Summary
Использование веб-камера и сочетание свободных и недорогих программ, локомотивные узоры в дрозофилы могут быть проанализированы для определения различий в скорости, расстояния и времени различных мероприятий двигателя.
Abstract
Системы слежения Видео широко используются для анализа Drosophila движение MELANOGASTER и обнаруживать различные отклонения в опорно-двигательного поведения. В то время как эти системы могут обеспечить богатство поведенческого информации, стоимость и сложность этих систем может быть непомерно высокой для многих лабораторий. Мы разработали недорогой тест для измерения локомотива поведение и движение изъятия в дрозофилы. Система использует веб-камеры для захвата изображений, которые могут быть обработаны с использованием комбинации недорогой и свободного программного обеспечения для отслеживания расстояние переехал, средняя скорость движения и продолжительности движения в течение определенного времени пролета. Чтобы продемонстрировать полезность этой системы, мы рассмотрели группа дрозофилы мутантов Bang-чувствительные (BS) расслабленных, которые в 3-10 раз более восприимчивы к захват как деятельности (SLA), чем диких мух типа. Используя эту новую систему, мы смогли обнаружить, что БС Mutanт взрыва бессмысленно (BSS) имеет более низкие уровни разведочного передвижения в новой среде, чем мух дикого типа. Кроме того, система была использована для выявления, что метформин препарат, который обычно используется для лечения диабета типа II, снижает интенсивность SLA в BS мутантов.
Introduction
Учитывая короткий срок службы и надежные генетические инструменты, доступные, дрозофилы является отличным модельной системой для исследования этиологии различных заболеваний и базовый физиологию различных биологических процессов. Во многих случаях это выгодно для измерения эффектов, что поведенческие, генетические или фармакологические манипуляции имеют на передвижения в этих модельных организмов 1,2.
Существуют различные методы, которые обычно используются для измерения движения летать в двух измерениях 3-7. Эти системы могут поддерживать отслеживание нескольких мух одновременно и может измерять скорости, записывать длину пути и записать процент времени муха потратил двигаться. Они были использованы для изучения движение в различных контекстах, включая воздействию препаратов на передвижения и сексуальной диморфного природы летучей движения 6-9. Основным недостатком этих систем является стоимость слежения системтемпера или соответствующего программного обеспечения и камеры. В некоторых случаях это может работать в тысячи долларов. Стоимость составляет особый интерес для лаборатории, которые должны бы только ограниченное использование такой системы, например, количественной локомотивных модели вновь изолирован мутанта.
Более простой, но менее надежный метод заключается в использовании системы, которые фиксируют движение, основанное на том, сколько раз муха пересекает инфракрасный путь к световой луч, который помещен в середине закрытой трубе 10,11. Хотя такие системы может дать ценную информацию о передвижении и сон-бодрствование циклов, они могут больше или меньше сметной движения, потому что они не в состоянии захватить фактический путь лету. Например, мухи, которые проявляют значительный движение на концах трубки будет зарегистрироваться в качестве низкую движение летит хотя дополнительные методы высокого разрешения были использованы, чтобы попытаться обойти эти ограничения 12.
Проще и еще дешевле поднимаются устройства, которые измеряют geotaxiсек, движение вверх мух, через одну трубку или серии труб 2,13. Хотя такие системы дешевы и можно легко определить geotaxis дефекты, они не в состоянии захватить многие другие аспекты движения, которые будут представлять интерес для исследователей.
Для многих лабораториях, недорогой системы тщательный анализ, который прост в настройке и эксплуатации будет выгодно инструмент для характеристики поведенческих различий в дрозофилы штаммов. Здесь мы опишем анализ, который может быть установлен вверх в течение менее двух сотен долларов и способен дать информацию о пути, скорости и продолжительности движения мухи. Чтобы продемонстрировать эффективность анализа, приведены данные, показывающие, что он может быть использован для идентификации; 1) дефект опорно-двигательного аппарата в Bang-чувствительный (BS) мутанта, которое подвержено припадков и 2) способности метформина наркотиков, которые обычно используется для лечения диабета типа II, чтобы уменьшить интенсивность захват как деятельности (SLA) яп две BS мутанты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка личности Мухи для передвижения Пробирной
- Передача летит аккуратным постукиванием на отдельные пустые флаконы и крышки флаконов с ватным тампоном. Разрешить мухи сидеть спокойно 20-30 минут до наблюдения. Важно не обезболить мух в пределах часа до наблюдения за поведением, как предыдущие исследования показали экспозиции анестезия может изменить поведение по сравнению с наркозу мух 14.
- Слегка постучите муху из флакона и поместить отдельные мух под диаметром 5 см Петри охватывают (высокий 5 мм) с небольшими разрезами, чтобы воздушный канал. Освещать снизу и наблюдать мух помощью веб-камеры, установленный над чашкой Петри.
2. Подготовка личности Мухи об изъятии Пробирной
- Поток двухдневные старые припадок чувствительные мух либо стандартные дрожжей / фуражное зерно / агар СМИ или стандартные СМИ смешивают непосредственно с наркотиками. Для приведенных данных, мухи питались либо 1 Перейдитее стандартные СМИ или 1 г стандартных СМИ смешанных с 25 мг метформина.
- После мухи накормили в течение двух дней на средства массовой информации или средства массовой информации, плюс лекарства, передавать их, осторожно нажав на отдельных пустых флаконов и крышки флаконов с ватным тампоном. Разрешить мухи сидеть спокойно в течение 20 мин до наблюдения. Важно не обезболить мух в пределах часа до наблюдения за поведением, как предыдущие исследования показали экспозиции анестезия может изменить поведение по сравнению с наркозу мух 14.
- Вихревые отдельные пробирки, содержащие один муху на лабораторном Вортекс используя максимальные установки для 10 сек. Поместите иммобилизованного муху на пустой белый лист бумаги прямо под веб-камеры, установленной над бумаги.
3. Запись видео
- Запишите движение или SLA с помощью программного обеспечения HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Эта программа использует веб-камеру длязахвата изображений, основанные на пользовательских настроек.
- Выберите покадровой изображений опцию на вкладке Capture, Когда откроется окно, выберите веб-камера в качестве устройства захвата. Для большинства экспериментов размер видео кадра 640 х 480 является адекватной.
- Выберите Intel IYUV кодек для сжатия и выберите 0,1 сек / кадр для захвата анализа или выбрать 0,1-0,5 сек / кадр для движения анализа. На вкладке Дополнительно выберите создать. Файл изображения BMP для каждого захвата и выберите папку для программы для хранения изображений, которые он принимает (стек изображения).
- Наведите мертвую муху на листе бумаги. Кликните на окне параметров видео и настроить параметры на вкладке Параметры устройства так, чтобы было ярко-белый фон и четкий контраст с темным лету.
- Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать запись. После того, как срок окончания записи, нажмите кнопку остановки. Теперь Стек изображение должно быть в папке, выбранной. Примечание: Прежде чем начать запись, убедитесь, что следуюдер выбран для стека изображений пуст.
4. Анализ данных с помощью ImageJ
- Free Image программное обеспечение для обработки ImageJ Open НИЗ, который может быть загружен в http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Примечание: В дополнение к загрузке программы, Multitracker плагин должен быть загружен и установлен, как указано в http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
- Импорт стека изображений в ImageJ, нажав на вкладке Файл, а затем выбрав Импорт → последовательность изображения.
- Выберите папку, содержащую стека изображений, выделите одно из изображений и выберите открытым. Диалоговое окно Параметры последовательности откроется. Нажмите Сортировка имена численно, а затем выберите ОК и стек изображения будут загружены в ImageJ.
- Пороговые все изображения так, чтобы каждый состоит из белом фоне с муха бытьпреобразуется в черную точку. Чтобы начать этот процесс, преобразовать изображение в 8-битном формате, выбрав Тип → 8 бит на вкладке Image.
- Перейдите на вкладку Image еще раз и выберите Настройка → Порог. Это откроет диалоговое окно Threshold, в котором порог отсечения точка может быть настроена.
- Сканирование через образы, чтобы увидеть, есть ли дополнительные черные точки или если кусочек не хватает черную точку. Если это так, то регулировать порог, чтобы облегчить эту проблему. Обычно порог не должны быть скорректированы как программа по умолчанию на достаточный стоимости.
Примечание: Каждый слайд в стеке должны иметь только одной черной точки, представляющие позицию лету. - Выберите применяются в диалоговом окне Threshold и Преобразовать в Маска диалоговое окно откроется. Не выберите любой из вариантов, но просто нажмите кнопку ОК для порога стек изображения.
- После пороговой стек изображения, выделите Multitracker плагин на вкладке Плагины для того, чтобыизмерить движение лету в пикселях. Появится диалоговое окно Объект Tracker.
- Нажмите всех четырех вариантов, приведенных в диалоговом окне, а затем нажмите ОК. Multitracker плагин будет затем приложите координаты в черной точкой в каждом срезе и перечислите их в окне результатов, а также от общей длины пути в пикселях. Окно Пути дает графическое отображение пути муха взял.
- Скопируйте х-и у-координат список из окна Результаты и вставить данные в таблицу Excel. Если какой-либо слайд в стеке не имеет черную точку в нем, программа Multitracker остановится на этом слайде. Если это происходит, необходимо вернуться к шагу 4.2 и повторно пороговое стек для того, чтобы регистры летят, как черная точка на слайде в вопросе.
- Для того чтобы преобразовать пробеги от пикселей см, принять отдельный образ двух точек, которые расположены один см друг от друга на пустой белый лист бумаги.
- Следуйте вышеэтапы (3.1-4.4.2), чтобы определить, X, Y координаты пикселей для двух точек и использовать эту информацию, чтобы определить количество пикселей, соответствующих см. Этот коэффициент используют на стадии пять генерировать данные движения в см. Примечание: После того, как это будет сделано, важно держать камеру, установленной для всех будущих записей. Каждый раз, когда камера перемещается или регулировать, нужно повторить этот шаг для преобразования пикселей в см.
- Длина пути, что порождается Multitracker плагина переоценивает движение, потому что незначительные колебания в положении тела и интенсивности света / отражения будет влиять на размер и центр черной точкой, который создается при пороговой изображения. Этот шум должен быть удален, чтобы получить точную оценку движения лету.
5. Анализ данных с помощью Excel
- Удалить шум из записанных данных путем импорта серию х, у координаты, порожденная пр. MultitrackerОГР А ММЫ в Fly анализ, Excel Visual Basic программы, созданной авторами. (Программа можно получить, связавшись с авторами.)
- Нажмите Нажмите Me кнопку и выберите пороговое значение отсечки. Выберите пороговое значение 0,5 см / сек для анализа SLA или выберите значение между 0,1-0,3 см / сек для анализа движения. Нажмите кнопку ОК, и программа рассчитает скорость, время и расстояние передвижения. Примечание: Программа использует скользящую анализ окно для оценки данных в последовательных 0,5-1,0 сек бункеров и вычисляет скорость в течение этого окна. Все, что выше определенного пользователем отсечки трактуется как движение летучей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Техника, описанная здесь был использован ранее для анализа различий в SLA в дрозофилы BS мутантов 1. Представленные здесь результаты связаны штаммов BS легко потрясли (EAS), Bang бессмысленную (BSS) и техническим нокаутом (ТКО). EAS локус кодирует этаноламин киназы, участвующих в фосфатидилэтаноламином синтеза 15 и TKO локус кодирует митохондриальную riboprotein 16. Мутация BSS является аллель паралитического (пункт) напряжения закрытого канала натрия 17. Аллели, используемые в этом исследовании, были EAS 1, BSS 1 и TKO 25t.
Иллюстрацией эффективности метода для измерения SLA можно увидеть на рисунке 1, на которой изображен длины пути в EAS захват чувствительных управления лету по сравнению с одной, которая была кормили метформин наркотиков. Метформин является бигуанид используется для лечения диабета типа II. Препарат ингибирует митохондриальной дыхательной цепи сложного I, который, с помощью позитивной регуляции AMPK, вызывает увеличение гликолиза и поглощение глюкозы в клетках млекопитающих 18. Предыдущие исследования показали, что метформин активирует гликолитические гены, по-видимому, чтобы компенсировать торможение аэробных метаболических путей 19. Рисунок 2 показывает, что кормление BS мутанты ИА и TKO метформин в течение двух дней (25 мг / г пищи) снижает длину пути SLA .
В дополнение к сокращению длины пути, данные, полученные с помощью этого метода можно использовать для анализа различий в скорости SLA и SLA продолжительности. В этом случае, данные показывают, что SLA продолжительность была значительно снижена (рис. 3) в то время как скорость SLA существенно не изменилась (рис. 4).
Анализ, описанный выше, также могут быть использованы для измерения передвижения за определенный период времени. Рисунок 5 показывает пример пути, пройденного дикого типа Canton-специального (CS) вылет и путь, пройденный в BSS летать над период 15 мин. В то время как движение обеих мух была сосредоточена на краях круговой зоны, муха CS обладают гораздо более высокой передвижение по сравнению с 15-минутного периода записи. Анализ Поэтому полезно в смотреть как количества движения и характера движения мух.
Среднее расстояние, пройденное BSS мух была значительно ниже, чем у CS летит, как показано на рисунке 6. Мало того, что BSS мухи отображения меньше движения, они, как правило, движутся с более медленными скорости. Изменения в скорости движения двух отдельных мух изображены на рисунке 7. Используя эти данные, средняя скорость может быть рассчитана и по сравнению как в F На рис 4 для SLA. На основе представительных мух, показанных на фиг.7, очевидно, что мухи CS имела более частые приступы быстрым движением в то время как РСС мухи было больше приступы бездействия в течение периода, представленного на рисунке.
Рисунок 1. Представительства пути SLA в EAS мутантов и EAS мутантов подается метформин. Индивидуальные полеты были механически потрясен, чтобы побудить SLA. Путь индивидуального лету во время ОАС представлена на рисунке.) Путь ШАЛ мутанта. Б) Путь ШАЛ мутанта кормили метформина. (Бар представляет 1 см).
files/ftp_upload/51460/51460fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51460/51460fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Отдельные мухи были механически шоке, чтобы вызвать SLA. Расстояние муха перемещается во время SLA был использован в качестве меры SLA интенсивности. В обоих BS мутантов обследованных, метформин значительно сократили расстояние переехал. Данные анализировали с использованием теста Манна-Уитни U (* р <0,05; *** р <0,001, N = 15).
Рисунок 3. Отдельные мухи были механически шоке, чтобы вызвать SLA. Время муха провели проходит SLA был использован в качестве меры SLA интенсивности. В обоих BS мутантов обследованных, метформин значительно сократить продолжительность SLA. Данные анализировали с использованием теста Манна-Уитни U (* р <0,05; *** р <0,001, N = 15).
Рисунок 4. Индивидуальные полеты были механически потрясен, чтобы побудить SLA. Средняя скорость лету во время приступа SLA был использован в качестве меры SLA интенсивности. Там не было никаких существенных изменений в средней скорости для двух BS мутантов протестированных при скармливании метформин. Данные анализировали с использованием теста Манна-Уитни U (N = 15).
Рисунок 5. Пути отдельных мух на арене. Следы представляют пути отдельные мухи, проходимые на арене в период мониторинга 15 мин.) Путь активного CS летать с моvement сосредоточены вокруг периферии круглой арене. B) Путь типичного BSS лету. Движение по-прежнему сосредоточены по периферии, но было намного меньше движения по сравнению с CS мух. (Бар представляет 1 см)
Рисунок 6. Муха передвижения при воздействии новой среде. Отдельные мухи помещались в диаметре 5 см арене A (5 мм в высоту) и движения контролировали в течение 15 мин. Путь длины были вычислены для каждого лету и средние длины были взяты для каждого генотипа. РСС мутанты отображается значительное снижение длины пути по сравнению с CS мух. Данные анализировали с использованием теста Манна-Уитни U (** P <0,01, N = 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При рассмотрении опорно-двигательного аппарата или модели движения у дрозофилы, полезно, чтобы иметь возможность извлечь информацию о пройденное расстояние, скорость передвижения и образец движения. Для того чтобы извлечь эту информацию, дорогостоящее оборудование традиционно используется, что часто является чрезмерно высокой для небольших лабораторий или лабораторий, которые хотят использовать такие анализы экономно 4,8,9.
Анализ, описанный здесь, может использоваться, чтобы определить расстояние, пройденное (рис. 2 и 6), скорость движения (рис. 4 и 7) и картина движения (рис. 1 и 5) с использованием оборудования, которое стоит меньше, чем двести долларов . Использование Visual Basic программу Excel мы разработали, серия х, у координаты, порожденная программа ImageJ могут быть проанализированы, чтобы извлечь всю эту информацию. Эта система имеетбыл использован ранее для выявления как генетические и фармакологические супрессоры SLA в захвате чувствительных Drosophila BS мутантов 1.
В то время как система может извлечь ценную информацию, мы проанализировали только один полет в то время. Это может быть существенным недостатком по сравнению с высоко параллельных коммерческих вариантов 4. Multitracker плагин для ImageJ имеет возможность отслеживать несколько объектов одновременно, но мы еще не пробовали этот вариант. По этой двигательной анализа, один муха помещают в чашку Петри пластиковой крышкой. В зависимости от положения камеры, можно снимать несколько чашек Петри сделать параллельные записи. Недостатком является то, что резолюция будет уменьшаться, как веб-камера позиционируется, чтобы взять в более широкое поле. Как это влияет на целостность записи не известно, но более высокого уровня камера будет вариант, если хотели бы продолжить параллельные записи.
Записи годин здесь ограничены до 15 мин, но это можно делать более длительных записей, если один использует 64-разрядную версию ImageJ. 32-разрядная версия имеет ограничение по памяти, что ограничивает размер файлов можно проанализировать. Для более длинных записей, важно использовать 64-разрядную версию ImageJ.
Одна из самых больших вопросов, касающихся этого метода является необходимость удаления шума из данных, полученных в результате обработки его в программное обеспечение ImageJ. Однако это не является уникальным для этого метода, поскольку подобные шумовые проблемы должны быть решены с другими вариантами записи 3,5,6,8. Как обсуждалось в способах, стационарный муха может отображать незначительные количества движения, когда обрабатываются с помощью ImageJ тем, что программа измеряет движение от центра объекта, который может изменяться даже в неподвижном объекте из-за колебаний света и летать осанку.
Наша программа Visual Basic Excel использует скользящую анализ окно для установки порогового значения для движения. Это thresholD может изменяться в зависимости от анализа. Для анализа приступов, раздвижное окно смотрит на десять очков записи, которая охватывает 1 сек реального времени. Если муха переехал 0,5 см или более в течение этого времени он считается активно захвата. Если оно меньше, то считается в состоянии покоя. При взгляде на нормальное движение, более низкий порог, чтобы определить отсечения, и это должно быть достигнуто с помощью проб и ошибок. Порог 0,1 см / сек использовали в этом исследовании. Лучший способ добиться этого заключается в записи муху в то время как он лежит в течение короткого периода времени, а затем установить граничную так, чтобы он указывает на отсутствие движения во время записи.
В резюме это недорогой метод представляет собой реальную анализа для извлечения значимой информации о различных параметров лету передвижения. Это идеальное метод скрининга, используемый для идентификации, если поведенческая, генетическое или фармакологической манипуляции влияет на передвижения или захват восприимчивости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы также хотели бы выразить благодарность Kris Burner, Стивен МакКинни, Лаура Тобина, Дженни Gilbreath, Эшли Olley, Меган Хоффер, и Меган Хайда за их работу в тонкой настройки этого анализа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
- Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
- Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
- Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
- Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
- Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
- Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
- Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
- Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
- Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).
