Summary
הגנה מולדת לנגיף מופעלות על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs). שני PRRs cytoplasmic RIG-I ו לאגד PKR כדי RNAs הנגיפי החתימה, שינוי קונפורמציה, oligomerize, ולהפעיל את איתות אנטי. שיטות מתוארות המאפשרות לפקח על מיתוג קונפורמציה וoligomerization של PRRs cytoplasmic אלה בנוחות.
Abstract
הגנה מארחת לזיהום בנגיף תלוי באיתור מהיר על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) של מערכת החיסון המולדת. בציטופלסמה, PRRs RIG-I ו לאגד PKR לליגנד רנ"א הנגיפי הספציפי. זה מתווך ראשון מיתוג וoligomerization קונפורמציה, ולאחר מכן מאפשר הפעלה של תגובת אינטרפרון אנטי. בעוד שיטות כדי למדוד ביטוי גני מארח נגיפים מבוססות היטב, שיטות לניטור ישירות מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR הן רק באופן חלקי ופחות מבוססות היטב.
כאן, אנו מתארים שתי שיטות לניטור RIG-I ו PKR גירוי על זיהום עם inducer הוקמה אינטרפרון, נגיף קדחת בקעת שיבוט מוטציה 13 (Cl 13). עיכול טריפסין מוגבל מאפשר לנתח שינויים ברגישות פרוטאז, המצביע על שינויי קונפורמציה של PRRs. עיכול טריפסין של lysates מתוצאות תאים נגועים מדומה בהידרדרות מהירה של RIG-I ו PKR, whereaזיהום של Cl 13 מוביל להופעתה של פרוטאז עמיד RIG-שבר. גם PKR מראה התנגדות חלקית מושרה וירוס לעיכול טריפסין, אשר עולה בקנה אחד עם זירחון סימן ההיכר שלה בThr 446. היווצרות RIG-I ו oligomers PKR היה תוקף על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד). עם הזיהום, יש הצטברות חזקה של RIG-I ו מתחמי oligomeric PKR, ואילו חלבונים אלה נותרו כמונומרים בדגימות נגועות מדומה.
עיכול מוגבל פרוטאז ועמוד מקורי, שניהם יחד לניתוח כתם מערבי, מאפשרים מדידה רגישה וישירה של שני שלבים שונים של RIG-I ו הפעלת PKR. טכניקות אלה קלות ומהיר יחסית לביצוע ואינו דורשות ציוד יקר.
Introduction
אירוע מכריע בהגנת מארחת נגיפים הוא האיתור המהיר של הפתוגן על ידי קולטנים שנקרא זיהוי תבניות (PRRs) 1,2. איתור תאיים של זיהום בנגיף RNA תלוי בשני helicases cytoplasmic RNA, RIG-I (אני גן מושרה חומצה רטינואית) וMDA5 (חלבון בידול מלנומה קשור 5) 3-5. RIG-מורכב משני תחומים N-מסוף גיוס caspase (כרטיסים), תחום helicase RNA סוג DECH התיבה מרכזי, ותחום בטרמינל C-(CTD) 4,6. ואילו CTD ותחום helicase נדרשים להכרה של RNAs אינו עצמי (ויראלי), הכרטיסים לתווך איתות במורד הזרם שתוביל להקמת מעמד מארח אנטי.
אם RIG-אני נמצא במצב השקט, כלומר בהיעדר ליגנד RNA ספציפי, הכרטיס השני אינטראקציה עם תחום helicase המרכזי ושומר RIG-I בקונפורמציה אוטומטית מעכבת 7-11. RIG-I נקשר קצר כפולגדיל RNA (DS) נושאות 5'-טריפוספט (5'PPP), dsRNA הארוך, ו-RNA PolyU / UC-עשיר, מבני חתימה קלאסיים אשר נמצאים בגנומים של וירוסי RNA רבים 12-16. שני מאפיינים עיקריים של RIG-I הפעלה הם מעבר לקונפורמציה סגורה 6,17 וההומו-oligomerization 6,18,19. מתג קונפורמציה משפר RNA מחייב, חושף את הקלפים לאיתות במורד הזרם, וreconstitutes אתר ATPase פעיל 8,9,11,20. היווצרות של קומפלקסי RIG-I oligomeric מובילה לגיוס מוגבר של מולקולות איתות במורד הזרם מתאם כדי ליצור פלטפורמה להעברת אותות אנטי 11. שרשרת האיתות המוסדרת RIG-סופו של דבר מפעילה את גורם שעתוק IRF-3 לעד ויסות של אינטרפרון גנים (IFN-alpha/beta) ומכאן ביטוי גנים של גנים אינטרפרון מגורה (ISGs) לתגובה אנטי מלאה 21,22 . אחד ISGs המאופיין ביותר הוא protei מופעל RNAקינאז n (PKR) 23. PKR שייך למשפחה של ייזום תרגום גורם 2 אלפא אוקריוטים קינאז (eIF2α) והוא מורכב מתחום N-מסוף פעמיים תקוע RNA מחייב ותחום קינאז C-מסוף. תחום קינאז מהווה ממשק dimerization חיוני להפעלת PKR ומבצע את הפונקציות הקטליטית של החלבון. עקידת PKR לdsRNA הנגיפי מובילה לשינוי קונפורמציה התרת dimerization והאוטומטי זירחון בThr 446 בין שאריות אחרות. PKR אז מתווך זירחון של eIF2α, ובכך חוסם את התרגום של mRNAs הנגיפי 23-27.
שני RIG-I ו PKR לעבור שחלופים מבניים גדולים, יצירת קומפלקסי oligomeric והם פוסט translationally שונה על ידי זירחון / dephosphorylation וubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. להבנה טובה יותר של מבנים שרנ"א נגיפיים מפעילים RIG-I ו PKR (ובאיזה שלב יריבים נגיפיים יכולים bדואר להתערב), חשוב על מנת לקבוע את מצב ההפעלה בדיוק. עבור שניהם PRRs שתואר בעבר על כך שהפעיל גורם להופעתה של שברי טריפסין עמיד חלבון 6,17,30 וoligomers מסדר גבוה 6,18,19. עם זאת, בהתחשב בעושר של ספרות על גורמי מפתח אלה של תגובת המארח אנטי 1,2,24, יישום של שיטות ישירות נראה יחסית נדיר. בתקווה להגביר את השימוש רחב יותר, אנו מספקים פרוטוקולים נוחים ורגישים כדי לנתח וחסונה מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR. A549 שורת תאים אנושי המוסמך IFN נגוע בactivator הוקם RIG-I ו PKR, שיבוט נגיף קדחת עמק השבר נחלש המוטציה 13 (13 Cl) 31,32. לאחר הליך lysing פשוט, תמציות של תאים נגועים נבדקות על ידי עיכול / ניתוח כתם מוגבל טריפסין מערבי להעריך מיתוג קונפורמציה, ועל ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים הכחול (עמוד) / analys כתם המערביהוא למדוד היווצרות oligomers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זריעה של תאי A549 לזיהום
- טפח את בקבוק T75 של תאי A549 על 37 ° C ו 5% CO 2 בתרבית תאים בינונית (DMEM בתוספת FCS 10%, L-גלוטמין 526.6 מ"ג / ליטר, 50.000 פניצילין U / ליטר, ו50 סטרפטומיצין מ"ג / ליטר).
- לפני שמתחיל לקצור את התאים, לחמם את המדיום סלולרי תרבות, PBS ו0.05% טריפסין-EDTA בwaterbath מחומם ל37 ° C.
- הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. הסר את PBS שוב.
- הוסף 3 מיליליטר של טריפסין-EDTA ולהפיץ באופן שווה בבקבוק. מעביר את הבקבוק באינקובטור עם 37 ° C ו 5% CO 2.
- כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 7 מיליליטר של מדיום תרבות תא, resuspend התאים, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר.
- צנטריפוגה התאים ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טרי.
- ספירת התאים עם חדר ספירה.
- הוסף 2.5 x 10 6 תאים ב 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא בשתי צלוחיות T25 כל אחד. דגירה של 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. בקבוק אחד משמש לשליטה מדומה ואחד לזיהום Cl 13.
2. זיהום עם Clone וירוס בקעת קדחת 13 (13 Cl)
- הערה: 13 Cl הוא מוטציה נגיף מוחלשת שבגרמניה יכול להיות מטופלים תחת BSL-2 תנאים. אנא עיין בכללים לאומיים רלוונטיים. מעוררי IFN אופייניים אחרים יהיו וירוס סנדאי (זן Cantell) או וירוס מחלת ניוקאסל.
- , בינוני סרום ללא טרום חם PBS, ומדיום תרבית תאים המכיל FCS 5%.
- הכן 1.25 x 10 7 PFU / מיליליטר של 13 Cl במדיום סרום ללא להדביק 2.5 x 10 6 תאי A549 עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5. הכן כמות מעט (בערך 10%) גדולה יותר מהדרוש כדי להסביר שגיאות פיפטה.
- לשטוף את התאים עם PBS כמתואר תחת 1.3.
- הוסף 1 מיליליטר של דילול Cl 13 אושל מדיום סרום ללא (שליטה נגוע, מדומה) לתאים, ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2. הזז את הבקבוק בזהירות כל 15 דקות כדי להבטיח חלוקה שווה של Cl 13 דילול ובינוני סרום ללא, בהתאמה.
- אחרי שעה 1 של זיהום, להסיר את inocula, מוסיף 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא מחומם מראש עם FCS 5%, ו דגירה במשך 5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.
3. הכנת lysates התא
- הכן PBS / 0.5% טריטון X-100 ב 4 ° C. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז סרין.
- לשטוף את התאים עם PBS הקר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS הטרי.
- לגרד את התאים כבויים, להעביר את ההשעיה התא בצינור בז, ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 30 PBS / 0.5% טריטון X-100. העבר את lysate לתוך צינור מיליליטר טרי 1.5 ודגירה של לפחות 10 דקות ב 4 ° C.
- צנטריפוגה lysate ב10.000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את lysate הבהיר התא (supernatant) לתוך צינור טרי.
- קביעת ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד כמתואר במקום אחר 33.
- חנות ב -20 ° C או להמשיך לעיכול טריפסין (4.1) או עמוד ילידים (5.1).
4. קביעת קונפורמציה השינויים של זיהוי התבניות רצפטורים
- טיפול TPCK-טריפסין של lysates התא
- לדלל טריפסין L-1-tosylamido-2-phenylethyl טופלו קטון chloromethyl (TPCK) ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 מיקרוגרם / μl.
- התאם בשני צינורות חדשים ריכוז חלבון סופי של 25 מיקרוגרם של כל lysate חלבון (מדומה או 13 Cl) בנפח סופי של μl 9 עם PBS. לכן, זה צריך להיות ארבעה צינורות עם 25 lysate מיקרוגרם כל אחת, שתי פעמים מדומה ושתי פעמים Cl זיהום 13. אחד מוגדר כשליטת קלט (ללא טיפול) וקבוצה אחת לטיפול בTPCK-טריפסין.
- הוסף 1 μl של PBS (ללא טיפול)או 1 μl של 2 מיקרוגרם / μl TPCK-טריפסין (ריכוז סופי: 0.2 מיקרוגרם / μl) לlysates התא ומערבבים את התגובות על ידי pipetting. לא להקפיא ולהפשיר aliquots TPCK-טריפסין, כי זה יפגע ביעילות של מערכת העיכול.
- דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5x denaturing חיץ מדגם (250 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 10% SDS, גליצרול 50%, 25% β-mercaptoethanol, bromphenol 0.5% הכחולים) ועל ידי רתחה במשך 5 דקות ב95 ° C. חשוב לא להאריך את זמן הדגירה טריפסין. במקרה לא שברי פרוטאז עמיד הם לגילוי, הזמן של עיכול טריפסין חייב להתקצר.
- לאחר הרתיחה, ניתן לאחסן הדגימות ב-20 ° C.
- SDS polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) ומערבי סופג
- טען את הדגימות על נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ג'ל polyacrylamide המכיל לערום 5% מעל 12% ג'ל פתרון. הפרד את החלבונים ב25 mA לג'ל עדbromphenol הכחול שנגמר.
- הפעל קרום polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך חיץ העברה (48 מ"מ טריס, 39 מ"מ glycin, 1.3 מ"מ SDS, מתנול 20%).
- הכן את סופג עם מערכת סופג semidry ולאפשר העברת החלבונים ב10 V במשך שעה 1. קח את הממברנה החוצה, לשטוף אותו לזמן קצר במים, ולתת לו להתייבש.
- הפעל מחדש את הקרום על ידי זמן קצר העברה למתנול. שטוף למשך 5 דקות עם TBS. לחסום עם 10% חלב דל שומן בכפות עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ לשטוף 3x הקרום במשך 5 דקות כל אחד עם TBS.
- הכן דילול נוגדן כפי שהומלץ בטבלה 1 ו דגירה הקרום עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ
- לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T. מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים בשילוב עם חזרת peroxidase בדילול 1:20,000 ב1% חלב דל שומן בכפות. דגירה 45 דקות ב RT.
- לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T, וoזמן נוסף ne עם TBS.
- לזיהוי אות להשתמש במערכת הדמיה דיגיטלית ג'ל ערכת chemiluminescense מסחרית ו.
- כתמים כחולי G-250 מבריקים Coomassie
- בצע-SDS כמתואר ב4.2.1. דגימות עומס על ג'ל polyacrylamide SDS ולהפעיל את הג'ל על 25 mA לג'ל עד bromphenol הכחול שנגמר.
- לבצע מכתים הכחול G-250 מבריק Coomassie ב RT. האם כל incubations תחת טלטול מתמיד.
- העבר את הג'ל לפתרון הקיבעון המכיל מתנול 40% ו10% חומצה אצטית ל30 דקות.
- להחליף את החיץ לפתרון destaining (25% אתנול ו -8% חומצה אצטית) ודגירה של 5 דקות.
- כתם ג'ל עם 0.2% Coomassie Brillant Blue-G-250 במתנול 40% וחומצה אצטית 10% במשך שעה 1.
- Destain ג'ל עם פתרון destaining ולהחליף את החיץ לאחר 10 דקות, 30 דקות, ו60 דקות.
- אחסן את הג'ל ב25% אתנול, 8% חומצה אצטית, וגליצרול 4% ב 4 ° C. לבצע הדמיה וניתוח כפי שתואר תחת 4.2.8.
5. ניתוח Oligomeric הברית של זיהוי התבניות רצפטורים
- עמוד Native
- הכן 50 מיקרוגרם של lysate תא בנפח סופי של μl 10 עם PBS ולהוסיף 5 × חיץ האם של מדגם (250 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 1% deoxycholate נתרן, גליצרול 50%, bromphenol 0.5% הכחולים) לריכוז סופי של 1x.
- טען את הדגימות באופן מיידי על ג'ל polyacrylamide יליד עם 5% כלערום ו -8% כפתרון ג'ל. כל עיכוב יגרום לאובדן של קומפלקסי ילידים 34.
- הרץ את הג'ל על 20 mA לג'ל על 4 מעלות צלזיוס עם 50 מ"מ טריס-NaOH pH 9.0, 384 מ"מ glycin כמו האנודה ו50 מ"מ טריס pH 8.3, 384 מ"מ glycin, 1% deoxycholate נתרן כחיץ קתודה. לאחר 1.5-2 שעה (להקה הכחולה bromphenol הותירה את הג'ל כ 45 דקות קודם לכן) אלקטרופורזה הוא סיים.
- סופג מערבי
- הפעל polyvinylidene פלואוריד קרום (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך מאגר טובין (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ glycin, 0.1% SDS, מתנול 20%).
- להרכיב קאמרי כתם רטוב על פי הוראות היצרן ולמלא את המכל עם חיץ Towin.
- בצע הסופג עם 250 mA ל1.5 שעות ב 4 ° C.
- כשהסופג הוא סיים המשך כמתואר מ4.2.3 הלאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכרה באגוניסט ויראלי ידי RIG-I או PKR מפעיל מיתוג קונפורמציה 6,17,30 וoligomerization 6,18,27. אנו assayed שני סמני הפעלה אלה על ידי עיכול פרוטאז מוגבל וג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד), בהתאמה.
תאי A549 אדם היו נגועים בנגיף קדחת שיבוט בקעת 13 (Cl 13), אשר מאופיין על ידי מוטציה של אנטגוניסט IFN NSS 35,36. בשל העדרו של NSS הפונקציונלי, 13 Clone חזק גורם RIG-I ו PKR, שהוביל להקמתה של מדינה אנטי חזקה בתאים 12,31,32,37.
עיכול טריפסין של תוצאות lysates התא נגועות מדומה בהידרדרות מהירה של RIG-I, ואילו Cl 13 זיהום מוביל לדור של איור 1 א שבר RIG-I 30 kDa עמיד. גם PKR מראה התנגדות חלקית לעיכול טריפסין בדגימות נגועות, אשר עולה בקנה אחד עם phosph איור 1 א orylation. כדי לפקח על יעילות וסגוליות של מערכת העיכול טריפסין, ג'לים הוכתמו Coomassie הכחול G-250 מבריקים. דגימות שלא טופלו להראות כמויות שווה של חלבונים טעונים איור 1 ב. הכפפת lysates תא המדומה וCl 13 לעיכול טריפסין מוביל לירידה דומה של כמויות חלבון הגלובליות. זה מוכיח שיש לו טיפול טריפסין היעילות זהה לדגימות 13 נגועים מדומה וCl.
היווצרות של קומפלקסי oligomeric הייתה assayed ידי עמוד ילידים. בתאים נגוע, רק מונומרים של RIG-I ו PKR התגלו איור 2. כבקרה נוספת שכללנו את גורם שעתוק IRF-3, אשר שוהה כמונומר אבל ידוע dimerize עם הפעלה באמצעות דוגמה: RIG-I 38. Cl 13 זיהום מוביל להצטברות חזקה של מתחמי oligomeric RIG-I בצורה של הכפשות ושל PKR וIRF-3 הדימרים / oligomers כלהקת חלבון מוגדר.
class = "jove_content"> תוצאות אלו מראות כי עיכול טריפסין מוגבל ועמוד האם הם כלי שימושיים כדי לעקוב אחר שינויי קונפורמציה והיווצרות oligomer של RIG-I ו PKR על זיהום.
איור 1. מתג קונפורמציה של RIG-I ו PKR. תאי A549 היו מדומים נגועים או נגוע ב13 Cl במשרד הפנים של 5. אחרי 5 שעות, תאים היו lysed בPBS בתוספת 0.5% טריטון X-100 ופיניתי lysates תא היו גם אינו מטופל או שטופלו בטריפסין. דגימות היו נתונים לעמוד SDS ואחריו המערב סופג () או מכתים Coomassie (ב '). כתמים הוכתמו נגד RIG-I, PKR, PKR פוספורילציה (Thr 446) ונגד nucleoprotein RVFV (RVFV N) ובטא אקטין זיהום ובקרת טעינה, בהתאמה._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Oligomerization של RIG-I, PKR, וIRF-3. Lysates הסלולרי של lysates תא 13 הנגוע המדומה וCl היו נתונים לעמוד מקורי ואחרי ניתוח כתם מערבי. צביעה בוצעה עם נוגדנים כנגד RIG-I, PKR, IRF-3, ובטאו אקטין בקרת טעינה. oligomers PKR הסביר ביותר לייצג הדימרים 27. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חישה נוכחותם של וירוסים והפעלה של הסוג אנטי אני IFN מערכת חיוני לתגובה חיסונית מולדת מוצלחת 22. זיהוי וירוסים הוא בתיווך ובכך על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs) כמו RIG-I ו PKR, ומאפשר תגובה והפעלה של מנגנוני הגנה אנטי מהירים. כאן, אנו מתארים שתי שיטות על מנת להעריך את מצב ההפעלה של RIG-I ו PKR ישירות.
עיכול פרוטאז מוגבל ככלי לניטור שינויי קונפורמציה של RIG-I ו PKR תואר לראשונה על ידי הקבוצות של מ 'גייל ג'וניור וט פוג'יטה 6,17, וJL 30 קול, בהתאמה. הוא מייצג שיטה רגישה כדי להעריך שינויי רגישות לטיפול טריפסין הנגרם על ידי שינויי קונפורמציה. החלת עיכול טריפסין, זיהינו הידרדרות מהירה של RIG-I ו PKR בדגימות נגועות מדומה, ואילו טיפול בטריפסין של lysates תא נגוע בנגיף הוביל לטריפסין ברי RIG-I עמידים. SimilArly, שבר PKR עמיד טריפסין זוהה על Cl 13 זיהום. זו לוותה בזירחון PKR ב446 Thr, סמן בשימוש נרחב של הפעלת PKR. השוואת עיכול טריפסין של lysates תא 13 המדומה וCl ידי מכתים Coomassie מדגימה ירידה דומה של רמות חלבון הגלובליות. זה מצביע על כך היווצרות של שברים עמידים היא ספציפית לחלבונים כמו RIG-I ו PKR.
היווצרות של קומפלקסי oligomeric של RIG-I, וPKR IRF-3 הייתה פיקוח על ידי עמוד ילידים. הכפפת lysates תא 13 הנגוע Cl לעמוד מקורי, זיהינו RIG-I, וPKR IRF-3 oligomers, בעוד שחלבונים אלה נותרו כמונומרים בדגימות נגועות מדומה. RIG-אני צריך כדי ליצור oligomers להפעיל מסלולים במורד הזרם. זה היה שיערו כי RIG-I oligomerization תומך גיוס cofactors כדי ליצור פלטפורמת איתות למנגנוני תגובה אנטי 11. הפונקציה של dimerization PKR אינה מובנת לחלוטין. סביר להניח, PKיחידות משנה R בדימר phosphorylate כל 25 אחרים. הסוג אני IFN מערכת מוסדר היטב ברמה תעתיק, וIRF-3 מייצג גורם שעתוק מרכזי אחד לאינדוקציה של IFN וISGs 38. סימני ההיכר מרכזי של הפעלה הם זירחון, dimerization, וטרנסלוקציה לגרעין, שם הוא מגייס P300 שיתוף מפעילים וחלבון קושר CREB (CBP) תעתיק ליזום סינתזת IFN-mRNA 21,39. ניתוח של IRF-3 dimerization הוא כלי המשמש באופן נרחב כדי לפקח על ההפעלה של הסוג אני IFN תגובה 38. לכן, השתמשנו בזיהוי של IRF-3 מתחמי oligomeric כהוכחת עיקרון של מבחני oligomerization של RIG-I ו oligomerization PKR. ואכן, המאפשר הפרדת lysates חלבון בתנאים שאינם denaturing, היינו מסוגל לזהות IRF-3 dimerization בCl 13 דגימות נגועות.
אין ספק, כל מעבדה צריכה לייעל את הפרוטוקולים של DIGE פרוטאז המוגבלstion ועמוד ילידים. אם נתקל בשום גילוי של כל חלבונים עמידים או יותר מדי שברים עמידים, אפשר לקצר או להאריך את הזמן של עיכול, בהתאמה. הבדלים יכולים להיות גם בשל מניית TPCK-טריפסין הספציפי, כהיערכות מעט שונה. לכן, ריכוזי TPCK-טריפסין שונים צריכים להיבדק לאופטימיזציה. ניתן להכין lysates תא משורות תאים אחרים מאשר A549, אבל עיבודים של הפרוטוקול ייתכן שיידרשו. מומלץ להתאים את כמות חלבונים הכולל לעיכול טריפסין ועמוד האם בהתאם לרמת הביטוי של החלבון של עניין בסוג התא הספציפי הזה. יתר על כן, איתור מוגבל או הפרדה חלשה של מתחמי oligomeric ידי עמוד האם יכול להיות מספר סיבות וניתן לטפל אחריו כמו: לוודא כי הציוד הוא ניקה להסיר סוכני denaturing שנותרו, לשמור את כל הדגימות וג'ל בעמוד ב 4 ° C , ולא להאריך את הזמן בין הכנת המדגם וואהדינג על ג'ל. עיכול פרוטאז מוגבל ועמוד יליד גם להיות מועסק כדי לפקח על ההפעלה של עוד PRR החשוב, קשור באופן הדוק, MDA5 40-42. ניטור של הפעלת MDA5 תנאי ניסוי שונים בהשוואה לRIG-I ו PKR, ולכן לא נכלל כאן.
לסיכום, פרוטוקולי נקודה אחר נקודה לשתי שיטות שימושיות ורגישות למדידת הפעלה של RIG-I ו PKR מוצגים. עיכול מוגבל פרוטאז ועמוד מקורי, שניהם יחד לניתוח מערבי כתם, ניטור היתר שינויים וoligomerization קונפורמציה, בהתאמה. שימוש בשיטות אלה, אנו הראו בעבר כי RIG-אני יכול להיות מופעל על ידי nucleocapsids של וירוסים שונים מייד לאחר כניסתם לתאים 32.
הטבע ומקורו המדויקים של מיני RNA הרלוונטיים לRIG-I ו PKR הפעלה בתאים נגועים עדיין לא נפתרו לחלוטין. יתר על כן, וירוסים רבים להפריעהפונקציות של PRRs על ידי מגוון רחב של אסטרטגיות 12,43-46. הטכניקות שהוצגו להגדיל את הספקטרום של שיטות שמאפשר מדידה קלה וישירה של RIG-I ו הפעלת PKR, ממהרות לבצע, ואינן דורשות ציוד יקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לאלחנדרו ברון מCISA-INIA למתן סרה נגיף קדחת העמק נגד הבקעה. עבודה במעבדות שלנו נתמכת על ידי פנינת Forschungsförderung. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum גיסן und מרבורג, בית הספר למוסמכים לייבניץ למחלות ויראליות מתעוררים (EIDIS), Sonderforschungsbereich DFG (SFB) 1021, וSchwerpunktprogramm DFG (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| Antibodies | |||
| Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS |
| Rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA | WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS | |
| Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H.
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
