Summary
Utilizzando una webcam e una combinazione di programmi di software libero e poco costosi, i modelli di locomotive in Drosophila melanogaster possono essere analizzati per rilevare le differenze nella velocità, la distanza e il tempo delle diverse attività motorie.
Abstract
Sistemi di monitoraggio video sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Drosophila melanogaster movimento e rilevare diverse anomalie nel comportamento locomotiva. Mentre questi sistemi sono in grado di fornire una serie di informazioni comportamentali, il costo e la complessità di questi sistemi possono essere proibitivo per molti laboratori. Abbiamo sviluppato un saggio a basso costo per misurare il comportamento locomotiva e il movimento sequestro in D. melanogaster. Il sistema utilizza una webcam per catturare immagini che possono essere elaborati utilizzando una combinazione di software poco costoso e libero di seguire la distanza percorsa, la velocità media di movimento e la durata del movimento durante un arco di tempo specificato. Per dimostrare l'utilità di questo sistema, abbiamo esaminato un gruppo di D. melanogaster mutanti, i (BS) paralitici Bang-sensibili, che sono 3-10 volte più suscettibili di attività convulsiva-like (SLA) di tipo mosche selvatici. Usando questo nuovo sistema, siamo stati in grado di rilevare che il BS Mutant insensata botto (BSS) presenta livelli più bassi di locomozione esplorativo in un nuovo ambiente di tipo selvaggio mosche. Inoltre, il sistema è stato utilizzato per identificare il farmaco metformina, che è comunemente usato per trattare il diabete di tipo II, riduce l'intensità della SLA nei mutanti BS.
Introduction
Data la sua breve durata e gli strumenti genetici robusti disponibili, Drosophila melanogaster è un ottimo sistema modello per studiare l'eziologia di varie malattie e la fisiologia alla base dei vari processi biologici. In molti casi, è vantaggioso misurare gli effetti che le manipolazioni comportamentali, genetici o farmacologici hanno sulla locomozione in questi organismi modello 1,2.
Ci sono una varietà di metodi che sono comunemente usati per misurare il movimento mosca in due dimensioni 3-7. Questi sistemi possono supportare il tracciamento di più mosche contemporaneamente e in grado di misurare velocità, record di lunghezza di percorso e registrare la percentuale di tempo una mosca ha trascorso in movimento. Essi sono stati utilizzati per studiare il movimento in una varietà di contesti inclusi gli effetti dei farmaci sulla locomozione e la natura dimorfismo sessuale della mosca movimento 6-9. Il principale svantaggio di questi sistemi è il costo dei sistemi di rilevamentotem o il relativo software e la fotocamera. In alcuni casi, questo può essere eseguito in migliaia di dollari. Il costo è una preoccupazione particolare per un laboratorio che avrebbe bisogno solo di un uso limitato di tale sistema, per esempio, quantificare i modelli locomotiva di un mutante di recente isolato.
Un metodo più semplice ma meno robusto è quello di utilizzare sistemi che registrare il movimento in base a quante volte una mosca attraversa un percorso fascio di luce infrarossa che viene inserito nel mezzo di un tubo chiuso 10,11. Mentre tali sistemi possono dare informazioni preziose su cicli di movimento e di sonno-veglia, possono sopra o sotto il movimento stima perché non riescono a catturare il percorso effettivo della mosca. Ad esempio, le mosche che presentano un notevole movimento alle estremità del tubo registreranno a partire circolazione vola anche ulteriori metodi ad alta risoluzione sono stati utilizzati per cercare di aggirare queste limitazioni 12.
Più semplice e più economico ancora sono arrampicata dispositivi che misurano geotaxis, il movimento verso l'alto della linea, attraverso un unico tubo o una serie di tubi 2,13. Mentre questi sistemi sono economici e possono facilmente identificare i difetti geotassi, non riescono a catturare molti altri aspetti del movimento che sarebbero di interesse per gli investigatori.
Per molti laboratori, a basso costo robusto sistema di analisi che è semplice da configurare e gestire sarebbe uno strumento vantaggioso per caratterizzare le differenze comportamentali in D. melanogaster ceppi. Qui si descrive un metodo che può essere impostato-up per meno di duecento dollari ed è in grado di dare informazioni sul percorso, la velocità e la durata del movimento della mosca. Per dimostrare l'efficacia del saggio, presentiamo dati che mostrano che esso può essere utilizzato per identificare: 1) un difetto in un locomotore Bang sensibile (BS) mutante che è suscettibile di convulsioni e 2) la capacità del farmaco metformina, che è comunemente usato per trattare il diabete di tipo II, per ridurre l'intensità di attività di sequestro-like (SLA) in due mutanti BS.
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Protocol
1. Di singoli Mosche per Locomotion Assay
- Trasferimento vola toccando delicatamente in singoli flaconi vuoti e tappare le fiale con un tampone di cotone. Consentire mosche di sedersi indisturbati 20-30 minuti prima osservazione. È importante non anestetizzare linea entro le ore prima osservazione del comportamento come studi precedenti hanno trovato esposizione anestesia può alterare il comportamento rispetto alla linea non anestetizzati 14.
- Battere delicatamente la mosca dal flaconcino e posizionare singoli mosche sotto un coperchio piatto di Petri diametro 5 centimetri (altezza 5 mm) con piccole feritoie per consentire il passaggio dell'aria. Illuminate da sotto e osservare in linea utilizzando una webcam montata sopra la piastra di Petri.
2. Di singoli Mosche per il sequestro Assay
- Concime due giorni vecchi mosche sensibili sequestro sia i media lievito / farina di mais / agar standard o supporti standard, miscelati direttamente con la droga. Per i dati qui presentati, le mosche sono stati alimentati sia 1 gof supporti standard o 1 g di supporti standard, mescolato con 25 mg di metformina.
- Dopo le mosche hanno alimentato per due giorni sul supporto o, più droga, trasferirli picchiettando leggermente in singoli flaconi vuoti e tappare le fiale con un tampone di cotone. Lasciare le mosche a sedere indisturbato per 20 minuti prima osservazione. È importante non anestetizzare linea entro le ore prima osservazione del comportamento come studi precedenti hanno trovato esposizione anestesia può alterare il comportamento rispetto alla linea non anestetizzati 14.
- Vortex fiale individuali contenenti una mosca su un vortex laboratorio utilizzando il valore massimo per 10 sec. Posizionare la mosca immobilizzato su un foglio bianco di carta bianco direttamente sotto una webcam montato sopra la carta.
3. Video Recording
- Registrare il movimento o SLA utilizzando il programma software HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Questo programma utilizza la webcamcatturare le immagini basate sulle impostazioni utente.
- Selezionare l'opzione di immagini Time-Lapse nella scheda Capture, Quando si apre la finestra, selezionare la webcam come dispositivo di acquisizione. Per la maggior parte degli esperimenti la dimensione del frame video 640 x 480 è sufficiente.
- Selezionare Intel IYUV codec per la compressione e scegli 0,1 sec / cornice per il saggio sequestro o scegliere 0,1-0,5 sec / cornice per l'analisi del movimento. Sotto la scheda Avanzate, selezionare creare un file immagine. Bmp per ogni cattura e selezionare una cartella per il programma per memorizzare le immagini che ci vuole (la pila di immagini).
- Posizionare una mosca morta sul foglio di carta. Fare clic sulla casella Impostazioni video e regolare le impostazioni nella scheda Impostazioni periferica in modo che ci sia uno sfondo bianco brillante e un chiaro contrasto con la mosca più scura.
- Fare clic sul pulsante Start per avviare la registrazione. Una volta che il periodo di registrazione è terminata, fare clic sul pulsante di arresto. Lo stack immagine dovrebbe essere nella cartella selezionata. Nota: Prima della registrazione, verificare che il folder selezionato per la pila di immagini è vuota.
4. Analisi dei dati utilizzando ImageJ
- Immagine software di elaborazione ImageJ Open NIH, che può essere scaricato a http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Nota: Oltre al download del programma, il plug-in Multitracker deve essere scaricato e installato come indicato al http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
- Importare la serie di immagini in ImageJ facendo clic sulla scheda File e quindi selezionare Importa → sequenza di immagine.
- Selezionare la cartella che contiene la pila di immagini, evidenziare una delle immagini e selezionare Apri. Una finestra di dialogo Sequence Options si aprirà. Fare clic sui nomi ordine numerico e poi selezionare OK e lo stack immagine verrà caricata in ImageJ.
- Soglia tutte le immagini in modo che ciascuno costituito da uno sfondo bianco con la mosca essereconvertito in un punto nero. Per iniziare questo processo, convertire l'immagine in un formato a 8 bit selezionando Tipo → 8 bit nella scheda Immagine.
- Fare clic sulla scheda Immagine nuovo e selezionare Regola → Soglia. Si aprirà la finestra di dialogo Soglia in cui la soglia tagliato punto può essere regolato.
- Scansione attraverso le immagini per vedere se ci sono punti neri in più o se una fetta manca un punto nero. Se questo è il caso, regolare la soglia per alleviare il problema. Di solito la soglia non deve essere regolata come le impostazioni predefinite del programma per un valore adeguato.
Nota: Ogni diapositiva della catasta deve avere solo un puntino nero che rappresenta la posizione della mosca. - Selezionare Applica nella finestra di dialogo Soglia e Converti in maschera finestra di dialogo si aprirà. Non fare clic su una delle opzioni, ma è sufficiente fare clic su OK per soglia serie di immagini.
- Dopo sogliatura la pila di immagini, selezionare la Multitracker plug-in sotto la linguetta Plugins permisurare il movimento della mosca in pixel. Viene visualizzata la finestra di dialogo Tracker oggetto.
- Fare clic su tutte le quattro opzioni fornite nella finestra di dialogo e quindi selezionare OK. Il plug-in Multitracker sarà quindi fissare le coordinate per il punto nero in ogni fetta ed elencare questi nella finestra dei risultati, nonché la lunghezza del percorso totale in pixel. La finestra Percorsi fornisce una visualizzazione grafica del percorso fly ha preso.
- Copiare il x e y-coordinata list dalla finestra Risultati e incollare i dati in un foglio Excel. Se qualsiasi diapositiva della pila non ha un punto nero, il programma Multitracker arresterà a tale diapositiva. In questo caso, è necessario tornare al passo 4.2 e ri-soglia stack per garantire che i registri volare come un punto nero nella diapositiva in questione.
- Per convertire il tracciato lunghezze da pixel a cm, prendere un'immagine separata di due punti a distanza di un cm separatamente su un pezzo di carta bianca.
- Seguire le indicazioni soprapassi (3.1-4.4.2), per determinare le coordinate x, y del pixel per i due punti e utilizzare queste informazioni per determinare il numero di pixel corrispondenti a un cm. Questo fattore di conversione viene utilizzata nel passaggio cinque per generare dati di movimento in cm. Nota: Una volta fatto questo, è importante mantenere la telecamera fissa per tutte le registrazioni future. Ogni volta che la fotocamera viene spostata o regolata, si ha la necessità di ripetere questo passo per convertire i pixel per cm.
- La lunghezza del percorso che viene generato dal plug-in Multitracker sopravvaluta movimento perché lievi fluttuazioni nella posizione del corpo e intensità luminosa / riflessione influenzeranno le dimensioni e il centro del punto nero che viene generato quando sogliatura le immagini. Questo rumore deve essere rimosso al fine di ottenere una stima accurata del movimento mosca.
5. Analisi dei dati con Excel
- Rimuovere il rumore dai dati registrati importando la serie di coordinate x, y generato dal pr MultitrackerOgram in Analisi Fly, un programma Visual Basic di Excel creato dagli autori. (Il programma è disponibile contattando gli autori.)
- Fare clic sul Click Me pulsante e selezionare un valore di soglia di cut-off. Selezionare un valore di soglia di 0,5 cm / sec per l'analisi SLA o selezionare un valore compreso tra 0,1-0,3 cm / s per l'analisi del movimento. Fare clic su OK e il programma calcolerà la velocità, il tempo e la distanza di movimento. Nota: Il programma utilizza un'analisi finestra scorrevole per valutare i dati sequenziali 0,5-1,0 sec bidoni e calcola la velocità durante quella finestra. Tutto ciò al di sopra del valore soglia definito dall'utente viene trattato come movimento mosca.
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Representative Results
La tecnica qui descritta è stata utilizzata in precedenza per analizzare differenze di SLA nei mutanti BS Drosophila 1. I risultati qui presentati riguardano i ceppi BS facilmente scioccato (EAS), Bang insensata (BSS), e ko tecnico (TKO). Il locus EAS codifica una chinasi etanolammina coinvolto nella sintesi fosfatidil etanolammina 15 e il locus tko codifica una riboprotein mitocondriale 16. La mutazione bss è un allele del (para) dei canali del sodio voltaggio-dipendenti paralitica 17. Gli alleli utilizzati in questo studio erano EAS 1, BSS 1 e tko 25t.
Un esempio dell'efficacia del metodo per misurare SLA può essere visto in Figura 1, che raffigura la lunghezza del percorso di un controllo fly sequestro sensibile EAS rispetto a unoche è stato alimentato il farmaco metformina. La metformina è un biguanide utilizzato per trattare il diabete di tipo II. Il farmaco inibisce respiratoria mitocondriale complessa catena io, che, attraverso l'up-regulation di AMPK, provoca un aumento della glicolisi e l'assorbimento del glucosio nelle cellule di mammifero 18. Studi precedenti hanno dimostrato che la metformina upregulates geni glicolitici, presumibilmente per compensare l'inibizione del metabolismo aerobico Percorsi di 19. Figura 2 dimostra che alimenta le BS mutanti EAS e TKO metformina per due giorni (25 mg / g di alimento) riduce la lunghezza del percorso SLA .
Oltre a ridurre la lunghezza del percorso, i dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per analizzare le differenze di velocità e durata SLA SLA. In questo caso, i dati indicano che la durata SLA è notevolmente ridotto (Figura 3), mentre la velocità SLA non è stato modificato in modo significativo (Figura 4).
Il test sopra descritto può anche essere usato per misurare la locomozione su un periodo di tempo definito. Figura 5 mostra un esempio di un percorso attraversato da un tipo selvatico Canton-Special (CS) vola e un percorso attraversato da un BSS vola su un periodo di 15 min. Mentre il movimento di entrambi linea è stata concentrata ai bordi della zona circolare, la mosca CS esposto molto più locomozione durante il periodo di registrazione 15 min. Il saggio è quindi utile nel guardare sia la quantità di movimento e il percorso di taglio di linea.
La distanza media percorsa dalla linea BSS era significativamente inferiore a quella del CS vola come indicato dalla Figura 6. Non solo le mosche BSS mostrano meno movimento, tendevano a muoversi con una velocità più lenta. Cambiamenti nella velocità di movimento di due mosche singoli sono descritte nella Figura 7. Utilizzando questi dati, una velocità media può essere calcolata e confrontata come in F IGURA 4 per SLA. Sulla base delle mosche rappresentativi mostrati nella Figura 7, è evidente che in linea CS avuto più frequenti attacchi di movimento veloce, mentre in linea BSS aveva più periodi di inattività durante il periodo rappresentato in figura.
Figura 1. Percorsi rappresentativi di SLA in mutanti EAS e mutanti EAS alimentati metformina. Mosche individuali erano meccanicamente scioccati per indurre SLA. Il percorso di una mosca individuo durante la SLA è rappresentato in figura. A) Percorso di un mutante eas. B) Percorso di eas mutante metformina nutriti. (Bar rappresenta uno centimetri).
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Figura 2. Mosche individuali erano meccanicamente scioccati per indurre SLA. La distanza al volo spostato durante la SLA è stato utilizzato come misura di intensità SLA. In entrambi i mutanti BS esaminati, metformina ha ridotto significativamente la distanza percorsa. I dati sono stati analizzati con il test di Mann-Whitney U (* p <0,05; *** p <0,001, n = 15).
Figura 3. Mosche individuali erano meccanicamente scioccati per indurre SLA. L'ora della mosca speso in fase di SLA è stata utilizzata come misura di intensità SLA. In entrambi i mutanti BS esaminati, metformina ha ridotto significativamente la durata SLA. I dati sono stati analizzati con il test di Mann-Whitney U (* p <0,05; *** p <0,001, n = 15).
Figura 4. Mosche individuali erano meccanicamente scioccati per indurre SLA. La velocità media del volo durante l'incontro di SLA è stata utilizzata come misura di intensità SLA. Non vi è stato alcun cambiamento significativo nella velocità media per i due mutanti BS testate se somministrate metformina. I dati sono stati analizzati con il test di Mann-Whitney U (n = 15).
Figura 5. Percorsi di singoli mosche in campo. Tracce rappresentano i percorsi individuali mosche attraversavano in campo durante il periodo di 15 min di monitoraggio. A) Percorso di un CS attivo volare con la moramento concentrata intorno alla periferia dell'arena circolare. B) Percorso di un tipico mosca bss. Il movimento era ancora concentrata intorno alla periferia, ma c'era molto meno movimento rispetto alle mosche CS. (Bar rappresenta 1 centimetro)
Figura 6. Volare locomozione quando esposti ad un nuovo ambiente. Mosche individuali sono stati collocati in un'arena 5 cm di diametro (5 mm di altezza) e il movimento è stata monitorata per 15 min. Lunghezza dei percorsi sono stati calcolati per ogni volo e le lunghezze medie sono state prese per ogni genotipo. I mutanti BSS visualizzate una significativa riduzione della lunghezza del percorso rispetto alla linea CS. I dati sono stati analizzati con il test di Mann-Whitney U (** p <0,01, n = 10).
Figura 7. Velocità in funzione del tempo durante la locomozione esplorativo di CS (A) e un BSS (B) vola. Mosca individuale è collocato in un'arena 5 cm di diametro (5 mm di altezza) e il movimento è stata monitorata per 15 min. Velocity è stato calcolato ogni 0,5 secondi la media della velocità su una finestra scorrevole 1 sec (movimento dal precedente 0,5 sec al successivo intervallo di 0,5 sec.) Dopo un paio di lampi iniziali di attività mosca bss rimane relativamente inattivo tutto il processo.
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Discussion
Nell'esame locomotore o schemi di movimento in Drosophila, è utile essere in grado di estrarre informazioni riguardanti la distanza percorsa, la velocità di movimento e il percorso di taglio. Per estrarre queste informazioni, costose attrezzature è stato tradizionalmente impiegato che spesso proibitivo per i laboratori più piccoli o laboratori che intendono utilizzare tali dosaggi parsimonia 4,8,9.
Il test qui descritto può essere usato per determinare la distanza percorsa (figure 2 e 6), la velocità del movimento (figure 4 e 7) e il pattern di movimento (figure 1 e 5) utilizzando apparecchiature che costa meno di duecento dollari . Utilizzando il programma Visual Basic Excel abbiamo sviluppato, la serie di coordinate x, y generato dal programma ImageJ può essere analizzato per estrarre tutte queste informazioni. Questo sistema hastato precedentemente utilizzato per identificare sia soppressori genetici e farmacologici di SLA nei sequestro sensibili Drosophila mutanti BS 1.
Mentre il sistema è in grado di estrarre informazioni preziose, abbiamo analizzato solo uno volare alla volta. Questo può essere uno svantaggio significativo rispetto alle opzioni commerciali altamente paralleli 4. Il plug-in Multitracker per ImageJ ha la possibilità di monitorare più oggetti contemporaneamente, ma non abbiamo provato questa opzione. Per questa analisi locomotore, una mosca è posto sotto un coperchio di plastica piastra di Petri. A seconda della posizione della telecamera, si potrebbe filmare più piastre Petri di fare registrazioni parallele. Lo svantaggio è che la risoluzione diminuirà la web camera è posizionato per prendere in un campo più ampio. Come questo influenza l'integrità della registrazione non è nota, ma una fotocamera di fascia più alta sarebbe un'opzione se si volesse perseguire registrazioni parallele.
Le registrazioni duno qui sono limitati a 15 min ma è possibile fare registrazioni più lunghe se si impiega la versione a 64 bit di ImageJ. La versione a 32 bit ha un limite di memoria che limita la dimensione dei file si possono analizzare. Per registrazioni più lunghe, è indispensabile utilizzare la versione a 64 bit di ImageJ.
Uno dei maggiori problemi riguardanti questo metodo è la necessità di rimuovere il rumore dai dati generati dalla trasformazione nel software ImageJ. Tuttavia, questo non è unico per questo metodo come problemi di rumore simili devono essere risolti con altre opzioni di registrazione 3,5,6,8. Come discusso nei metodi, una mosca stazionaria può visualizzare piccole quantità di movimento quando viene elaborato attraverso ImageJ perché il programma misura movimento dal centro dell'oggetto, che può variare anche in un oggetto stazionario a causa di fluttuazioni di luce e volare postura.
Il nostro programma Visual Basic Excel utilizza un'analisi finestra scorrevole per impostare una soglia per il movimento. Questo threshold può variare a seconda del dosaggio. Per l'analisi sequestro, la finestra scorrevole guarda a dieci punti di registrazione, che si estende per 1 sec di tempo reale. Se il fly è spostato 0,5 centimetri o più in questo periodo è considerato essere grippaggio attivamente. Se è inferiore, esso è considerato a riposo. Se si guarda alla normale circolazione, è necessaria una soglia più bassa per determinare il taglio off e questo deve essere raggiunto attraverso tentativi ed errori. Una soglia di 0,1 cm / s è stato utilizzato in questo studio. Il modo migliore per ottenere questo è di registrare una mosca mentre è fermo per un breve periodo di tempo e quindi regolare la frequenza di taglio in modo che indichi alcun movimento durante la registrazione.
In sintesi, questo metodo a basso costo rappresenta un test vitale per l'estrazione di informazioni significative per quanto riguarda i vari parametri di volo locomozione. Si tratta di una tecnica di screening ideale da utilizzare per identificare se una manipolazione comportamentale, genetica o farmacologica ha un effetto sulla locomozione o suscettibilità sequestro.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori desiderano inoltre esprimere grazie a Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, e Megan Hyde per il loro lavoro di messa a punto questo test.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
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