可能代表二聚体27。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
感病毒的存在和活化的抗病毒I型IFN系统是成功的先天免疫反应22是至关重要的。病毒检测是由病原体识别受体（模式识别受体），如RIG-I和PKR介导的，从而，实现了快速反应和激活抗病毒防御机制。在这里，我们描述了两种方法来直接评估RIG-I和PKR的激活状态。
有限公司蛋白酶消化作为一种工具来监控RIG-I和PKR首次由M.大风小和T.藤田6,17，和JL科尔30，分别的群体中描述的构象变化。它代表了一种灵敏的方法来改变灵敏度的计算结果所造成的构象变化胰蛋白酶处理。采用胰蛋白酶消化，我们发现RIG-I和PKR的模拟感染的样品中迅速降解，而胰蛋白酶处理的病毒感染的细胞裂解物导致胰蛋白酶抗性RIG-I片段。 SIMIL阿尔利，胰蛋白酶抗性PKR片段后，氯13感染检测。这是伴随着PKR的磷酸化苏氨酸在446，PKR激活一种广泛使用的标记。比较模拟和Cl 13细胞裂解液进行考马斯染色胰蛋白酶消化演示全球蛋白水平的可比性下降。这表明形成抗性片段的特异于像RIG-I和PKR的蛋白质。
的RIG-I，PKR和IRF-3的低聚复合物的形成是通过非变性PAGE监视。遭受氯13感染的细胞裂解液，以天然PAGE，我们发现RIG-I，PKR和IRF-3的低聚物，而这些蛋白仍然是模拟感染样本中单体。 RIG-I需要形成低聚物，激活下游途径。据推测，RIG-I齐聚支持招聘的辅助因子，形成一个信令平台，为抗病毒反应的机制11。 PKR二聚化的功能尚未完全了解。最有可能的，在PK在二聚体ř亚基磷酸对方25。 I型IFN的类型系统是被严格调控的转录水平，和IRF-3代表了IFN和38的ISG的诱导1中央的转录因子。活化的中央标志是磷酸化，二聚化，并易位至细胞核，在那里它募集转录共活化剂P300和CREB结合蛋白（CBP）来启动干扰素mRNA合成21,39。的IRF-3二聚化分析是一种广泛使用的工具来监测激活的类型的I型IFN反应38。因此，我们使用的IRF-3的低聚复合物的检测作为原则为RIG-I和PKR的低聚的低聚合实验的证明。的确，允许非变性条件下的蛋白质裂解物的分离，我们能够检测到IRF-3二聚化在含Cl 13感染的样本。
毫无疑问，每个实验室将需要优化有限蛋白酶DIGE的协议美商Stion和天然PAGE。如果面对没有检测任何抗性的蛋白质或太多抗性片段的，人们可能缩短或延长消化的时间，分别为。差异也可以是由于特定的TPCK-胰蛋白酶库存中，作为制剂略有不同。因此，各种TPCK-胰蛋白酶浓度应进行优化测试。细胞裂解液可以从其他细胞系比A549有所准备，但可能需要在协议的修改。因此建议根据在此特定的细胞类型感兴趣的蛋白质的表达水平来调节总蛋白的量为胰蛋白酶消化和非变性PAGE。此外，有限的检测或寡聚物由天然PAGE的弱分离可以有几个原因，可以作为处理如下：确保该设备清洗，以去除残留变性剂，保持页面中的所有样品和凝胶在4℃ ，也不要延长样品制备和LOA之间的时间丁到凝胶中。有限蛋白酶消化和非变性PAGE也已经被监视的另一个重要的密切相关的PRR，MDA5 40-42活化。 MDA5激活的监测需要相比，RIG-I和PKR的不同实验条件下，并因此不包括在这里。
综上所述，逐点协议的两个有用的和敏感的方法来衡量激活RIG-I和PKR的介绍。有限蛋白酶消化和天然PAGE，既耦合到Western blot分析，构象变化和齐聚许可证监测，分别。使用这些方法，我们曾表明，RIG-I，可以由各种病毒核衣壳后，他们直接进入细胞32激活。
相关的RIG-I和PKR在感染的细胞活化的RNA种类的确切性质和起源仍然没有完全解决。此外，许多病毒干扰的PRR的由各种策略12,43-46的功能。所提出的技术的放大方法的频谱通过允许容易和直接测量RIG-I和PKR的激活，是快速执行，并且不需要昂贵的设备。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢亚历杭德罗·布伦来自中钢协，老龄研究所提供的抗裂谷热病毒血清。在我们的实验室工作是由Forschungsförderung宝石的支持。 §2绝对值。 3 KooperationsvertragUniversitätsklinikum吉森UND马尔堡，莱布尼茨研究生院新生病毒性疾病（EIDIS），东风集团Sonderforschungsbereich（SFB）1021和东风集团Schwerpunktprogramm（SPP）1596。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| Antibodies | |||
| Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS |
| Rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA | WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS | |
| Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
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