Summary
Con una webcam y una combinación de programas de software libre y de bajo costo, los patrones locomotores en Drosophila melanogaster se pueden analizar para detectar diferencias en la velocidad, la distancia y el tiempo de las distintas actividades de motor.
Abstract
Sistemas de seguimiento de vídeo se han utilizado ampliamente para analizar el movimiento de Drosophila melanogaster y detectar diversas anomalías en el comportamiento de la locomotora. Aunque estos sistemas pueden proporcionar una gran cantidad de información sobre el comportamiento, el costo y la complejidad de estos sistemas pueden ser prohibitivo para muchos laboratorios. Hemos desarrollado un ensayo de bajo costo para medir el comportamiento de la locomotora y el movimiento de las crisis en D. melanogaster. El sistema utiliza una cámara web para capturar imágenes que se pueden procesar usando una combinación de software de bajo costo y libre para realizar un seguimiento de la distancia recorrida, la velocidad media de circulación y de la duración de movimiento durante un período de tiempo especificado. Para demostrar la utilidad de este sistema, se examinaron un grupo de D. melanogaster mutantes, los (BS) paralíticos Bang-sensibles, que son 3-10 veces más susceptibles a la actividad convulsiva (SLA) que tipo de moscas silvestres. El uso de este novedoso sistema, hemos sido capaces de detectar que el BS mutant insensata explosión (bss) presenta niveles más bajos de la locomoción exploratoria en un nuevo entorno de tipo salvaje moscas. Además, se utilizó el sistema para identificar que la metformina, que se utiliza comúnmente para tratar la diabetes de tipo II, reduce la intensidad de SLA en los mutantes BS.
Introduction
Dada su corta vida útil y las herramientas genéticas sólidos disponibles, Drosophila melanogaster es un excelente sistema modelo para la investigación de la etiología de diversas enfermedades y la fisiología subyacente de diversos procesos biológicos. En muchos casos, es ventajoso para medir los efectos que las manipulaciones de comportamiento, genéticos o farmacológicos tienen sobre la locomoción en estos organismos modelo 1,2.
Hay una variedad de métodos que se utilizan comúnmente para medir el movimiento mosca en dos dimensiones 3-7. Estos sistemas pueden apoyar el seguimiento de múltiples moscas simultáneamente y pueden medir la velocidad, el registro longitudes de trayectoria y registrar el porcentaje de tiempo que una mosca ha estado en movimiento. Se han utilizado para estudiar el movimiento en una variedad de contextos, incluyendo los efectos de los fármacos sobre la locomoción y la naturaleza dimorfismo sexual de la mosca movimiento 6-9. El principal inconveniente de estos sistemas es el costo de los sistemas de seguimientoTEM o el software y la cámara correspondiente. En algunos casos, esto se puede ejecutar en los miles de dólares. El costo es una preocupación particular para un laboratorio que sólo sería necesario un uso limitado de un sistema de este tipo, por ejemplo, la cuantificación de los patrones locomotores de un mutante recién aislados.
Un método más simple pero menos robusto es utilizar sistemas que registrar el movimiento basa en cuántas veces una mosca cruza una trayectoria del haz de luz infrarroja que se coloca en el medio de un tubo cerrado 10,11. Si bien este tipo de sistemas pueden dar información valiosa sobre los ciclos de movimiento y de sueño-vigilia, pueden sobre o bajo movimiento estimación porque no logran captar la trayectoria real de la mosca. Por ejemplo, las moscas que exhiben movimiento considerable en los extremos del tubo se registrarán tan bajo movimiento moscas aunque los métodos de alta resolución adicionales se han utilizado para tratar de sortear estas limitaciones 12.
Más simple y más barato aún son dispositivos que miden geotaxi escaladas, el movimiento hacia arriba de las moscas, a través de un único tubo o una serie de tubos de 2,13. Si bien estos sistemas son baratos y pueden identificar fácilmente los defectos geotaxis, no logran capturar muchos otros aspectos del movimiento que sean de interés para los investigadores.
Para muchos laboratorios, un sistema de análisis robusto de bajo costo que es fácil de configurar y operar sería una herramienta ventajosa para la caracterización de las diferencias de comportamiento en D. melanogaster cepas. Aquí se describe un ensayo que se puede establecer a partir de por menos de doscientos dólares y es capaz de dar información sobre la trayectoria, la velocidad y la duración del movimiento de la mosca. Para demostrar la eficacia del ensayo, se presentan datos que muestran que puede utilizarse para identificar; 1) un defecto del aparato locomotor en un Bang-sensibles (BS) mutante que es susceptible a ataques y 2) la capacidad de la metformina, la cual se utiliza comúnmente para tratar la diabetes de tipo II, para reducir la intensidad de la actividad convulsiva (SLA) in dos mutantes BS.
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Protocol
1. Preparación de un individuo Moscas de Ensayo Locomotion
- Transferencia vuela golpeando suavemente en viales vacíos individuales y la tapa de los viales con un tapón de algodón. Permitir que las moscas se sienten sin molestias 20-30 min antes de la observación. Es importante no anestesiar a las moscas dentro de las horas antes de la observación del comportamiento como estudios anteriores han encontrado la exposición anestesia puede alterar el comportamiento en comparación con las moscas sin anestesiar 14.
- Golpear suavemente la marcha de la ampolla y coloque moscas individuales bajo un 5 cm de diámetro cubierta placa de Petri (5 mm de alto) con pequeñas aberturas para permitir el paso del aire. Iluminar desde abajo y observar las moscas usando una webcam montada encima de la placa de Petri.
2. Preparación de un individuo Moscas de Ensayo Seizure
- Alimentación de dos días de edad convulsivos moscas sensibles cualquiera de los medios de levadura / harina de maíz / agar estándar o medios estándar mezclan directamente con las drogas. Por los datos presentados aquí, las moscas fueron alimentados con 1 gof medios estándar o 1 g de medios estándar mezclados con 25 mg de metformina.
- Después de que las moscas han alimentado durante dos días en los medios de comunicación o los medios de comunicación, además de la droga, transferirlos mediante suaves golpecitos en viales vacíos individuales y tapar los frascos con un tapón de algodón. Permitir que las moscas se sienten en reposo durante 20 min antes de la observación. Es importante no anestesiar a las moscas dentro de las horas antes de la observación del comportamiento como estudios anteriores han encontrado la exposición anestesia puede alterar el comportamiento en comparación con las moscas sin anestesiar 14.
- Vortex viales individuales que contienen una sola mosca en un vórtice de laboratorio utilizando la configuración más alta durante 10 segundos. Coloque la mosca inmovilizada en una hoja blanca de papel en blanco justo debajo de una cámara web montada sobre el papel.
3. Grabación de vídeo
- Registrar el movimiento o SLA usando el programa de software HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm . Este programa utiliza la cámara web paracapturar imágenes en base a la configuración de usuario.
- Seleccione la opción de imágenes con lapso de tiempo bajo la pestaña Capture, Cuando se abra la ventana, seleccione la cámara web como dispositivo de captura. Para la mayoría de los experimentos el tamaño del fotograma de vídeo de 640 x 480 es adecuado.
- Seleccione Intel IYUV codec para la compresión y escoja 0,1 seg / marco para el ensayo de convulsiones o elegir 0,1-0,5 seg / marco para el análisis de movimiento. En la ficha avanzada, seleccione Crear un archivo de imagen BMP. Para cada captura y seleccione una carpeta para el programa para almacenar las imágenes que toma (la pila de imágenes).
- Coloque una mosca muerta en la hoja de papel. Haga clic en el cuadro de configuración de vídeo y ajustar la configuración en la ficha Configuración de dispositivo de modo que haya un fondo blanco brillante y un claro contraste con la marcha más oscuro.
- Haga clic en el botón de inicio para comenzar la grabación. Una vez que el periodo de registro ha finalizado, haga clic en el botón de parada. La pila de imágenes debería estar ahora en la carpeta seleccionada. Nota: Antes de la grabación, seguro que al tratarder seleccionado para la pila de imágenes está vacía.
4. Análisis de datos mediante ImageJ
- Imagen libre de ImageJ software de procesamiento de Open NIH, que se puede descargar de la siguiente http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . Nota: Además de descargar el programa, el Multitracker plug-in debe ser descargado e instalado como se indica en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
- Importe la imagen de pila en ImageJ haciendo clic en la pestaña Archivo y seleccionando Importar → Secuencia de imágenes.
- Seleccione la carpeta que contiene la pila de imágenes, resalte una de las imágenes y seleccione Abrir. Un cuadro de diálogo Opciones de secuencia se abrirá. Haga clic en los nombres Ordenar y numéricamente a continuación, seleccione OK y la imagen de pila se cargará en ImageJ.
- Umbral todas las imágenes para que cada uno consiste en un fondo blanco con ser la moscaconvertido a un punto negro. Para iniciar este proceso, convertir la imagen en un formato de 8 bits, seleccionando Tipo → 8 bits en la ficha Imagen.
- Haga clic en la ficha Imagen de nuevo y seleccione Ajustar → Umbral. Esto abrirá el cuadro de diálogo Umbral en el que el umbral punto de corte se puede ajustar.
- Escanear a través de las fotos para ver si hay puntos negros adicionales o si una rebanada carece de un punto negro. Si este es el caso, ajustar el umbral para aliviar el problema. Por lo general, el umbral no necesita ser ajustado como los valores predeterminados del programa a un valor adecuado.
Nota: Cada diapositiva de la pila debe tener sólo un punto negro que representan la posición de la marcha. - Seleccione Aplicar en el cuadro de diálogo Umbral y Convertir a Máscara cuadro de diálogo se abrirá. No haga clic en cualquiera de las opciones, pero basta con hacer clic en Aceptar para umbral de la pila de imágenes.
- Después de un umbral a la pila de imágenes, seleccione la Multitracker plug-in en la pestaña Plugins paramedir el movimiento de la mosca en píxeles. Aparecerá el cuadro de diálogo Rastreador de objetos.
- Haga clic en cualquiera de las cuatro opciones que se ofrecen en el cuadro de diálogo y luego seleccione Aceptar. El plug-in Multitracker entonces adjuntar coordenadas para el punto negro en cada rebanada y enumérelos en la ventana de resultados, así como la longitud total del trayecto en píxeles. La ventana de Caminos da una representación gráfica de la trayectoria de la marcha tomó.
- Copie la lista x-e y-coordenadas de la ventana Resultados y pegar los datos en una hoja de cálculo Excel. Si cualquier diapositiva de la pila no tiene un punto negro en el mismo, el programa Multitracker se detendrá en esa diapositiva. Si esto ocurre, es necesario volver al paso 4.2 y re-umbral de la pila para asegurarse de que los registros de la mosca como un punto negro en la diapositiva en cuestión.
- Con el fin de convertir el longitudes de trayecto de los píxeles a cm, tome una imagen separada de dos puntos que están separados uno cm de distancia en una hoja blanca de papel en blanco.
- Siga las anteriorespasos (3.1-4.4.2), para determinar la X, Y del píxel coordenadas de los dos puntos y utilizar esta información para determinar el número de píxeles correspondientes a un cm. Este factor de conversión se utiliza en el paso cinco para generar datos de movimiento en cm. Nota: Una vez hecho esto, es importante para mantener la cámara fija para todas las futuras grabaciones. Cada vez que la cámara se mueve o se ajusta, uno tiene que repetir este paso para convertir los píxeles a cm.
- La longitud del camino que se genera por el Multitracker plug-in sobreestima el movimiento debido a que pequeñas fluctuaciones en la posición del cuerpo y la intensidad de la luz / reflexión afectarán el tamaño y el centro del punto negro que se genera cuando un umbral a las imágenes. Este ruido se debe retirar con el fin de obtener una estimación precisa de movimiento mosca.
5. Análisis de datos mediante Excel
- Eliminar el ruido de los datos registrados por la importación de la serie de coordenadas x, y generados por el pr MultitrackerOgram en Análisis Fly, un programa de Visual Basic de Excel creado por los autores. (El programa está disponible poniéndose en contacto con los autores.)
- Haga clic en el botón Me Haga clic en y seleccione un valor umbral de corte. Seleccionar un valor umbral de 0,5 cm / seg para el análisis de SLA o seleccione un valor entre 0,1-0,3 cm / seg para el análisis de movimiento. Haga clic en Aceptar y el programa calculará la velocidad, el tiempo y la distancia de movimiento. Nota: El programa utiliza una ventana deslizante análisis para evaluar los datos secuenciales 0,5-1,0 contenedores seg y calcula la velocidad durante esa ventana. Cualquier cosa por encima del punto de corte definido por el usuario se trata como movimiento mosca.
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Representative Results
La técnica descrita aquí se ha utilizado previamente para analizar las diferencias en SLA en los mutantes de Drosophila BS 1. Los resultados presentados aquí implican las cepas BS fácilmente conmocionado (EAS), la explosión sin sentido (bss), y por nocaut técnico (TKO). El locus eas codifica una quinasa implicada en la síntesis de etanolamina fosfatidiletanolamina 15 y el locus tko codifica una riboprotein mitocondrial 16. La mutación BSS es un alelo del canal de sodio paralítico (párrafo) de voltaje 17. Los alelos utilizados en este estudio fueron eas 1, bss 1 y 25t tko.
Una ilustración de la eficacia del método para medir SLA se puede ver en la figura 1, que representa la longitud de la trayectoria de un EAS mosca de control de convulsiones sensible en comparación con unoque se ha alimentado la metformina. La metformina es una biguanida utilizada para tratar la diabetes de tipo II. El fármaco inhibe respiratoria mitocondrial complejo I de la cadena, que, a través de la regulación al alza de la AMPK, provoca un aumento en la glucólisis y la captación de glucosa en las células de mamíferos 18. Estudios previos han encontrado que la metformina aumenta la expresión de genes glicolíticos, presumiblemente para compensar la inhibición de metabolismo aeróbico pathways 19. Figura 2 demuestra que la alimentación de las BS mutantes EAS y TKO metformina durante dos días (25 mg / g de alimento) reduce la longitud de la trayectoria de SLA .
Además de la reducción de la longitud de la trayectoria, los datos generados por este método se pueden utilizar para analizar las diferencias en la velocidad de SLA y la duración de SLA. En este caso, los datos indican que la duración de SLA se redujo significativamente (Figura 3) mientras que la velocidad de SLA no se cambió significativamente (Figura 4).
El ensayo descrito anteriormente también se puede utilizar para medir la locomoción durante un período de tiempo definido. Figura 5 muestra un ejemplo de una ruta recorrida por un tipo salvaje Canton-Especial (CS) vuela y un camino atravesado por un BSS vuela durante un período de 15 min. Mientras que el movimiento de ambos moscas se concentró en los bordes de la zona circular, la mosca CS exhibió mucho más locomoción durante el período de grabación 15 min. Por tanto, el ensayo es útil en el estudio de tanto la cantidad de movimiento y el patrón de movimiento de las moscas.
La distancia media recorrida por moscas bss fue significativamente menor que la de CS vuela como se indica en la Figura 6. No sólo las moscas bss muestran menos movimiento, tendían a moverse con una velocidad más lenta. Los cambios en la velocidad de movimiento de dos moscas individuales se representan en la Figura 7. Usando estos datos, una velocidad media puede ser calculada y comparada como en F igura 4 de SLA. Sobre la base de las moscas representativos mostrados en la Figura 7, es evidente que las moscas CS tenido episodios más frecuentes de movimiento rápido, mientras que las moscas bss tenían más episodios de inactividad durante el período representado en la figura.
Figura 1. Caminos representativos de SLA en mutantes y mutantes eas eas alimentados metformina. Moscas individuales eran mecánicamente una sacudida eléctrica para inducir el SLA. La trayectoria de una mosca individual durante el SLA está representado en la figura. A) Trayectoria de un mutante eas. B) Trayectoria de un mutante metformina alimentado eas. (Bar representa 1 cm).
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Figura 2. Moscas individuales eran mecánicamente una sacudida eléctrica para inducir SLA. La distancia de la mosca mueve durante el SLA se utilizó como una medida de la intensidad de SLA. En ambos mutantes BS examinados, la metformina redujo significativamente la distancia recorrida. Los datos se analizaron mediante el test de Mann-Whitney (* p <0,05; *** p <0,001, n = 15).
Figura 3. Moscas individuales eran mecánicamente una sacudida eléctrica para inducir SLA. El tiempo de la marcha pasó de someterse a SLA se utilizó como una medida de la intensidad de SLA. En ambos mutantes BS examinados, metformina redujo significativamente la duración de SLA. Los datos se analizaron mediante el test de Mann-Whitney (* p <0,05; *** p <0,001, n = 15).
Figura 4. Moscas individuales eran mecánicamente una sacudida eléctrica para inducir el SLA. La velocidad promedio de la marcha durante la pelea de SLA se utilizó como medida de la intensidad de la SLA. No hubo ningún cambio significativo en la velocidad media de los dos mutantes BS probados cuando se alimenta la metformina. Los datos se analizaron mediante el test de Mann-Whitney U (n = 15).
Figura 5. Caminos de las moscas individuales en la arena. Traces representan los caminos moscas individuales atravesados en la arena durante el período de seguimiento de 15 min. A) Trayectoria de un CS activa volar con el movimiento concentra en torno a la periferia de la pista circular. B) Trayectoria de una mosca bss típico. Movimiento todavía se concentró alrededor de la periferia, pero no había mucho menos movimiento en comparación con CS moscas. (Bar representa 1 cm)
Figura 6. Volar la locomoción cuando se expone a un ambiente nuevo. Moscas individuales se colocaron en una arena de 5 cm de diámetro (5 mm de altura) y el movimiento se controló durante 15 min. Se calcularon las longitudes de ruta de cada vuelo y las longitudes medias se tomaron para cada genotipo. Los mutantes bss muestran una reducción significativa de longitud de la trayectoria en comparación con CS moscas. Los datos se analizaron mediante el test de Mann-Whitney U (** p <0.01, n = 10).
Figura 7. Velocidad como una función de tiempo durante la locomoción exploratoria de un CS (A) y un BSS (B) vuela. Una mosca individuo fue colocado en una arena de 5 cm de diámetro (5 mm de altura) y el movimiento se controló durante 15 min. Velocity se calculó cada 0,5 segundos al promediar la velocidad a través de una ventana deslizante de 1 seg (movimiento desde el 0,5 seg anterior a la posterior intervalo de 0,5 seg.) Después de algunos estallidos iniciales de la actividad de la mosca bss permanece relativamente inactivo durante todo el juicio.
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Discussion
Al examinar locomotora o patrones de movimiento en Drosophila, es útil ser capaz de extraer información con respecto a la distancia recorrida, la velocidad de movimiento y el patrón de movimiento. Con el fin de extraer esta información, equipo costoso tradicionalmente se ha empleado que es a menudo prohibitivo para los pequeños laboratorios o laboratorios que deseen utilizar tales ensayos con moderación 4,8,9.
El ensayo descrito aquí se puede utilizar para determinar la distancia recorrida (Figuras 2 y 6), la velocidad del movimiento (Figuras 4 y 7) y el patrón de movimiento (Figuras 1 y 5) usando un equipo que cuesta menos de doscientos dólares . Usando el programa de Visual Basic de Excel hemos desarrollado, la serie de coordenadas X, Y generado por el programa ImageJ puede ser analizada para extraer toda esta información. Este sistema tieneha utilizado previamente para identificar ambos supresores genéticos y farmacológicos de SLA en las Drosophila mutantes BS-convulsivos sensibles 1.
Mientras que el sistema puede extraer información valiosa, sólo hemos analizado una mosca a la vez. Esto puede ser una desventaja significativa en comparación con las opciones comerciales altamente paralelos 4. El plug-in Multitracker para ImageJ tiene la capacidad de seguimiento de varios objetos a la vez, pero no hemos probado esta opción. Para este ensayo locomotora, una sola mosca se coloca debajo de un plato de Petri de plástico tapa. Dependiendo de la posición de la cámara, se podría filmar varias placas de Petri de hacer grabaciones paralelas. El inconveniente es que la resolución disminuirá a medida que la cámara web está en condiciones de tomar en un campo más amplio. ¿Cómo esto afecta a la integridad de la grabación no se conoce, pero una cámara de gama alta sería una opción si uno quería perseguir grabaciones paralelas.
Las grabaciones duno aquí se limitan a 15 minutos, pero es posible hacer grabaciones más largas si se emplea la versión de 64 bits de ImageJ. La versión de 32 bits tiene un límite de memoria que restringe el tamaño de los archivos se puede analizar. Para grabaciones más largas, es esencial utilizar la versión de 64 bits de ImageJ.
Uno de los mayores problemas con respecto a este método es la necesidad de eliminar el ruido de los datos generados por el procesamiento en el software ImageJ. Sin embargo, esto no es exclusivo de este método como problemas de ruido similares deben ser resueltos con otras opciones de grabación 3,5,6,8. Como se discutió en los métodos, una mosca estacionaria puede mostrar cantidades menores de movimiento cuando se procesa a través de ImageJ porque el programa mide el movimiento desde el centro del objeto, que puede variar incluso en un objeto estacionario debido a las fluctuaciones en la luz y la postura volar.
Nuestro programa de Visual Basic Excel utiliza un análisis de ventana deslizante para establecer un umbral para el movimiento. Esta thresholD puede variar dependiendo del ensayo. Para el análisis de la incautación, la ventana corredera mira a diez puntos de registro, que se extiende por 1 segundo de tiempo real. Si la marcha se ha movido 0,5 cm o más durante este tiempo se considera que se aprovechar activamente. Si es menor, se considera que está en reposo. Al mirar el movimiento normal, no se necesita un umbral más bajo para determinar el punto de corte y esto tiene que ser alcanzados a través de ensayo y error. Un umbral de 0,1 cm / seg se usó en este estudio. La mejor manera de lograr esto es registrar una mosca mientras está parado por un breve período de tiempo y luego ajustar el punto de corte para que se indica que no hay movimiento durante la grabación.
En resumen, este método de bajo costo representa un ensayo viable para la extracción de información significativa con respecto a los diversos parámetros de locomoción mosca. Se trata de una técnica de cribado ideal para usar para identificar si una manipulación del comportamiento, genética o farmacológica tiene un efecto sobre la locomoción o susceptibilidad a las crisis.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores también desean expresar su agradecimiento a Kris Burner, Stephen McKinney, Laura Tobin, Jenny Gilbreath, Ashley Olley, Megan Hoffer, y Megan Hyde por su trabajo en la puesta a punto de este ensayo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
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