Summary
שימוש במצלמת אינטרנט ושילוב של תוכנות חופשיות וזולות, ניתן לנתח דפוסי קטר בדרוזופילה melanogaster כדי לזהות הבדלים במהירות, מרחק, והזמן של פעילויות מוטוריות שונות.
Abstract
מערכות מעקב וידאו היו בשימוש נרחב לניתוח תנועת melanogaster דרוזופילה ולזהות חריגויות שונות בהתנהגות של קטר. בעוד שמערכות אלה יכולות לספק שפע של מידע התנהגותי, את העלות והמורכבות של מערכות אלו יכולים להיות מונעים למעבדות רבות. פיתחנו assay עלות נמוכה למדידת התנהגות של קטר ותנועת תפיסה בד melanogaster. המערכת עושה שימוש במצלמת אינטרנט כדי ללכוד תמונות שיכולים להיות מעובד באמצעות שילוב של תוכנה זולה וחופשית כדי לעקוב אחר את המרחק שעבר, מהירות תנועה ואת משך הזמן של תנועה הממוצעת במהלך פרק זמן שצוין. כדי להדגים את התועלת של מערכת זו, בדקנו קבוצה של ד melanogaster מוטציות, paralytics מפץ רגיש (BS), שהם 3-10 פעמים רגישים יותר כמו פעילות תפיסה (SLA) מאשר זבובי סוג בר. באמצעות מערכת הרומן הזה, שהיינו מסוגל לזהות שmutan BSחסר טעם לא מפץ (BSS) מציג רמות נמוכות יותר של תנועת גישוש בסביבת רומן מאשר זבובי סוג בר. בנוסף, המערכת משמשת לזיהוי שמטפורמין התרופה, אשר בדרך כלל משמש לטיפול בסוכרת מסוג II, מפחית את עוצמת צד"ל במוטנטים BS.
Introduction
בהתחשב בתוחלת חיים הקצר שלה וכלים הגנטיים חזקים הזמינים, melanogaster דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוינת לחקר האטיולוגיה של מחלות שונות והפיסיולוגיה הבסיסית של תהליכים ביולוגיים שונים. במקרים רבים, זה יתרון כדי למדוד את ההשפעות שיש להם מניפולציות התנהגותיות, גנטיות או תרופתית על תנועה באורגניזמים המודל הבאים 1,2.
יש מגוון של שיטות המשמשים בדרך כלל למדידת תנועת זבוב בשני ממדים 3-7. מערכות אלו יכולים לתמוך במעקב של זבובים מרובים בו זמנית ויכולות למדוד מהירות, אורכי נתיב להקליט ולתעד את אחוז זמן זבוב בילה נע. הם כבר השתמשו ללמוד תנועה במגוון רחב של הקשרים כוללים את ההשפעות של תרופות על תנועה והטבע דימורפית המיני של תנועת 6-9 זבוב. החסרון העיקרי של מערכות אלו הוא עלות sys המעקבTEM או תוכנה והמצלמה המקבילה. במקרים מסוימים, זה יכול לרוץ באלפי דולרים. עלות היא דאגה מיוחדת למעבדה שהיית צריך רק שימוש מוגבל של מערכת כזו, למשל, כימות דפוסי קטר של מוטציה מבודדת חדש.
שיטה פשוטה אך חזקה פחות היא להשתמש במערכות שתנועת השיא מבוססת על כמה פעמים זבוב חוצה נתיב קרן אור אינפרא אדום שממוקם באמצע צינור סגור 10,11. בעוד שמערכות כאלה יכולות לתת מידע רב ערך על מחזורי תנועה ושינה והערות, שהם מעל או מתחת לאומדן תנועה יכולים כי הם לא מצליחים ללכוד את הנתיב האמיתי של הזבוב. לדוגמא, זבובים שמפגינים תנועה ניכרת בקצוות של הצינור יירשמו תנועה נמוכה זבובים למרות ששיטות ברזולוציה גבוהה נוספות היו בשימוש כדי לנסות ולעקוף את המגבלות האלה 12.
פשוט יותר וזול יותר עדיין מטפסים מכשירים המודדים geotaxiים, התנועה כלפי מעלה של זבובים, דרך צינור בודד או סדרה של צינורות 2,13. בעוד מערכות כאלה הן זולות ובקלות יכולות לזהות פגמים geotaxis, הם מצליחים ללכוד היבטים רבים אחרים של תנועה שיהיו עניין לחוקרים.
למעבדות רבות, מערכת ניתוח חזק בעלות נמוכה כי הוא פשוט להתקנה ולתפעול תהיה כלי מועיל לאפיון הבדלים ההתנהגותיים בד melanogaster זנים. כאן אנו מתארים assay שיכול להיות ההגדרה בפחות ממאתיים דולרים, והוא מסוגל לתת מידע על הדרך, המהירות ומשך הזמן של תנועתו של הזבוב. כדי להדגים את היעילות של assay, אנו מציגים נתונים המראים כי ניתן להשתמש בו כדי לזהות; 1) פגם של תנועה במוטצית מפץ רגיש (BS), כי הוא רגיש להתקפים ו2) היכולת של מטפורמין התרופה, אשר משמש בדרך כלל לטיפול בסוכרת מסוג II, כדי להפחית את עוצמת פעילות כמו התקף-i (SLA)n שתי מוטציות BS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פרט זבובים עבור assay נידות
- העברת זבובים בעדינות על ידי הקשה לתוך צלוחיות ריקות פרט ומכסים את צלוחיות עם תקע כותנה. לאפשר זבובים לשבת דקות 20-30 באין מפריע לפני התצפית. חשוב לא להרדים זבובים בתוך שעות לפני תצפית התנהגותית כמחקרים קודמים מצאו חשיפת הרדמה יכולה לשנות את התנהגות בהשוואה לזבובי unanesthetized 14.
- לטפוח בעדינות את הזבוב מתוך הבקבוקון ולמקם את הזבובים בודדים תחת כיסוי צלחת בקוטר 5 סנטימטר פטרי (5 מ"מ גבוה) עם חריצים קטנים כדי לאפשר מעבר אוויר. להאיר מלמטה ולבחון את הזבובים באמצעות מצלמת רשת מותקנת מעל צלחת פטרי.
2. הכנת פרט זבובים עבור assay תפיסה
- להאכיל את זבובי תפיסה ישנים יומיים רגישים או מדיה שמרים / קמח תירס / אגר סטנדרטית או מדיה סטנדרטית מעורבת ישירות עם תרופה. הנתונים שהוצגו כאן, זבובים הואכלו גם ללכת 1ו תקשורת סטנדרטית או 1 גרם של תקשורת סטנדרטית מעורבבת עם 25 מ"ג של מטפורמין.
- אחרי הזבובים האכילו במשך יומיים בתקשורת או מדיה בתוספת תרופה, להעביר אותם על ידי הקשה עדינה לתוך צלוחיות ריקות פרט ומכסים את צלוחיות עם תקע כותנה. לאפשר זבובים לשבת באין מפריע במשך 20 דקות לפני התצפית. חשוב לא להרדים זבובים בתוך שעות לפני תצפית התנהגותית כמחקרים קודמים מצאו חשיפת הרדמה יכולה לשנות את התנהגות בהשוואה לזבובי unanesthetized 14.
- בקבוקונים בודדים ורטקס המכילים זבוב אחד על vortexer מעבדה שימוש בהגדרה הגבוהה ביותר עבור 10 שניות. הנח את הזבוב משותק על לבן גיליון נייר ריק ישירות מתחת מצלמות מותקנים מעל הנייר.
3. הקלטת וידאו
- רשום את התנועה או צד"ל באמצעות תוכנת HandyAvi http://www.azcendant.com/download.htm. תכנית זו משתמשת במצלמת האינטרנט כדיללכוד תמונות המבוססות על הגדרות המשתמש.
- בחר באפשרות הזמן לשגות תמונות תחת הלשונית לכידת, כאשר החלון נפתח, בחר את מצלמת האינטרנט כהתקן הלכידה. עבור רוב ניסויי גודל מסגרת וידאו של 640 480 הוא נאות.
- בחר אינטל IYUV codec לדחיסה ולבחור 0.1 שניות / מסגרת עבור assay התפיסה או לבחור 0.1-0.5 שניות / מסגרת עבור assay התנועה. בכרטיסייה המתקדמת, בחר ליצור. קובץ תמונת bmp עבור כל לכידה ובחר תיקייה לתכנית כדי לאחסן את התמונות שזה לוקח (ערימת התמונה).
- הנח זבוב מת על דף נייר. לחץ על תיבת הגדרות וידאו ולהתאים את ההגדרות תחת לשונית הגדרות התקן, כך שיש רקע לבן בוהק וניגוד ברור עם הזבוב הכהה יותר.
- לחץ על הכפתור התחל כדי להתחיל את ההקלטה. לאחר תקופת ההקלטה סיימה, לחץ על כפתור העצירה. ערימת התמונה צריכה להיות עכשיו בתיקייה שנבחרה. הערה: לפני ההקלטה, להבטיח כי תחשיב היחסיםדר נבחר לערימת התמונה ריק.
4. ניתוח נתונים באמצעות ImageJ
- ImageJ של NIH הפתוח תמונה בחינם תוכנה לעיבוד, שניתן להוריד בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/download.html. שים לב: בנוסף להורדת התכנית, Multitracker plug-in יש להוריד ולהתקין כפי שצוין בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html.
- ייבא את ערימת התמונה לתוך ImageJ על ידי לחיצה על הכרטיסייה הקובצת ולאחר מכן בחירת רצף תמונות היבוא →.
- בחר את התיקייה המכילה את ערימת התמונה, סמן את אחת מהתמונות ובחר פתוח. תיבת דיאלוג רצף אפשרויות תיפתח. לחץ על שמות מיון מבחינה מספרית ולאחר מכן בחר אישור וערימת התמונה תהיה טעונה לImageJ.
- סף את כל התמונות, כך שכל מורכב מרקע לבן עם להיות הזבוביומר לנקודה שחורה. כדי להתחיל בתהליך זה, להמיר את התמונה לפורמט 8 ביט על ידי בחירת סוג → 8 סיביות תחת לשונית התמונה.
- לחץ על כרטיסיית התמונה שוב ובחר התאם → סף. הפעולה זו תפתח את תיבת דיאלוג הסף שבו הסף מנותק נקודה יכולה להיות מותאמת.
- סריקה באמצעות התמונות כדי לראות אם יש נקודות שחורות נוספות או אם פרוסה חסרת נקודה שחורה. אם זה המקרה, להתאים את הסף כדי להקל על הבעיה. בדרך כלל הסף לא צריך להיות מותאם כברירת מחדל התכנית לערך נאות.
שים לב: בכל שקופית בערימה צריכה להיות רק אחד נקודה שחורה המייצגת את עמדתו של הזבוב. - בחר להחיל בתיבת דיאלוג הסף והמר למסכת תיבת דיאלוג יפתח. אל תלחץ על כל אחת מהאפשרויות, אלא פשוט לחץ על אישור לסף ערימת התמונה.
- לאחר thresholding ערימת התמונה, בחר Multitracker לחבר-תחת לשונית תוספים כדילמדוד את התנועה של הזבוב בפיקסלים. תיבת דיאלוג Tracker האובייקט תופיע.
- לחץ על כל אחת מארבע האפשרויות שניתנו בתיבת הדיאלוג ולאחר מכן בחר אישור. לאחר מכן התוספת Multitracker יצרף קואורדינטות לנקודה השחורה בכל פרוסה וצייני אותם בחלון התוצאות, כמו גם את אורך הדרך הכולל בפיקסלים. חלון הנתיבים נותן תצוגה גרפית של נתיב הזבוב לקח.
- להעתיק את רשימת ה-X וה-Y לתאם מחלון התוצאות ולהדביק את הנתונים לגיליון אלקטרוני Excel. אם שקופיות כל בערימה אין נקודה שחורה בזה, תכנית Multitracker תבלום שבשקופית. במקרה כזה, יש צורך לחזור לשלב 4.2 מחדש סף הערימה כדי לוודא שאוגרים לטוס כנקודה שחורה בשקופית בשאלה.
- על מנת להמיר את נתיב אורכים מפיקסלים לסנטימטר, לקחת תמונה נפרדת של שתי נקודות שהם מרווחים מאחד סנטימטר על פיסה לבנה נייר ריקה.
- עקוב מעלצעדים (3.1-4.4.2), כדי לקבוע את x, y פיקסל קואורדינטות עבור שתי הנקודות ולהשתמש במידע זה כדי לקבוע את מספר הפיקסלים המקביל לסנטימטר. מקדם המרה זה משמש בשלב חמישה כדי להפיק נתונים תנועה בס"מ. הערה: ברגע שזה נעשה, זה חשוב כדי לשמור על המצלמה קבועה עבור כל ההקלטות העתידיות. בכל פעם שהמצלמה עברה או מותאמת, צריכה לחזור על שלב זה להמיר את הפיקסלים לסנטימטר.
- אורך הנתיב שנוצר על ידי התוספת Multitracker מגזים בהערכת תנועה בגלל תנודות קלות בתנוחת גוף ועוצמה / השתקפות אור תשפיע על הגודל והמרכז של הנקודה השחורה שנוצרת כאשר thresholding התמונות. רעש זה יש להסיר על מנת לקבל הערכה מדויקת של תנועת זבוב.
5. ניתוח נתונים באמצעות Excel
- הסר את הרעש מהנתונים שנרשמו על ידי יבוא הסדרה של x, y קואורדינטות שנוצר על ידי יחסי ציבור Multitrackerogram לטוסו ניתוח, תכנית של Visual Basic Excel שנוצרה על ידי המחברים. (התכנית זמינה על ידי יצירת קשר עם החברים.)
- לחץ על לחצן לחץ אותי ובחר ניתוק ערך סף. בחר ערך סף של 0.5 סנטימטר / שנייה לניתוח צד"ל או לבחור ערך בין .1-.3 סנטימטר / שנייה לניתוח תנועה. לחץ על אישור והתכנית לחשב את המהירות, הזמן ומרחק של תנועה. הערה: התכנית משתמשת בחלון הזזה ניתוח כדי להעריך את הנתונים בפחי שניות רציפים 0.5-1.0 ומחשבת את המהירות בחלון זה. כל דבר מעל הפסקת מוגדרת על ידי המשתמש הוא כאל תנועת זבוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה המתוארת כאן כבר השתמשה בעבר כדי לנתח הבדלים בצד"ל במוטנטים BS דרוזופילה 1. התוצאות שהוצגו כאן לערב את זני BS בהלם בקלות (EAS), מפץ חסר טעם (BSS), ונוקאאוט טכני (TKO). מוקד EAS מקודד קינאז ethanolamine המעורב בסינתזת ethanolamine phosphatidyl 15 ולוקוס TKO מקודד riboprotein המיטוכונדריה 16. המוטציה BSS היא אלל של ערוץ השיתוק (para) המתח מגודרת נתרן 17. אללים השתמשו במחקר זה היו EAS 1, BSS 1, ו25t TKO.
איור של היעילות של השיטה למדידת SLA ניתן לראות באיור 1, המתאר את אורך הדרך של זבוב שליטת תפיסה רגישה EAS לעומת אחדכי כבר נמאס מטפורמין התרופה. מטפורמין היא biguanide משמש לטיפול בסוכרת מהסוג II. התרופה מעכבת אני המיטוכונדריה הנשימה מורכבת שרשרת, אשר, באמצעות גברת הביטוי של AMPK, מעורר עלייה בגליקוליזה וספיגת הגלוקוז בתאי יונקים 18. מחקרים קודמים מצאו כי מטפורמין upregulates גנים glycolytic, כנראה כדי לפצות על העיכוב של חילוף חומרים אירוביים מסלולים 19. איור 2 מראה כי האכלת EAS מוטציות BS וTKO מטפורמין במשך יומיים (25 מ"ג / גר 'מזון) מפחיתה את אורך דרך SLA .
בנוסף לצמצום אורך הדרך, הנתונים המופקים בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לנתח את ההבדלים במהירות צד"ל ומשך צד"ל. במקרה זה, הנתונים מצביעים על כך שמשך SLA צומצם משמעותי (איור 3) ואילו SLA המהירות לא השתנתה באופן משמעותי (איור 4).
גם assay שתואר לעיל יכול לשמש למדידת תנועה על פני תקופה מוגדרת של זמן. איור 5 מראה דוגמא של נתיב נחצה על ידי סוג בר קנטון-מיוחד (CS) טיסות ונתיב נחצה על ידי BSS לעוף על פני תקופה של 15 דקות. בעוד שתנועתם של שני הזבובים הייתה מרוכזת בשולי האזור העגול, זבוב CS הציג הרבה יותר תנועה על פני תקופת ההקלטה 15 דקות. Assay לכן הוא שימושי במסתכל על שניהם את כמות התנועה ואת דפוס תנועה של הזבובים.
המרחק הממוצע נחצה על ידי זבובי BSS היה נמוך באופן משמעותי מזה של CS זבובים כפי שעולה מאיור 6. לא רק שזבובי BSS להציג פחות תנועה, הם נטו לנוע עם מהירות איטית יותר. שינויים במהירות תנועה של שני זבובים בודדים מתוארים באיור 7. שימוש בנתונים אלה, מהירות ממוצעת ניתן לחשב ולעומת כבF igure 4 לצד"ל. בהתבסס על זבובי הנציג מוצגים באיור 7, נראה שיש לי זבובי CS התקפים תכופים יותר של תנועה מהירה ואילו זבובי BSS יותר התקפים של חוסר פעילות בתקופה המיוצגת בדמות.
איור 1. נתיבי נציג של צד"ל במוטנטים EAS ומוטציות EAS האכילו מטפורמין. זבובים בודדים היו בהלם מכאני כדי לגרום צד"ל. נתיב דרכו של זבוב בודד במהלך צד"ל מיוצג באיור.) נתיב של מוטציה EAS. ב) למטפורמין המוטציה EAS נמאס. (בר מייצג 1 סנטימטר).
"Src =" files/ftp_upload/51460/51460fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51460/51460fig2.jpg "/>
איור 2. זבובים בודדים היו בהלם מכאני כדי לגרום לצד"ל. מרחק הזבוב עבר במהלך צד"ל שימש כמדד לעוצמת צד"ל. בשתי מוטציות BS בדקו, מטפורמין הפחית באופן משמעותי את המרחק שעבר. הנתונים נותחו באמצעות מבחן מאן ויטני U (* p <0.05; *** p <0.001, n = 15).
איור 3. זבובים בודדים היו בהלם מכאני כדי לגרום לצד"ל. הזמן לטוס בילה עובר צד"ל שימש כמדד לעוצמת צד"ל. בשתי מוטציות BS בדקו, מטפורמין הפחית באופן משמעותי את משך זמן צד"ל. הנתונים נותחו באמצעות מבחן מאן ויטני U (* p <0.05; *** p <0.001, n = 15).
איור 4. זבובים בודדים היו בהלם מכאני כדי לגרום לצד"ל. המהירות של הזבוב הממוצעת במהלך התקף של צד"ל שימשה כמדד לעוצמת צד"ל. לא חל שינוי משמעותי במהירות ממוצעת עבור שתי מוטציות BS נבדקו כאשר האכילו מטפורמין. הנתונים נותחו באמצעות מבחן מאן ויטני U (n = 15).
איור 5. שבילים של זבובים בודדים בזירה. עקבות מייצגות את נתיבי זבובים בודדים חצו בזירה במהלך תקופת מעקב 15 דקות.) נתיב של CS פעיל לטוס עם מוvement התרכז סביב הפריפריה של הזירה העגולה. B) הנתיב של זבוב BSS טיפוסי. תנועה עדיין התרכזתי סביב בפריפריה אבל לא הייתה שם הרבה פחות תנועה, בהשוואה לזבובים למדעי המחשב. (בר מייצג 1 סנטימטר)
איור 6. טוס תנועה כאשר הם נחשפים לסביבה חדשה. זבובי פרט הונחו בזירה בקוטר 5 סנטימטר (5 מ"מ גובה) ותנועה היה פיקוח על 15 דקות. אורכי נתיב חושבו לכל זבוב והאורכים הממוצע נלקחו עבור כל גנוטיפ. מוטציות BSS מוצגות ירידה משמעותית באורך דרך בהשוואה לזבובים למדעי המחשב. הנתונים נותחו באמצעות מבחן מאן ויטני U (** p <0.01, n = 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר בוחנים של תנועה או דפוסי תנועה בדרוזופילה, הוא שימושי כדי להיות מסוגל לחלץ מידע לגבי המרחק שעבר, מהירות תנועה והדפוס של תנועה. על מנת לחלץ את המידע הזה, ציוד יקר באופן מסורתי מועסק שהוא לעתים קרובות מונע למעבדות קטנות יותר או מעבדות שרוצים להשתמש במבחנים כאלה במשורה 4,8,9.
Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי לקבוע את המרחק שעבר (איורים 2 ו 6), מהירות התנועה (האיורים 4 ו -7) והדפוס של תנועה (איורים 1 ו 5) ציוד באמצעות שעולה פחות ממאתיים דולרים . השימוש בתכנית של Visual Basic אקסל שפיתחנו, הסדרה של x, y קואורדינטות שנוצרה על ידי ניתן לנתח את תכנית ImageJ כדי לחלץ את כל המידע הזה. במערכת זו יששימש בעבר לזהות שני מדכאי גנטיים ותרופתיים של צד"ל במוטנטים BS דרוזופילה התפיסה רגישה 1.
בעוד המערכת יכולה לחלץ מידע רב ערך, יש לנו רק ניתחתי זבוב אחד בכל פעם. זה יכול להיות חסרון משמעותי בהשוואה לאפשרויות מסחריות המקבילים מאוד 4. התוסף עבור ImageJ Multitracker יש את היכולת לעקוב אחר אובייקטים מרובים בו זמנית אבל עוד לא ניסיתי אפשרות זו. עבור assay של תנועה זו, זבוב אחד ממוקם מתחת מכסה צלחת פטרי פלסטיק. בהתאם למיקום של המצלמה, אפשר לצלם את צלחות פטרי מרובות כדי לעשות הקלטות מקבילות. החסרון הוא שהרזולוציה תקטן כמצלמת האינטרנט ממוקמת לקחת בשדה גדול יותר. איך זה משפיע על היושרה של ההקלטה אינו ידועה, אבל מצלמה הסוף גבוהה יותר תהיה אופציה אם אחד רוצה להמשיך הקלטות מקבילות.
הקלטות דאחד כאן הם מוגבל ל15 דקות אבל זה אפשרי לעשות את ההקלטות יותר, אם אחד מעסיק את גרסת 64 סיביות של ImageJ. יש הגרסה 32 סיביות מגבלת זיכרון שמגבילה את גודלו של הקובץ האחד יכול לנתח. להקלטות ארוכות יותר, זה הכרחי להשתמש בגרסת 64 סיביות של ImageJ.
אחת הסוגיות הגדולות ביותר בנוגע לשיטה זו הוא הצורך להסיר את הרעש מהנתונים המופקים על ידי עיבודו בתוכנת ImageJ. עם זאת, זה אינו ייחודי לשיטה זו כבעיות רעש דומות חייבות להיפתר עם אפשרויות הקלטה אחרות 3,5,6,8. כפי שנדון בשיטות, זבוב נייח עשוי להציג כמויות קטנות של תנועה כאשר מעובד באמצעות ImageJ כי התכנית מודדת תנועה מהמרכז של האובייקט, אשר יכול להשתנות אפילו בחפץ נייח בשל תנודות באור ולעוף יציבה.
תכנית היסוד Excel החזותית שלנו משתמשת בחלון הזזה ניתוח לקבוע סף לתנועה. threshol זהד עשוי להשתנות תלוי בassay. לניתוח תפיסה, חלון הזזה מסתכל על עשר נקודות הקלטה, אשר משתרעת על פני 1 שניות של זמן אמת. אם הזבוב עבר 0.5 סנטימטר או יותר בתקופה זו הוא נחשב לתפיסה באופן פעיל. אם זה פחות, זה נחשב להיות במנוחה. כאשר מסתכלים על תנועה נורמלית, יש צורך ברף נמוך יותר כדי לקבוע את מנותק וזה צריך להיות מושגת באמצעות ניסוי וטעייה. סף 0.1 סנטימטר / השני היה בשימוש במחקר זה. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא להקליט זבוב בזמן שהוא נייח לתקופה קצרה של זמן ולאחר מכן להתאים את החיתוך כך שהוא מציין שאין תנועה בעת ההקלטה.
לסיכום, שיטת עלות נמוכה זה מייצגת assay קיימא להפקת מידע משמעותי לגבי הפרמטרים השונים של תנועת זבוב. זוהי טכניקת הקרנה אידיאלית לשימוש כדי לזהות אם מניפולציה התנהגותית, גנטית או תרופתית יש השפעה על תנועה או רגישות התקף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים גם מבקשים להביע תודה לקריס מבער, סטיבן מקיני, לורה טובין, ג'ני Gilbreath, אשלי Olley, מייגן הופר, ומייגן הייד עבור עבודתם בכוונון עדין assay זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
- Stone, B., Evans, L., Coleman, J., Kuebler, D. Genetic and pharmacological manipulations that alter metabolism suppress seizure-like activity in. 1496, 94-103 (2013).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 58, 1112-1119 (1967).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking systema tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiol. Behav. 73, 731-744 (2001).
- Kohlhoff, K. J., Jahn, T. R., Lomas, D. A., Dobson, C. M., Crowther, D. C., Vendruscolo, M. The iFly tracking system for an automated locomotor and behavioural analysis of Drosophila melanogaster. Integr. Biol. 3, 755-760 (2011).
- Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors. PLoS ONE. 7, (2002).
- Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. High-Resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
- Martin, J. R. A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Processes. 67, 207-219 (2004).
- Meunier, N., Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Regulation of feeding behaviour and locomotor activity by takeout in Drosophila. J. Exp. Biol. 210, 1424-1434 (2007).
- Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13, 489-499 (2012).
- Catterson, J. H., Knowles-Barley, S., James, K., Heck, M. M., Harmar, A. J., Hartley, P. S. Dietary modulation of Drosophila sleep-wake behaviour. PLoS One. 5, (2010).
- Donelson, N., Kim, E. Z., Slawson, J. B., Vecsey, C. G., Huber, R., Griffith, L. C. High-Resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the ''Tracker'' program. PLos ONE. 7, (2012).
- Duboff, B., Fridovich-Keil, J. L. Mediators of a long-term movement abnormality in a Drosophila melanogaster model of classic galactosemia. Dis. Model Mech. 5, 796-803 (2012).
- Seiger, M. B., Kink, J. F. The effect of anesthesia on the photoresponses of four sympatric species of Drosophila. Behav. Genet. 23, 99-104 (1993).
- Pavlidis, P., Ramaswami, M., Tanouye, M. A. The Drosophila easily shocked gene: a mutation in a phospholipid synthetic pathway causes seizure, neuronal failure, and paralysis. Cell. 79, 2333 (1994).
- Royden, C. S., Pirrotta, V., Jan, L. Y. The tko locus, site of a behavioral mutation in D. melanogaster, codes for a protein homologous to prokaryotic ribosomal protein S12. Cell. 51, 165-173 (1987).
- Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. , 187-534 (2011).
- Hardie, D. G. Role of AMP-activated protein kinase in the metabolic syndrome and in heart disease. FEBS Lett. 582, 81-89 (2008).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochem. Pharma. 62, 439-446 (2001).
