Summary
ウェブカメラとフリーで安価なソフトウェアプログラムの組み合わせを使用して、 キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）における機関車のパターンは速度、距離、および様々な運動活動の時間差を検出するために分析することができる。
Abstract
ビデオ追跡システムでは、 キイロショウジョウバエの動きを分析し、機関車の挙動の様々な異常を検出するために広く用いられている。これらのシステムは、行動豊富な情報を提供することができるが、これらのシステムのコストと複雑さは、多くのラボのために法外なことができます。我々は、D.メラノガスターにおける移動行動および発作の動きを測定するための低コストのアッセイを開発した。システムは、距離を移動追跡するために、安価でフリーソフトウェアの組み合わせを用いて処理することができる画像を取り込むウェブカメラを使用して、指定された時間スパンの間の移動と移動の持続時間の平均速度。このシステムの有用性を実証するために、我々は、Dのグループが3〜10倍の影響を受けやすく、発作様活性に（SLA）は、野生型のハエよりも変異体、ビッグバンの影響を受けやすい（BS）中風を、 キイロ調べた。この小説のシステムを使用して、我々は、BSムタンことを検出することができたT バン無意味な（BSS）は、野生型のハエより新奇環境における探索歩行の低いレベルを示す。加えて、システムは、一般にタイプII糖尿病を治療するために使用される薬物はメトホルミン、BS変異体におけるSLAの強度を減少させることを同定した。
Introduction
その短い寿命と使用可能な堅牢な遺伝的なツールを考えると、 キイロショウジョウバエは、様々な疾患の病因および様々な生物学的プロセスの根底にある生理学を調査するための優れたモデルシステムです。多くの場合、それは、行動遺伝的または薬理学的操作は、これらのモデル生物1,2における移動に与える影響を測定することが有利で ある。
一般に二次元3-7のフライ運動を測定するために使用される様々な方法がある。これらのシステムは、同時に複数のハエの追跡をサポートすることができ、速度、記録的経路長を測定し、その場を移動に費やした時間の割合を記録することができます。彼らは移動し、ハエの動き6-9の性二形自然に対する薬物の効果を含む様々な状況での動きを研究するために使用されている。これらのシステムの主な欠点は、トラッキングsysのコストであるTEMまたは対応するソフトウェアとカメラ。場合によっては、これは数千ドルに実行することができます。コストは新たに単離された変異体の機関車のパターンを定量化、例えば、このようなシステムの限定的な使用を必要とする実験室のための特別な関心事である。
より単純な、あまりロバストな方法は、レコードの動きがフライ閉鎖チューブ10,11の中間に配置される赤外光ビーム経路を横切る回数に基づくシステムを使用することである。このようなシステムは運動と睡眠 - 覚醒サイクルに関する貴重情報を与えることができますが、彼らはその場の実際のパスをキャプチャすることができない上や見積もりの動きの下で可能性があるため。追加の高解像度の方法は、これらの制限12を試してみて、回避するために使用されているが、たとえば、チューブの両端にかなりの動きを示すハエなどの低運動を登録しますが飛ぶ。
単純で安価、まだgeotaxiを測定する装置を登るしているS、単一のチューブまたはチューブ2,13の一連のハエの上方への移動、。このようなシステムは安価であり、容易に走地性欠陥を識別することができるが、それらは研究者にとって興味深いであろう動きの他の多くの側面を捕捉することができない。
多くのラボでは、アップを設定し、操作が簡単で低コストの堅牢な分析システムは、 キイロショウジョウバエ株における動作の違いを特徴づけるための有利なツールになるだろう。ここでは、より少ない200ドルのために、セットアップし、ハエの移動経路、速度と持続時間についての情報を与えることができることができるアッセイを記述します。アッセイの有効性を実証するために、我々はそれを識別するために使用することができることを示すデータを提示し、発作及び薬物メトホルミン2）能力に対して感受性であるバン感受性（BS）変異体における1）自発運動欠損する一般的に発作様活性（SLA）は、iの強度を減らすために、II型糖尿病を治療するために使用されているN 2、BS変異体。
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Protocol
1。個々の製造は、歩行アッセイのためのハエ
- 転送は優しく、個々の空のバイアルを活用し、綿栓でバイアルをキャップで飛ぶ。ハエは、観察の前に邪魔されずに20〜30分に座ることができます。それは、これまでの研究は、無麻酔ハエ14と比較して、麻酔露出が動作を変更することができます発見したように前に行動観察時間以内にハエを麻酔しないことが重要です。
- 静かにバイアルからハエをタップし、空気通路を可能にするために、小さなスリット（5ミリメートル高）直径5cmのペトリ皿のカバーの下に個々のハエを置く。下から照明し、ペトリ皿の上に取り付けられたカメラを使ってハエを観察します。
2。個々の準備は、発作アッセイのためにハエ
- 2日齢の発作に敏感なハエを養う標準酵母/コーンミール/寒天培地または標準のメディアのいずれかの薬剤と直接混合。ここに提示されたデータについては、ハエは1合のどちらかを与えたfは、標準培地または標準培地1gのメトホルミン25mgの混合した。
- ハエは、個々の空のバイアルに優しいタップして、それらを転送し、綿栓でバイアル、キャップ、メディアまたはメディア+薬剤に2日間飼育した後。ハエは、観察前に20分間静置することができます。それは、これまでの研究は、無麻酔ハエ14と比較して、麻酔露出が動作を変更することができます発見したように前に行動観察時間以内にハエを麻酔しないことが重要です。
- 10秒間、最高の設定を使用してラボボルテックス上で単一のフライを含む渦個々のバイアル。直接紙の上に取り付けウェブカメラ下の白紙白いシートに固定化されたフライを置きます。
3。録画
- HandyAviソフトウェアプログラムを用いて、移動またはSLA録音http://www.azcendant.com/download.htmを 。このプログラムは、Webカメラを使用していますユーザ設定に基づいて画像を取り込む。
- ウィンドウが開いたら、[キャプチャ]タブの下のタイムラプス画像のオプションを選択して、キャプチャデバイスとしてWebカメラを選択します。ほとんどの実験のために640×480のビデオフレームサイズが適切である。
- 圧縮のためにインテルIYUVコーデックを選択して、発作のアッセイのための0.1秒/フレームを選択するか、移動アッセイのための0.1〜0.5秒/フレームを選択します。 [詳細設定]タブでは、各キャプチャに。BMPイメージファイルを作成する]を選択し、それが（画像スタック）かかり、画像を保存するためのプログラムのフォルダを選択します。
- 紙に死んだハエを配置します。ビデオの設定]ボックスをクリックして、明るい白の背景と暗いフライとの明確なコントラストが存在するようにデバイスの設定]タブの下で設定を調整します。
- 録音を開始し、スタートボタンをクリックします。記録期間が終了すると、[停止]ボタンをクリックします。画像スタックは、現在選択されたフォルダにある必要があります。注意：録音する前に、必ずFOL画像スタックのために選択されたデルは空です。
4。 ImageJのを使用したデータ分析
- でダウンロードすることができるオープンNIHのない画像処理ソフトImageJを、 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html 。注：で示されるようにプログラムをダウンロードすることに加えて、Multitrackerプラグインは、ダウンロードしてインストールする必要がありhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html 。
- [ファイル]タブをクリックし、[インポート]→[画像シーケンスを選択することにより、ImageJのに画像スタックをインポートします。
- 画像スタックが含まれているフォルダを選択し、画像のいずれかをハイライト表示し、[開く]を選択します。シーケンスのオプションダイアログボックスが開きます。数値的にソート名をクリックし、[OK]を選択し、画像スタックはImageJのにロードされます。
- しきい値すべての画像はそれぞれ、フライた状態で、白い背景で構成されていますように、黒い点に換算。このプロセスを開始するには、画像は画像タブの下にタイプ→8ビットを選択することにより、8ビットの形式に変換します。
- 再び[イメージ]タブをクリックし、→しきい値を調整を選択します。これは、ポイントを遮断しきい値を調整することが可能なしきい値ダイアログボックスを開きます。
- 余分な黒い点があるかどうか、スライスは黒い点が欠けているかどうかを確認するために、画像をスキャン。この場合、問題を軽減するために閾値を調整する。通常、しきい値は、適切な値にプログラムのデフォルトのように調整する必要はありません。
注：スタック内のすべてのスライドがハエの位置を表すだけで1黒い点があるはずです。 - しきい値ダイアログボックスで、[適用]を選択し、ダイアログボックスをマスクに変換が開きます。いずれかのオプションをクリックしますが、単純にしきい値に画像スタックを[OK]をクリックしないでください。
- 画像スタックを閾値た後、するために、プラグイン]タブでMultitrackerプラグインを選択ピクセル単位でハエの動きを測定します。オブジェクトトラッカーダイアログボックスが表示されます。
- ダイアログボックスで指定された4つのオプションのすべてをクリックし、[OK]を選択します。 Multitrackerプラグインは、各スライスに黒い点に座標を添付し、結果ウィンドウだけでなく、ピクセル単位での総経路長は、これらのリストが表示されます。パスウィンドウはハエがかかったパスのグラフィック表示を提供します。
- 結果ウィンドウからx座標とy座標のリストをコピーして、Excelスプレッドシートにデータを貼り付ける。スタック内の任意のスライドには、その中に黒い点がない場合、Multitrackerプログラムがそのスライドで停止します。この問題が発生した場合、それは問題のスライド内の黒い点のようにフライレジスタのことを確認するために4.2および再しきい値スタックの処理に戻ることが必要である。
- 白紙白いワンピースに1センチメートル離れている2ドットの別々の画像を撮影すると、パスがCMにピクセルから長変換するために。
- 上記に従ってください工程（3.1-4.4.2）において、xを決定するために、yのピクセルは、2つの点の座標とセンチメートルに対応する画素の数を決定するためにこの情報を使用する。この変換係数は、cm単位の動きデータを生成するステップ5で使用される。注：これが行われると、それはすべての将来の記録のために固定カメラを保つことが重要である。カメラが移動または調整されるたびに、一cmの画素を変換するためにこの手順を繰り返す必要がある。
- 身体位置および光強度/反射のわずかな変動は、画像を閾値処理するときに生成されるブラックドットのサイズと中心に影響するため、Multitrackerプラグインによって生成されるパスの長さは、動きを過大評価する。このノイズは、ハエの動きを正確に推定を得るために除去されなければならない。
5。 Excelを使用したデータ分析
- Xシリーズをインポートすることで、記録されたデータからノイズを除去、YはMultitracker PRによって生成された座標フライ分析、著者が作成したExcelのVisual Basicプログラムにogram。 （プログラムは、著者に接触させることによって提供されています。）
- ミーボタンをクリックし、カットオフしきい値を選択します。 SLAの分析0.5 cm /秒のしきい値を選択するか、運動解析のための0.1〜0.3センチメートル/秒の間の値を選択します。 [OK]をクリックすると、プログラムは、速度、時間と移動距離を計算します。注意：このプログラムは、順次0.5〜1.0秒のビン内のデータを評価するためにスライディングウィンドウ解析を使用し、そのウィンドウの間に速度を算出する。ユーザー定義のカットオフ以上のものは、フライの動きとして扱われます。
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Representative Results
ここで説明する技術は、 ショウジョウバエ BS変異体1におけるSLAの違いを分析するために以前に使用されている。ここに提示された結果を簡単にショックを受け 、BS株（EAS）、ビッグバン無意味（BSS）、およびテクニカルノックアウト（TKO）を伴う。 EAS座は、ホスファチジルエタノールアミン合成15に関与エタノールアミンキナーゼをコードし、TKO座は、ミトコンドリアriboprotein 16をコードしている。 BSS変異は、 麻痺 （ パラ ）電位依存性ナトリウムチャネル17の対立遺伝子である。本研究で用いた対立遺伝子は、EAS 1、BSS 1とTKOの25トンだった。
SLAを測定するための方法の有効性の説明図では1つに比較して、EASの発作感受性対照ハエの経路長を示す図1に見られるすなわち、薬剤メトホルミンを供給された。メトホルミンは、II型糖尿病を治療するために使用されるビグアニドである。薬剤は、ミトコンドリア呼吸鎖複合体Iを阻害する、AMPKのアップレギュレーションを経由して 、哺乳類細胞での18解糖およびグルコース取り込みの増加をトリガする。以前の研究は、メトホルミンが好気的代謝の阻害19パスウェイを補償するために、おそらく、解糖系遺伝子をアップレギュレートすることを見出した。 図2（食品を25mg / g）の二日間BS変異体のEASのとTKOメトホルミンを供給するSLAの経路長を減少させることを実証。
経路長を減少させることに加えて、この方法によって生成されたデータは、SLA速度とSLA持続時間の差を分析するために使用することができる。この場合、データはSLA速度が大幅に変更されなかったSLA期間が有意に（ 図4）（図3）に減少したことを示している。
また、定義された期間にわたって運動を測定するために使用することができるアッセイは、上述した図5（CS）ハエとBSSによってトラバースされる経路をかけて飛ぶ野生型キャントン-スペシャルによってトラバースされる経路の一例を示す図15分。両方のハエの移動は円形領域のエッジに濃縮しながら、CSフライは、15分間の記録期間にわたって多くの運動を示した。アッセイは、移動量やハエの動きのパターンの両方を見ている中で有用である。
bssのハエによって横断平均距離は、 図6で示すように、CSは、ハエのそれよりも有意に低かった。 BSSのハエは、彼らがより遅い速度で移動する傾向にあった、より少ない動きを表示しただけではなく。二つの個々のハエの移動速度の変化を図7に示されている。このデータを使用して、平均速度は、Fのように計算し、比較することができる SLAのためのigure 4。 図7に示す代表的なハエに基づいて、bssのハエは、図に示される非活動期間中にそれ以上の発作を有していたCSのハエが高速移動のより頻繁な発作を有したことは明らかである。
図1。 EASの変異体とEAS変異体におけるSLAの代表的なパスは、メトホルミンを供給した。個々のハエは、SLAを誘導するために、機械的にショックを受けました。 EAS変異体供給メトホルミンのEAS変異体のSLAの中の個々のハエのパスは図に示されている。A）のパスを指定します。B）にパス。 （バーは、1cmを表します）。
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図2。個々のハエは、SLAを誘導するのに機械的ショックを与えた。フライSLAの間の移動距離がSLA強度の尺度として用いた。調べた両方のBS変異体では、メトホルミンが大幅に移動した距離を減少させた。データは、マンホイットニーU検定を用いて分析した（*はp <0.05、***はp <0.001であり、n = 15）。
図3。個々のハエは、SLAを誘導するのに機械的ショックを与えた。フライSLAをSLA強度の尺度として用いた経費やされた時間。調べた両方のBS変異体では、メトホルミンが大幅SLA時間を減少させた。データは、マンホイットニーU検定を用いて分析した（*はp <0.05、***はp <0.001であり、n = 15）。
図4。個々のハエは、SLAを誘導するのに機械的ショックを与えた。SLAの試合中のハエの平均速度は、SLA強度の尺度として用いた。メトホルミンを与えたときにテスト2、BS変異体のための平均速度に有意な変化はなかった。データは、マンホイットニーU検定た（n = 15）を用いて分析した。
図5。アリーナ内の個々のハエのパス。トレースは、個々のハエが15分の監視期間中にアリーナで横断パスを表す。a）活性、CSのパスは、MOで飛ぶvement、円形競技場の周辺に集中し、代表的なBSSフライの B）のパスが。動きはまだ周辺に集中したが、CSのハエに比べてはるかに少ない動きがありました。 （バーは、1cmを示す）
図6。新しい環境にさらされたときに移動を飛ぶ。個々のハエを直径5cmの分野（高さ5mm）中に入れ、移動を15分間モニターした。経路長は、各フライについて計算し、平均長さは、各遺伝子型のために採取した。 bssの変異体は、CSのハエと比較して、経路長の有意な減少を示した。データは、マンホイットニーU検定を用いて分析した（**はp <0.01であり、n = 10）。
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Discussion
ショウジョウバエにおける自発運動又は運動パターンを検査する場合には、走行距離に関する情報、移動速度および移動パターンを抽出できることが有用である。この情報を抽出するために、高価な機器は、伝統的に、多くの場合、難4,8,9ようなアッセイを使用したい小さいラボやラボ法外である使用されている。
アッセイは、ここで説明した距離を決定するために使用することができる（ 図2および6）、移動（ 図4および7）の速度及び移動（ 図1および図5）未満で200ドルの費用使用する機器のパターンを評価し。我々が開発したExcelのVisual Basicプログラムは、xの系列を用い、ImageJのプログラムによって生成されたy座標は、このすべての情報を抽出するために分析することができる。このシステムはあります発作に敏感なショウジョウバエのBS変異体1に、SLAの遺伝的および薬理学的抑制の両方を識別するために以前に使用されて。
システムは、貴重な情報を抽出することができますが、我々は一度に1フライを分析した。これは高度な並列商業オプション4と比較して、重大な欠点であることができる。 MultitrackerプラグインImageJのためには、同時に複数のオブジェクトを追跡する機能を持っているが、我々は、このオプションを試していない。この運動アッセイのために、単一のハエをプラスチックのペトリ皿のふたの下に配置される。カメラの位置に応じて、1は、パラレル録音を行うために、複数のペトリ皿を撮影できた。欠点は、ウェブカメラは、より大きなフィールドを取り込むように配置されているように、解像度が低下することである。これはどのように記録の完全性に影響を与えることは知られていないが、1は、パラレル録音を追求したい場合はハイエンドのカメラはオプションになります。
レコーディングDここ一方は15分に制限されているが、一つのImageJの64ビットバージョンを使用する場合には、より長い記録を行うことができる。 32ビット版は、1が分析できるファイルのサイズを制限し、メモリの制限があります。長いレコーディングのためには、ImageJの64ビットバージョンを使用することが不可欠である。
この方法に関する最大の問題の1つは、ImageJソフトウェアでそれを処理することによって生成されたデータからノイズを除去する必要があることである。同じようなノイズの問題は、他の記録オプション3,5,6,8で解決しなければならないしかし、これは、このメソッドに固有のものではありません。方法で説明したようにはImageJを通して処理されるプログラムは、光の変動であっても静止している物体に変化し、姿勢を飛ぶことができるオブジェクトの中心からの移動を測定するため、静止したハエは動きの少量が表示される場合があります。
私たちのVisual BasicのExcelプログラムは、運動のためのしきい値を設定するためにスライディングウィンドウ解析を使用しています。このthresholDは、アッセイによって異なる場合があります。発作分析のために、スライディングウィンドウは、実時間の1秒にまたがる10の記録項目を確認しています。フライこの間0.5センチメートル以上移動した場合、それは能動的に焼付きであると考えられる。それが小さい場合には、安静時であると考えられる。正常な動きを見ると、下側閾値は、カットオフを決定するために必要な、これは、試行錯誤を介して達成されなければならない。 0.1センチメートル/秒の閾値は、この研究で使用した。これを達成する最良の方法は、時間の短い期間のために静止している間にその場を記録し、記録時に全く動きがないことを示すように、カットオフを調整することである。
要約すると、この低コストの方法は、フライ運動の様々なパラメータに関する意味のある情報を抽出するための実行可能なアッセイを表す。それは、行動遺伝的または薬理学的操作が歩行または発作感受性に影響がある場合識別するために使用するのに理想的なスクリーニング技術である。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らはまた、微調整での自分の仕事は、このアッセイのためのクリス·バーナー、スティーブン·マッキニー、ローラ·トービン、ジェニーGilbreath、アシュリーOlley、ミーガンホッファー、そしてミーガンハイドへの感謝の意を表したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
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