Summary
Innate försvar till virusinfektioner utlöses av mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS). De två cytoplasmiska PRRs RIG-I och PKR binder till virussignatur RNA, ändra konformation, oligomerisera och aktivera antivirala signalering. Metoder beskrivs som tillåter att bekvämt övervaka konforma växling och oligomerisering av dessa cytoplasmiska PRRs.
Abstract
Värd försvar till virusinfektion är beroende av en snabb detektering av mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) i det medfödda immunförsvaret. I cytoplasman PRRS RIG-I-och PKR binda till specifika virala RNA-ligander. Detta förmedlar först konforma växling och oligomerisering, och sedan möjliggör aktivering av en antiviral interferonsvar. Även om metoder för att mäta antiviral värd-genexpression är väl etablerade metoder för att direkt övervaka aktiveringstillstånd RIG-I och PKR endast delvis och mindre väl etablerad.
Här beskriver vi två metoder för att övervaka RIG-I och PKR stimulering efter infektion med en etablerad interferoninducerare, Rift Valley febervirus muterad klon 13 (Cl 13). Begränsad trypsindigerering gör det möjligt att analysera förändringar i proteas känslighet, vilket tyder på konformationsändringar av PRRS. Trypsin digestion av lysat från skeninfekterade celler resulterar i en snabb nedbrytning av RIG-I och PKR whereas Cl 13-infektion leder till uppkomsten av en proteas-resistent RIG-fragmentet. Också PKR visar en virus-inducerad partiell resistens mot trypsin digestion, som sammanfaller med dess kännetecken fosforylering vid Thr 446. Bildningen av RIG-I och PKR oligomerer validerades genom nativ polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). Efter infektion, finns det en stark ansamling av RIG-I och PKR oligomera komplexen, medan dessa proteiner kvar som monomerer i mock-infekterade prover.
Begränsad proteasspjälkning och infödda SIDA, båda kopplade till western blot-analys, tillåta en känslig och direkt mätning av två olika steg i RIG-I och PKR-aktivering. Dessa tekniker är relativt lätt och snabbt att utföra och kräver ingen dyr utrustning.
Introduction
En avgörande händelse i antivirala värdförsvar är den snabb upptäckt av patogenen genom de så kallade mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) 1,2. Intracellulär upptäckt av RNA-virus infektion är beroende av två cytoplasmiska RNA helikaser, RIG-I (retinoinsyra inducible gen I) och MDA5 (melanom differentiering associerat protein 5) 3-5. RIG-I består av två N-terminala caspase rekryterings domäner (CARDS), en central DECH-box typ RNA-helikas domän och en C-terminal domän (CTD) 4,6. Medan CTD och helikas domän krävs för erkännande av icke-själv (virus) RNA, korten medla nedströms signalering som leder till upprättandet av en antiviral värdstatus.
Om RIG-I är i tyst tillstånd, dvs i frånvaro av en specifik RNA-ligand, samverkar det andra kortet med den centrala helikas domän och håller RIG-I i en auto-inhiberande konforma 7-11. RIG-I binder till korta dubbel-strängen (ds)-RNA som bär en 5'-trifosfat (5'PPP) långt dsRNA och PolyU / UC-rikt RNA, klassiska signatur strukturer som är närvarande på genomen hos många RNA-virus 12-16. Två viktiga egenskaper hos RIG-I aktivering är en övergång till en sluten konforma 6,17 och homo-oligomerisering 6,18,19. Den konforma switch ökar RNA bindande, exponerar korten för nedströms signalering, och återskapar ett aktivt ATPas webbplats 8,9,11,20. Bildningen av oligomera RIG-I-komplex leder till förbättrad rekrytering av nedströms signaleringsadaptermolekyler för att bilda en plattform för antiviral signaltransduktion 11. Rig-I-reglerad signaleringskedja aktiverar slutligen transkriptionsfaktorn IRF-3 för uppreglering av interferon (IFN-alpha/beta) gener och således genuttrycket av interferonstimulerad gener (ISGs) för en full antiviralt svar 21,22 . En av de bästa karakteriserade ISGs är RNA-aktiverade protein-kinas (PKR) 23. PKR tillhör familjen av eukaryot translationsinitiering faktor 2 alfa (eIF2α) kinaser och är sammansatt av en N-terminal dubbelsträngade RNA-bindande domän och en C-terminal kinasdomän. Kinasdomänen utgör den dimerise gränssnitt avgörande för PKR-aktivering och utför de katalytiska funktionerna hos proteinet. Bindning av PKR till viral dsRNA leder till dess conformationaländring medger dimerisering och auto-fosforylering vid Thr 446 bland andra rester. PKR förmedlar sedan fosforylering av eIF2α, därigenom blockera översättningen av viralt mRNA 23-27.
Både RIG-I och PKR genomgår stora strukturella omorganiseringar, bilda oligomera komplex och är post-translationellt modifierat genom fosforylering / defosforylering och ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. För en bättre förståelse för vilka virala RNA strukturer aktiverar RIG-I och PKR (och i vilket skede virus antagonister kunde be interfererande), är det viktigt att exakt bestämma aktiveringsstatus. För båda PRRs det tidigare beskrivits att aktivering leder till uppkomsten av trypsin-resistent proteinfragment 6,17,30 och högre ordningens oligomerer 6,18,19. Men med tanke på den stora mängd litteratur om dessa nyckelfaktorer för den antivirala värdsvaret 1,2,24, verkar tillämpa direkta metoder devis sällsynta. I hopp om att stimulera en bredare användning, erbjuder vi bekväma och känsliga protokoll för att kraftfullt analysera aktiveringstillstånd RIG-I och PKR. IFN kompetent human cellinje A549 är infekterad med en etablerad aktivator av RIG-I och PKR, den försvagade Rift Valley febervirus mutant klon 13 (Cl 13) 31,32. Efter en enkel lyserförfarande, är extrakt av infekterade celler testas av begränsad trypsindigestion / western blot-analys för att utvärdera konforma växling, och med blå infödda polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) / Western blot-analysär att mäta bildningen av oligomerer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sådd av A549 celler för infektion
- Odla en T75-kolv med A549-celler vid 37 ° C och 5% CO2 i cellodlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutamin, 50,000 U / l penicillin och 50 mg / l streptomycin).
- Innan man börjar skörda cellerna, värma upp cellkulturmedium, PBS och 0,05% trypsin-EDTA i ett vattenbad upphettades till 37 ° C.
- Ta ut mediet och tvätta cellerna med 10 ml PBS. Ta bort PBS igen.
- Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA och fördela jämnt i kolven. Flytta över kolven i en inkubator med 37 ° C och 5% CO2.
- När alla celler är fristående, lägga till 7 ml cellodlingsmedium, resuspendera cellerna och överför cellsuspensionen till ett 15 ml Falcon-rör.
- Centrifugera cellerna vid 800 xg under 5 min vid RT, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml färskt cellkulturmedium.
- Räkna celler med en räkningskammare.
- Lägg till 2,5 x 10 6 celler i 5 ml av cellodlingsmedium i två T25-kolvar vardera. Inkubera under 16 h vid 37 ° C och 5% CO2. En kolv tjänar för mock kontroll och en för Cl 13 infektion.
2. Infektion med Rift Valley Fever Virus Klon 13 (Cl 13)
- OBS: Cl 13 är ett försvagat virus mutant som i Tyskland kan hanteras inom ramen för BSL-2 villkor. Följ gällande nationella riktlinjer. Andra typiska IFN inducerare skulle Sendai-virus (stam Cantell) eller Newcastlesjukevirus.
- Pre-varm PBS, serumfritt medium och cellkulturmedium innehållande 5% FCS.
- Preparera 1,25 x 10 7 PFU / ml av Cl 13 i serumfritt medium för att infektera 2,5 x 10 6 A549-celler med en infektionsmultiplicitet (MOI) av 5. Bered en något (ca 10%) större mängd än vad som behövs för att redovisa pipettspetsar fel.
- Tvätta cellerna med PBS som beskrivs under 1.3.
- Lägg 1 ml av Cl 13 utspädning ellerserumfritt medium (oinfekterade kontroll mock) till cellerna och inkubera under 1 timme vid 37 ° C och 5% CO2. Flytta kolven försiktigt var 15 min för att säkerställa jämn fördelning av Cl 13 utspädning och serumfritt medium, respektive.
- Efter 1 h av infektion, ta bort inokulat, tillsätt 5 ml av förvärmd cellkulturmedium med 5% FCS, och inkubera under 5 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Framställning av cellysat
- Förbered PBS / 0,5% Triton X-100 vid 4 ° C. Lägg inte till serin proteashämmare.
- Tvätta cellerna med kall PBS och tillsätt 10 ml färsk PBS.
- Skrapa cellerna av, överför cellsuspensionen i ett Falcon-rör och centrifugera vid 800 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 30 | il PBS / 0,5% Triton X-100. Överför lysatet till en färsk 1,5 ml rör och inkubera under åtminstone 10 minuter vid 4 ° C.
- Centrifugera lysatet vid 10,000 x g under 10 min vid 4 ° C och överföra den klarnade cellysatet (supernatant) till ett nytt rör.
- Bestäm proteinkoncentrationen genom Bradford-analys såsom beskrivits på annat håll 33.
- Lagra vid -20 ° C eller fortsätt till trypsindigerering (4,1) eller naturlig PAGE (5,1).
4. Fastställande av Conformational Förändringar av Pattern Recognition Receptors
- TPCK-trypsin-behandling av cellysat
- Späd L-1-tosylamido-2-fenyletyl-klormetylketon behandlat (TPCK) trypsin i PBS till en slutlig arbetskoncentration av 2 | ig / | il.
- Justera i två nya rör en slutlig proteinkoncentration av 25 | j, g av varje protein-lysat (mock eller Cl 13) i en slutlig volym av 9 ^ il med PBS. Därför bör det vara fyra rör med 25 mikrogram lysat vardera, två gånger håna och två gånger Cl 13 infektion. Ett set som styringång (obehandlat) och en uppsättning för behandling med TPCK-trypsin.
- Tillsätt 1 l av PBS (obehandlad)eller 1 l av 2 mikrogram / l TPCK-trypsin (slutlig koncentration: 0,2 mikrogram / l) till cellysaten och blanda reaktionerna genom pipettering. INTE frysa och tina TPCK-trypsin portioner, eftersom det kommer att äventyra effektiviteten i matsmältningen.
- Inkubera lysaten vid 37 ° C under 25 min. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 5 x denaturerande provbuffert (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glycerol, 25% β-merkaptoetanol, 0,5% bromfenolblått) och genom kokning under 5 min vid 95 ° C. Det är viktigt att inte sträcka trypsin inkubationstiden. Om inga proteasresistenta fragment kan detekteras, måste tiden för trypsin matsmältning förkortas.
- Efter kokning kan proverna förvaras vid -20 ° C.
- SDS-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) och Western blotting
- Ladda prover på en natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel innehållande en 5% stapling över en 12% upplösande gel. Separera proteiner vid 25 mA per gel tillsden bromfenolblå tar slut.
- Aktivera en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran i 30 sek med metanol och lägg den i överföringsbuffert (48 mM Tris, 39 mM glycin, 1,3 mM SDS, 20% metanol).
- Förbered blotting med en halvtorr blotting-system och möjliggör överföring av proteinerna vid 10 V under 1 timme. Ta membranet ut, skölj snabbt med vatten och låt den torka.
- Aktivera membranet genom kort överföring till metanol. Tvätta i 5 min med TBS. Block med 10% skummjölk i TBS under 1 timme vid RT eller vid 4 ° CO / N. Tvätta membranet 3x 5 minuter vardera med TBS.
- Förbered späd antikropp såsom rekommenderas i tabell 1 och inkubera membranet under 1 h vid RT eller vid 4 ° CO / N.
- Tvätta membranet 3x 10 minuter vardera med TBS-T. Lägg till en lämplig sekundär antikropp kopplad med pepparrotsperoxidas vid en 1:20.000 utspädning i 1% skummjölk i TBS. Inkubera 45 min vid RT.
- Tvätta membranet 3x under 10 min vardera med TBS-T, och one extra tid med TBS.
- För signaldetektering använda ett kommersiellt chemiluminescense kit och en digital gel bildsystem.
- Coomassie Brilliant Blue G-250 Färgning
- Utför SDS-PAGE såsom beskrivits i 4.2.1. Last prov på en SDS polyakrylamidgel och köra gelen vid 25 mA per gel tills bromfenolblå tar slut.
- Utför Coomassie Brilliant Blue G-250 färgning vid RT. Gör alla inkubationer under ständig skakning.
- Överför gelén till fixeringslösning innehållande 40% metanol och 10% ättiksyra under 30 min.
- Byta ut bufferten för avfärgning lösning (25% etanol och 8% ättiksyra) och inkubera under 5 min.
- Färga gelén med 0,2% Coomassie Brillant Blue G-250 i 40% metanol och 10% ättiksyra under 1 timme.
- Avfärga gelén med avfärgningslösningen och utbyta bufferten efter 10 min, 30 min och 60 min.
- Förvara gelén i 25% etanol, 8% ättiksyra och 4% glycerol vid 4 ° C. Utför bildbehandling och analys som beskrivs under 4.2.8.
5. Analys av Oligomera stater Pattern Recognition Receptors
- Native PAGE
- Förbered 50 pg av cellysat i en slutlig volym av 10 | il med PBS och tillsätt 5 × nativ provbuffert (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 1% natriumdeoxikolat, 50% glycerol, 0,5% bromfenolblått) till en slutkoncentration av 1x.
- Ladda proverna OMEDELBART på en infödd polyakrylamidgel med 5% som stapling och 8% som lösa gel. Förseningar kommer att resultera i en förlust av inhemska komplex 34.
- Kör gelen vid 20 mA per gel vid 4 ° C med 50 mM Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM glycin som som anod och 50 mM Tris pH 8,3, 384 mM glycin, 1% natriumdeoxikolat som katod buffert. Efter 1,5-2 timmar (bromfenolblått band har lämnat gel ca 45 minuter tidigare) elektrofores är klar.
- Western Blotting
- Aktivera en polyvinylidene (PVDF) membran i 30 sek med metanol och lägg den i Towbin-buffert (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS, 20% metanol).
- Montera en våt blot kammare enligt tillverkarens anvisningar och fyll tanken med Towin buffert.
- Utför-blotting med 250 mA under 1,5 h vid 4 ° C.
- När läsk är klar gör som beskrivs från 4.2.3 på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erkännande av en virus-agonist med RIG-I eller PKR utlöser konforma växling 6,17,30 och oligomerisering 6,18,27. Vi analyserade dessa två aktiveringsmarkörer genom begränsad proteasdigestion och nativ polyakrylamidgelelektrofores (PAGE), respektive.
Humana A549-celler infekterade med Rift Valley febervirus klon 13 (Cl 13), som kännetecknas av en mutation av IFN antagonisten NSs 35,36. På grund av avsaknaden av funktionella NSs, klon 13 inducerar starkt RIG-I och PKR, som leder till upprättandet av en stark antiviral tillstånd i cellerna 12,31,32,37.
Trypsin-digerering av skeninfekterade cellysat resulterar i en snabb nedbrytning av RIG-I, medan Cl 13-infektion leder till genereringen av en 30 kDa-resistent RIG-I-fragmentet Figur 1A. Även PKR visar partiell resistens mot trypsin matsmältningen i infekterade prover, som sammanfaller med dess fosforylation Figur 1A. För att övervaka effektiviteten och specificiteten av trypsindigerering gelerna färgades med Coomassie Brilliant Blue G-250. Obehandlade prover visar lika mycket laddade proteiner Figur 1B. Utsätta håna och Cl 13 cellysat till trypsin matsmältning leder till en motsvarande minskning av globala protein belopp. Detta visar att trypsin behandling har samma effektivitet för mock och Cl 13-infekterade prover.
Bildningen av oligomera komplex analyserades genom nativ PAGE. Hos icke-infekterade celler, var det bara monomerer av RIG-I och PKR detekteras Figur 2. Som ytterligare kontroll inkluderade vi transkriptionsfaktorn IRF-3, som är närvarande som en monomer men känt att dimerisera vid aktivering via t.ex. RIG-I 38. Cl 13-infektion leder till en kraftig ansamling av RIG-I oligomera komplex i form av ett utstryk och av PKR och IRF-3 dimerer / oligomerer som en definierad proteinband.
Figur 1. Conformational omkopplare av RIG-I och PKR. A549-celler var skeninfekterade eller infekterade med Cl 13 vid ett MOI av 5. Efter 5 timmar, lyserades cellerna i PBS supplementerat med 0,5% Triton X-100 och rensas cellysat antingen obehandlade eller behandlade med trypsin. Prover underkastades SDS PAGE följt av Western blotting (A) eller Coomassie-färgning (B). Blott färgades mot RIG-I, PKR, fosforyleras PKR (Thr 446) och mot RVFV nukleoprotein (RVFV N) och beta-aktin som infektion och laddningskontroll, respektive._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Oligomerisering av RIG-I, PKR, och IRF-3. Cellysat av mock-och Cl-13-infekterade cellysat utsattes för naturlig PAGE följt av Western blot-analys. Färgning utfördes med antikroppar mot RIG-I, PKR, IRF-3, och beta-aktin som laddningskontroll. PKR oligomerer utgör sannolikt dimerer 27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sensing förekomsten av virus och aktivering av det antivirala typ I IFN-systemet är avgörande för framgångsrika medfödda immunsvar 22. Virus upptäckt därmed förmedlas av patogen igenkänningsreceptorer (PRRS) som RIG-I och PKR, möjliggör ett snabbt svar och aktivering av antivirala försvarsmekanismer. Här beskriver vi två metoder för att direkt utvärdera aktiveringsstatus för RIG-I och PKR.
Begränsad proteasspjälkning som ett verktyg för att övervaka konformationsförändringar i RIG-I och PKR beskrevs först av de grupper av M. Gale Jr och T. Fujita 6,17, och JL Cole 30, respektive. Det representerar en känslig metod för att utvärdera känslighets förändringar till trypsin behandling som orsakas av konformationsförändringar. Tillämpa trypsindigerering upptäckte vi en snabb nedbrytning av RIG-I och PKR i mock infekterade prover, medan trypsin behandling av virusinfekterade cellysat ledde till trypsin resistenta RIG-I-fragment. SimilArly, var en trypsin resistent PKR fragmentet upptäcks på Cl 13 infektion. Detta åtföljdes av PKR fosforylering vid Thr 446, en allmänt använd markör av PKR-aktivering. Jämföra trypsindigerering av modeller och Cl 13 cellysat av Coomassie färgning visar en jämförbar minskning av globala proteinnivåer. Detta indikerar att bildningen av resistenta fragment är specifika för proteiner som RIG-I och PKR.
Bildningen av oligomera komplex av RIG-I, PKR och IRF-3 övervakades med hjälp av nativ PAGE. Utsätta Cl 13-infekterade cellysat till nativ PAGE upptäckte vi RIG-I, PKR och IRF-3 oligomerer, medan dessa proteiner kvar som monomerer i mock infekterade prover. RIG-Jag behöver bilda oligomerer att aktivera vägar nedströms. Man antog att RIG-I oligomerisering stöder rekrytering av kofaktorer för att bilda en plattform signalering för antivirala reaktionsmekanismer 11. Funktionen för PKR-dimerisering är inte helt förstått. Troligtvis, PKR-subenheter i dimer fosforylerar varandra 25. Den typ I IFN-systemet är hårt reglerad på transkriptionsnivå, och IRF-3 representerar en central transkriptionsfaktör för induktionen av IFN och ISGs 38. Centrala kännetecken för aktivering är fosforylering, dimerisering och translokation till kärnan, där den rekryterar transkriptions co-aktivatorer p300 och CREB-bindande protein (CBP) att initiera IFN-mRNA-syntes 21,39. Analys av IRF-3-dimerisering är ett allmänt använt verktyg för att övervaka aktivering av typ I-IFN-svaret 38. Därför använde vi upptäckten av IRF-3 oligomeric komplex som ett bevis på princip för oligomeriseringen analyser av RIG-I och PKR oligomerisering. I själva verket, vilket tillåter separation av proteinlysat för ej denaturerande betingelser, kunde vi upptäcka IRF-3-dimerisering i Cl 13 infekterade prover.
Utan tvekan kommer varje labb måste optimera protokollen för begränsad proteas Digestion och nativ PAGE. Om konfronteras med någon upptäcka eventuella resistenta proteiner eller för många resistenta fragment, kan man förkorta eller förlänga tiden för matsmältningen, respektive. Skillnader kan också bero på den specifika TPCK-trypsin lager, som preparat skiljer sig något. Därför bör olika TPCK-trypsin koncentrationer testas för optimering. Cellysat kan framställas från andra cellinjer än A549, men anpassningar av protokollet kan krävas. Det rekommenderas att justera mängden av de totala proteinerna för trypsinspjälkning och nativ PAGE enligt expressionsnivån av proteinet av intresse i detta specifika celltyp. Vidare kan begränsad upptäckt eller svag separation av oligomeric komplex genom naturlig PAGE ha flera orsaker och kan behandlas som följs: se till att utrustningen är rengjord för att ta bort kvarvarande denatureringsmedel, hålla alla prover och gelen under PAGE vid 4 ° C , och inte förlänga tiden mellan beredning och loa provding på gelén. Begränsat proteasdigestion och nativ PAGE har också använts för att övervaka aktivering av ett annat viktigt, närbesläktade PRR, MDA5 40-42. Övervakning av MDA5 aktivering krävs olika experimentella förhållanden jämfört med RIG-I och PKR, och var därför inte här.
I sammanfattning, är punkt-för-punkt-protokoll för två användbara och känsliga metoder för att mäta aktivering av RIG-I och PKR presenteras. Begränsad proteasspjälkning och infödda SIDA, båda kopplade till Western blot-analys, tillståndsövervakning av konformationsförändringar och oligomerisering, respektive. Genom att använda dessa metoder, hade vi tidigare visat att RIG-Jag kan aktiveras av nukleokapsider av olika virus direkt efter deras inträde i cellerna 32.
Den exakta innebörden och ursprunget för de RNA-arter är relevanta för RIG-I och PKR-aktivering i infekterade celler är fortfarande inte helt löst. Dessutom har många virus störfunktionerna hos PRRs från en mängd olika strategier 12,43-46. De presenterade teknikerna större spektrum av metoder genom att tillåta ett enkelt och direkt mätning av RIG-I och PKR-aktivering, är snabba att utföra och inte kräver dyr utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Alejandro Brun från CISA-INIA för att ge anti-Rift Valley-feber Virus sera. Arbetet i våra laboratorier stöds av Forschungsförderung pärla. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Leibniz forskarskolan Emerging virussjukdomar (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, och DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| Antibodies | |||
| Mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1,000 in 5% BSA in TBS |
| Rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| Rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun CISA-INIA | WB: 1:2,000 in 1% skim milk in TBS | |
| Mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
| Polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20,000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H.
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
