Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE

Published: July 29, 2014 doi: 10.3791/51415
Automatic Translation
1, 1
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

Summary

Aangeboren afweer tegen virus infecties worden veroorzaakt door patroonherkenning receptoren (PRRS). De twee cytoplasmatische PRRs RIG-I en PKR binden aan virale handtekening RNA's, verandering conformatie, oligomeriseren, en activeer antivirale signalering. Werkwijzen worden beschreven die laten gemakkelijk controleren conformationele schakelen en de oligomerisatie van deze cytoplasmatische PRRS.

Abstract

De afweer van virus infectie zijn afhankelijk van een snelle detectie van patroonherkenning receptoren (PRRS) van het aangeboren immuunsysteem. In het cytoplasma, het PRRS RIG-I en PKR binden aan specifieke virale RNA-liganden. Deze eerste bemiddelt conformationele schakelen en oligomerisatie, en voorziet activering van een interferon antivirale respons. Terwijl methoden om antivirale gastheer genexpressie te meten zijn goed ingeburgerd, methoden om de activering staten van RIG-I en PKR direct monitoren zijn slechts gedeeltelijk en minder goed ontwikkeld.

Hier beschrijven we twee methoden om RIG-I en PKR stimulatie na infectie met een gevestigde interferoninductor, de Rift Valley fever virus mutant kloon 13 (Cl 13) monitor. Beperkte trypsine digestie maakt wijzigingen analyseren protease gevoeligheid aangeeft conformatieveranderingen van het PRRS. Trypsinedigestie van lysaten van mock-geïnfecteerde cellen resulteert in een snelle afbraak van RIG-I en PKR, whereas Cl 13 infectie leidt tot de opkomst van een protease-resistente RIG-I-fragment. Ook PKR toont een virus-geïnduceerde gedeeltelijke resistentie tegen trypsinedigestie, die samenvalt met het keurmerk fosforylering op Thr 446. De vorming van RIG-I en PKR oligomeren werd gevalideerd door native polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Na infectie, is er een sterke ophoping van RIG-I en PKR oligomere complexen, dat deze eiwitten bleef monomeren in mock geïnfecteerde monsters.

Limited proteasedigestie en inheemse PAGE, beide gekoppeld aan western blot-analyse, zodat een gevoelige en directe meting van twee verschillende stappen van RIG-I en PKR activering. Deze technieken zijn betrekkelijk eenvoudig en snel uit te voeren en geen dure apparatuur vereisen.

Introduction

Een belangrijke gebeurtenis in antivirale afweer is de snelle detectie van de pathogeen door het zogenaamde patroonherkenning receptoren (PRRS) 1,2. Intracellulaire detectie van RNA-virus infectie is afhankelijk van twee cytoplasmatische RNA helicases, RIG-I (retinoëzuur induceerbare gen I) en MDA5 (melanoom differentiatie associated protein 5) 3-5. RIG-I bestaat uit twee N-terminale caspase recruitment domein (CARDS), een centrale soort DECH-box RNA helicase domein en een C-eindstandige domein (CTD) 4,6. Overwegende dat de CTD en de helicasedomein nodig zijn voor de erkenning van niet-zelf (virale) RNA's, de kaarten bemiddelen downstream signalering leidt tot de vestiging van een antivirale hoststatus.

Als RIG-I in het rustige toestand, dat wil zeggen in afwezigheid van een specifiek RNA-ligand, de tweede CARD samenwerkt met de centrale helicase domein en houdt RIG-I bij een auto-remmende conformatie 7-11. RIG-I bindt aan de korte double-streng (ds) RNA die van een 5'-trifosfaat (5'PPP), lange dsRNA en PolyU / UC-rijke RNA, klassieke handtekening structuren die aanwezig zijn op de genomen van vele RNA-virussen 12-16 zijn. Twee belangrijke kenmerken van RIG-I activering zijn een overstap naar een gesloten conformatie 6,17 en de homo-oligomerisatie 6,18,19. De conformatie schakelaar verbetert RNA-bindende, onthult de kaarten voor downstream signalering, en reconstrueert een actieve ATPase plaats 8,9,11,20. De vorming van oligomere RIG-I complexen leidt tot een verhoogde rekrutering van downstream signaling adapter moleculen om zo een platform voor antivirale signaaltransductie 11 te vormen. De RIG-I-gereguleerde signalisatie keten uiteindelijk activeert de transcriptiefactor IRF-3 voor up-regulatie van interferon (IFN-alpha/beta) genen en daarmee de genexpressie van interferon gestimuleerde genen (ISGs) voor een volledige antivirale respons 21,22 . Een van de best gekarakteriseerde ISGs de RNA-geactiveerde protein kinase (PKR) 23. PKR behoort tot de familie van eukaryotische translatie initiatie factor 2 alpha (eIF2α) kinasen en bestaat uit een N-terminaal dubbelstrengs RNA-bindend domein en een C-terminaal kinase domein. Het kinasedomein vormen de dimerisatie-interface cruciaal voor PKR activering en voert de katalytische functie van het eiwit. Binding van PKR om virale dsRNA leidt tot de vormverandering toelaat dimerisatie en auto-fosforylatie op Thr 446 onder andere resten. PKR bemiddelt dan fosforylering van eIF2α, waardoor de translatie van virale mRNAs 23-27 blokkeren.

Beide RIG-I en PKR ondergaan grote structurele herschikkingen, vormen oligomere complexen en zijn post-translationeel gemodificeerd door fosforylering / defosforylerings en ​​ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Voor een beter begrip van die viraal RNA structuren activeren RIG-I en PKR (en in welk stadium virale antagonisten kon be storende), is het belangrijk om de activeringsstatus nauwkeurig te bepalen. Voor beide PRRs werd eerder beschreven dat activatie leidt tot het ontstaan ​​van trypsine-resistente eiwitfragmenten 6,17,30 en hogere-orde oligomeren 6,18,19. Echter, gezien de grote hoeveelheid literatuur over deze belangrijke factoren van de antivirale gastheerreactie 1,2,24, toepassing van directe methoden lijkt betrekkelijk zeldzaam. In de hoop van het stimuleren van bredere gebruik, bieden wij handige en gevoelige protocollen krachtig analyseren de activering staten van RIG-I en PKR. De IFN bevoegde menselijke cellijn A549 is geïnfecteerd met een gevestigde activator van RIG-I en PKR, het verzwakt Rift Valley fever virus mutant kloon 13 (Cl 13) 31,32. Na een eenvoudige lyseren procedure worden de extracten van geïnfecteerde cellen getest door beperkte trypsinedigestie / western blot analyse conformationele schakelen evalueren en blauwe natieve polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) / Western blot analysis de vorming van oligomeren te meten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Zaaien van A549 cellen voor infectie

  1. Cultiveren een T75 fles A549 cellen bij 37 ° C en 5% CO2 in celkweekmedium (DMEM gesupplementeerd met 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutamine, 50.000 U / l penicilline en 50 mg / l streptomycine).
  2. Voordat de cellen te oogsten, warm celkweekmedium, PBS en 0,05% trypsine-EDTA in een waterbad verwarmd tot 37 ° C.
  3. Verwijder het medium en was de cellen met 10 ml PBS. Verwijder de PBS opnieuw.
  4. Voeg 3 ml trypsine-EDTA en verdeel eveneens in de kolf. Breng de kolf in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  5. Als alle cellen losgemaakt, 7 ml celkweekmedium, resuspendeer de cellen en breng de celsuspensie in een 15 ml Falcon buis.
  6. Centrifugeer de cellen bij 800 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml vers celkweekmedium.
  7. Tel de cellen met een telkamer.
  8. Voeg 2,5 x 10 6 cellen in 5 ml celkweekmedium in twee T25 kolven elk. Incubeer 16 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Een fles dient voor de mock-controle en een voor Cl 13 infectie.

2. Infectie met Rift Valley Fever Virus Clone 13 (Cl 13)

  1. OPMERKING: Cl 13 is een verzwakt virus mutant die in Duitsland onder BSL-2 aandoeningen kunnen worden behandeld. Gelieve te verwijzen naar relevante nationale richtlijnen. Andere typische IFN inductoren zou Sendai-virus (stam Cantell) of Newcastle disease-virus.
  2. Pre-warm PBS, serumvrij medium en celkweekmedium bevattende 5% FCS.
  3. Bereid 1,25 x 10 7 PFU / ml Cl 13 in serumvrij medium tot 2,5 x 10 6 A549 cellen te infecteren met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5. Bereid een licht (ongeveer 10%) grotere hoeveelheid dan nodig om rekening te pipet fouten.
  4. Was de cellen met PBS zoals beschreven onder 1.3.
  5. Voeg 1 ml van de Cl 13 verdunning ofserumvrij medium (geïnfecteerde controle mock) aan de cellen en incubeer 1 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Plaats de kolf zorgvuldig elke 15 minuten een gelijke verdeling van Cl 13 verdunning en serumvrij medium waarborgen, respectievelijk.
  6. Na 1 uur infectie, verwijdert de inocula, voeg 5 ml voorverwarmde celkweekmedium met 5% FCS, en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C en 5% CO2.

3. Bereiding van cellysaten

  1. Bereid PBS / 0,5% Triton X-100 bij 4 ° C. Heeft serineproteaseremmers niet toevoegen.
  2. Was de cellen met koude PBS en voeg 10 ml vers PBS.
  3. Schraap de cellen af, breng de celsuspensie in een Falcon-buis en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 30 ul PBS / 0,5% Triton X-100. Breng het lysaat in een schoon 1,5 ml buis en incubeer gedurende ten minste 10 minuten bij 4 ° C.
  5. Centrifugeer het lysaat 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het geklaarde cellysaat (supernatant) in een schoon buisje.
  6. Bepaal de eiwitconcentratie door Bradford assay zoals elders 33 beschreven.
  7. Bewaren bij -20 ° C of overgaan tot trypsinedigestie (4.1) of inheemse PAGE (5.1).

4. Bepaling van Conformational Veranderingen van Pattern Recognition Receptoren

  1. TPCK-trypsine behandeling van cellysaten
    1. Verdun L-1-tosylamido-2-fenylethyl-chloormethyl keton behandelde (TPCK) trypsine in PBS tot een uiteindelijke werking concentratie van 2 ug / ul.
    2. Pas in twee nieuwe buizen een uiteindelijke eiwitconcentratie van 25 ug van elk eiwit lysaat (mock of Cl 13) in een eindvolume van 9 ui met PBS. Daarom moet het vier buizen met 25 ug elk lysaat, tweemaal onechte en tweemaal Cl 13 infectie. Een set als input controle (onbehandeld) en een set voor behandeling met TPCK-trypsine.
    3. Voeg 1 pl PBS (onbehandeld)of 1 ui 2 ug / ul TPCK-trypsine (eindconcentratie: 0,2 ug / ul) aan de cellysaten en meng de reacties van pipetteren. Niet invriezen en ontdooien TPCK-trypsine porties, omdat het de efficiëntie van de spijsvertering in het gedrang brengt.
    4. Incubeer de lysaten bij 37 ° C gedurende 25 minuten. Stop de reactie door toevoeging 5x denaturerende monsterbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 25% β-mercaptoethanol, 0,5% broomfenolblauw) en koken gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Het is belangrijk om de trypsine incubatietijd niet uit. Als er geen protease-resistente fragmenten gedetecteerd, moet de tijd van trypsine digestie verkort.
    5. Na het koken kunnen de monsters bij -20 ° C worden bewaard
  2. SDS polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) en Western Blotting
    1. Plaats de monsters op een natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamide gel dat 5% stacking over een 12% oplossing gel. Scheid de eiwitten bij 25 mA per gel totde broomfenolblauw opraakt.
    2. Activeer een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan gedurende 30 seconden met methanol en zet hem in de overdracht buffer (48 mM Tris, 39 mM glycine, 1,3 mm SDS, 20% methanol).
    3. Bereid de blotting met een halfdroge blotting systeem en toestaan ​​dat het eiwitgehalte bij 10 V gedurende 1 uur. Neem het membraan uit, spoel het kort met water, en laat het drogen.
    4. Schakel het membraan door kort de overdracht in methanol. Was gedurende 5 minuten met TBS. Blok met 10% afgeroomde melk in TBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° CO / N. Was het membraan 3x gedurende 5 minuten elk met TBS.
    5. Bereid antilichaamverdunning zoals aanbevolen in tabel 1 en incubeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° CO / N.
    6. Was het membraan 3 x 10 minuten elk met TBS-T. Voeg de juiste secundaire antilichaam gekoppeld aan mierikswortelperoxidase op een 1:20.000 verdunning in 1% magere melk in TBS. Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Was het membraan 3x 10 minuten elk met TBS-T, en one extra tijd met TBS.
    8. Voor signaaldetectie gebruiken een commerciële chemiluminescense kit en een digitale gel imaging systeem.
  3. Coomassie Brilliant Blue G-250 kleuring
    1. Voer SDS-PAGE, zoals beschreven in 4.2.1. Belasting monsters op een SDS-polyacrylamide gel en laat de gel bij 25 mA per gel tot broomfenolblauw opraakt.
    2. Voer Coomassie Brilliant Blue G-250 kleuring bij RT. Hebben alle incubaties onder constante schudden.
    3. Breng de gel om de fixatie oplossing met 40% methanol en 10% azijnzuur gedurende 30 minuten.
    4. Wissel de buffer ontkleuroplossing (25% ethanol en 8% azijnzuur) en incubeer gedurende 5 minuten.
    5. Vlekken op de gel met 0,2% Coomassie Brilliant Blue G-250 in 40% methanol en 10% azijnzuur gedurende 1 uur.
    6. Destain de gel met de ontkleuroplossing en wisselen de buffer na 10 min, 30 min en 60 min.
    7. Bewaar de gel in 25% ethanol, 8% azijnzuur en 4% glycerol bij 4 ° C. Voer beeldvorming en analyse zoals beschreven onder 4.2.8.

Analyse van Oligomere Staten van Pattern Recognition Receptoren 5.

  1. Inheemse PAGINA
    1. Bereid 50 pg cellysaat in een eindvolume van 10 pl met PBS en voeg 5 × natieve monsterbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% natriumdeoxycholaat, 50% glycerol, 0,5% broomfenol blauw) tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
    2. Plaats de monsters ONMIDDELLIJK op een native polyacrylamide gel met 5% als het stapelen en 8% als het oplossen van gel. Elke vertraging resulteert in een verlies van natieve complexen 34.
    3. Laat de gel bij 20 mA per gel bij 4 ° C met 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM glycine en als anode en 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glycine, 1% natriumdeoxycholaat als kathode buffer. Na 1,5-2 uur (broomfenolblauw band heeft de gel vertrokken ongeveer 45 min eerder) de elektroforese is voltooid.
  2. Western Blotting
    1. Activeer een polyvinylidene fluoride (PVDF) membraan gedurende 30 seconden met methanol en het in Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, 20% methanol).
    2. Monteer een natte vlek kamer volgens de instructies van de fabrikant en vult u de tank met Towin buffer.
    3. Voer de blotting met 250 mA gedurende 1,5 uur bij 4 ° C.
    4. Wanneer blotting is afgewerkt werk zoals beschreven vanaf 4.2.3 op.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erkenning van een virale agonist door RIG-I of PKR triggers conformationele schakelen 6,17,30 en oligomerization 6,18,27. We getest deze twee merkers van activatie van beperkte protease digestie en natieve polyacrylamide gelelektroforese (PAGE), respectievelijk.

Humane A549 cellen werden geïnfecteerd met riftdalkoorts viruskloon 13 (Cl 13), die wordt gekenmerkt door een mutatie van de IFN-antagonist-NSS 35,36. Door de afwezigheid van functionele NSS, Clone 13 induceert sterk RIG-I en PKR, wat leidt tot de oprichting van een robuuste antivirale toestand in de cellen 12,31,32,37.

Trypsine digestie van mock geïnfecteerde cellysaten heeft een snelle afbraak van RIG-I, terwijl Cl 13 infectie leidt tot de vorming van een 30 kDa resistente RIG-fragment Figuur 1A. Ook PKR toont gedeeltelijke resistentie tegen trypsinedigestie in geïnfecteerde monsters, die samenvalt met phosphorylation Figuur 1A. Om de efficiëntie en specificiteit van trypsinedigestie bewaken, werden gels gekleurd met Coomassie Brilliant Blue G-250. Onbehandelde monsters tonen gelijke hoeveelheden geladen eiwitten figuur 1B. Het onderwerpen van mock en Cl 13 cellysaten om trypsinedigestie leidt tot een vergelijkbare afname van de wereldwijde eiwit bedragen. Dit toont aan dat trypsine behandeling heeft dezelfde efficiëntie voor mock-en Cl-13-geïnfecteerde monsters.

De vorming van oligomere complexen werd bepaald door native PAGE. In geïnfecteerde cellen werden slechts monomeren RIG-I en PKR gedetecteerd Figuur 2. Als extra controle wij opgenomen de transcriptiefactor IRF-3, die aanwezig is als een monomeer, maar bekend dimeriseren bij activering via bijvoorbeeld RIG-I 38 is. Cl 13 infectie leidt tot een sterke ophoping van RIG-I oligomere complexen in de vorm van een uitstrijkje en PKR en IRF-3 dimeren / oligomeren als gedefinieerd eiwitband.

class = "jove_content"> Deze resultaten tonen aan dat de beperkte trypsinedigestie en inheemse PAGE zijn nuttige hulpmiddelen om vormveranderingen en oligomeervorming van RIG-I en PKR na infectie te controleren.

Figuur 1
Figuur 1. Conformational schakelaar van RIG-I en PKR. A549 cellen werden mock geïnfecteerd of geïnfecteerd met Cl 13 bij een MOI van 5. Na 5 uur werden cellen gelyseerd in PBS aangevuld met 0,5% Triton X-100 en gewist cellysaten waren ofwel onbehandeld of behandeld met trypsine. Monsters werden onderworpen aan SDS PAGE gevolgd door Western blotting (A) of Coomassie kleuring (B). Blots werden gekleurd tegen RIG-I, PKR, gefosforyleerd PKR (Thr 446) en tegen RVFV nucleoproteïne (RVFV N) en beta-actine als infectie en laad controle, respectievelijk._blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Oligomerisatie van RIG-I, PKR, en IRF-3. Cellysaten mock-en Cl-13 geïnfecteerde cellysaten werden onderworpen aan natieve PAGE gevolgd door Western blot analyse. Kleuring werd uitgevoerd met antilichamen tegen RIG-I, PKR, IRF-3, en beta-actine als beladingscontrole. PKR oligomeren waarschijnlijk dimeren 27 vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het aftasten van de aanwezigheid van virussen en activering van de antivirale type I IFN-systeem zijn van cruciaal belang voor een succesvolle aangeboren immuunrespons 22. Virusdetectie wordt daarbij gemedieerd door pathogeen herkenning receptoren (PRRS) zoals RIG-I en PKR, waardoor een snelle reactie en activering van antivirale afweermechanismen. Hier beschrijven we twee methoden om de activatie status van RIG-I en PKR direct evalueren.

Beperkte protease digestie als een instrument om conformationele veranderingen van RIG-I en PKR werd eerst beschreven door de groep van M. Gale Jr en T. Fujita 6,17 en JL Cole 30 respectievelijk bewaken. Het is een gevoelige methode om de gevoeligheid wijzigingen evalueren trypsine behandeling door conformatieveranderingen. Het toepassen trypsinedigestie, ontdekte we een snelle afbraak van RIG-I en PKR in mock geïnfecteerde monsters, terwijl trypsine behandeling van virus-geïnfecteerde cellysaten geleid tot trypsine resistente RIG-I fragmenten. Similarly, werd een trypsine resistent PKR fragment gedetecteerd bij Cl 13 infectie. Dit ging gepaard met PKR fosforylatie van Thr 446, een veel gebruikte marker activatie van PKR. Het vergelijken trypsinedigestie van mock en Cl 13 cellysaten door Coomassie kleuring toont een vergelijkbare daling van de wereldwijde eiwit niveaus. Dit geeft aan dat de vorming van resistente fragmenten specifiek voor eiwitten zoals RIG-I en PKR.

De vorming van oligomere complexen van RIG-I, PKR en IRF-3 werd gevolgd door native PAGE. Het onderwerpen van Cl 13-geïnfecteerde cellysaten inheemse PAGE, we ontdekt RIG-I, PKR en IRF-3 oligomeren, dat deze eiwitten bleef als monomeren in mock geïnfecteerde monsters. RIG-I moet oligomeren aan downstream pathways activeren vormen. De hypothese was dat de RIG-I oligomerizatie ondersteunt recrutering van co-factoren om een signalering platform voor antivirale respons mechanismen 11 te vormen. De functie van PKR dimerisatie niet volledig begrepen. Het meest waarschijnlijk, de PKR subeenheden in het dimeer fosforyleren elkaar 25. Het type I IFN systeem wordt strak gereguleerd op een transcriptioneel niveau, en IRF-3 is een centrale transcriptiefactor voor de inductie van IFN en ISGs 38. Centrale kenmerken activeringsgevallen fosforylatie, dimerisatie en translocatie naar de kern, waar het rekruteert de transcriptionele co-activatoren en p300-CREB-bindend eiwit (CBP) IFN mRNA synthese 21,39 initiëren. Analyse van IRF-3 dimerisatie is een veel gebruikt instrument voor de opvolging activering van de type I IFN-respons 38. Daarom gebruikten we de detectie van IRF-3 oligomere complexen als een bewijs van het principe voor de oligomerisatie assays van RIG-I en PKR oligomerization. Inderdaad, waardoor scheiding van eiwit lysaten onder niet-denaturerende omstandigheden konden wij IRF-3 dimerisatie detecteren Cl 13 geïnfecteerde monsters.

Ongetwijfeld zullen elk lab moeten de protocollen van beperkte protease DIGE optimaliserenleerd en inheemse PAGE. Wanneer geconfronteerd met geen detectie van een resistente eiwitten of teveel resistente fragmenten, zou men kunnen verkorten of verlengen de tijd van de spijsvertering, respectievelijk. Verschillen kunnen worden veroorzaakt door de specifieke TPCK-trypsine beelden, preparaten enigszins verschillen. Daarom moeten verschillende TPCK-trypsine concentraties getest voor optimalisatie. Cellysaten worden bereid uit andere cellijnen dan A549, maar aanpassing van het protocol nodig kan zijn. Het wordt aanbevolen de hoeveelheid totale eiwitten passen voor trypsine digestie en natieve PAGE volgens het expressieniveau van het eiwit van interesse in dit specifieke celtype. Bovendien kan beperkte detectie of zwakke scheiding van oligomere complexen door native PAGE verschillende redenen hebben en kunnen worden aangepakt als volgt: Zorg ervoor dat de apparatuur wordt gereinigd om de resterende denatureringsmiddelen verwijderen, houden alle monsters en de gel tijdens de PAGE bij 4 ° C , en niet de tijd tussen monstervoorbereiding en loa verlengending op de gel. Limited protease digestie en natieve PAGE werden ook gebruikt om de activering van andere belangrijke, nauw verwante PRR, MDA5 40-42 bewaken. Monitoring van MDA5 activering vereist verschillende experimentele condities in vergelijking met RIG-I en PKR, en werd daarom hier niet opgenomen.

Samengevat, worden punt-voor-punt protocollen voor twee nuttige en gevoelige methoden voor activering van RIG-I en PKR meten gepresenteerd. Limited proteasedigestie en inheemse PAGE, beide gekoppeld aan Western blot analyse, vergunning monitoring van vormveranderingen en oligomerization, respectievelijk. Met behulp van deze methoden, hadden we eerder aangetoond dat RIG-I kan worden geactiveerd door nucleocapsiden van verschillende virussen direct na binnenkomst in de cellen 32.

De precieze aard en herkomst van de RNA-soorten die relevant zijn voor RIG-I en PKR activering in geïnfecteerde cellen zijn nog steeds niet helemaal opgelost. Bovendien hebben veel virussen verstorende functies van PRRS door een grote verscheidenheid van strategieën 12,43-46. De gepresenteerde technieken vergroten het spectrum van methoden doordat een eenvoudige en directe meting van RIG-I en PKR activering, zijn snel uit te voeren, en geen dure apparatuur nodig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken Alejandro Brun van CISA-INIA voor het verstrekken van anti-Rift Valley fever virus sera. Werk in onze laboratoria wordt ondersteund door Forschungsförderung gem. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, de Leibniz Graduate School for Emerging virusziekten (EIDIS), de DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, en de DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
Penicillin-streptomycin PAA 15070-063
Fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
Antibodies
Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS
Rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS
Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS
Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

Infectieziekten aangeboren immuunrespons virus infectie pathogeen herkenning receptor RIG-I PKR IRF-3 beperkt proteasedigestie conformatie-schakelaar inheemse PAGE oligomerization
Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, M., Weber, F. Monitoring… More

Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter