Summary
使用自由和廉价的软件程序的网络摄像头和相结合的，在果蝇机车图案可以被分析以检测速度，距离，以及各马达的活动时间的差别。
Abstract
视频跟踪系统已被广泛地用于分析果蝇的运动和检测各种异常的机车行为。虽然这些系统可以提供丰富的行为信息，这些系统的成本和复杂性可能是令人望而却步的许多实验室。我们已经开发出用于测量果蝇机车行为，并扣押运动低成本的检测。该系统使用网络摄像捕获，可以使用廉价的和免费软件的组合来跟踪移动的距离被处理的图像，运动和运动的持续时间在指定的时间范围的平均流速。为了证明该系统的效用，我们研究了D组的果蝇突变体，该邦敏感（BS）瘫痪，这比野生型果蝇3-10倍更易患癫痫样活性（SLA）。使用这种新颖的系统，我们能够检测到该BS的Mutan吨的一声毫无意义的（BSS）具有探索性的运动在一个新的环境比野生型果蝇较低水平。此外，该系统被用来确定该药物二甲双胍，其通常被用于治疗II型糖尿病，降低了SLA的在BS中的突变体的强度。
Introduction
鉴于其寿命短和可用的健壮的遗传工具， 果蝇是用于研究各种疾病的病因学和各种生物过程中的潜在生理学极好的模型系统。在许多情况下，有利的是测量的影响，行为，遗传或药理操作对运动在这些模型有机体1,2。
有很多种方法，这些方法通常用于测量在两维3-7苍蝇的运动。这些系统可同时支持多个苍蝇的跟踪，并且可以测量速度，记录的路径长度，并记录时间的苍蝇已经使用了移动的百分比。它们已被用于研究在各种情况下，包括药物对运动和苍蝇的运动6-9的性二态性质的影响的运动。这些系统的主要缺点是跟踪系统的成本统或相应的软件和照相机。在某些情况下，这可以在数千美元运行。成本是一个实验室，将只需要有限的使用这样的系统，例如，量化新分离的突变体的机车图案的特别关注。
一个更简单的，但不太可靠的方法是使用其中记录的运动的基础上多少次穿过蝇被放置在闭合管10,11的中途的红外光束路径的系统。虽然这种系统可以提供运动和睡眠 - 觉醒周期的有价值的信息，他们可以超过或低于估计的运动，因为他们无法捕捉苍蝇的实际路径。例如，苍蝇，表现出在管的端部相当的运动将登记为低运动苍蝇虽然额外高分辨率的方法已被用来尝试规避这些限制12。
简单，便宜还都爬不动了测量geotaxi设备秒，苍蝇的向上运动，通过单管或一系列管2,13的。虽然这样的系统很便宜，可以很容易地识别趋地性的缺陷，他们无法捕捉到许多其他方面的运动，将感兴趣的研究者。
对于许多实验室，低成本的强大的分析系统，该系统简单的设置和操作将是一个有利的工具表征果蝇品系行为上的差异。在这里，我们描述了可以设置为不到两百元，并能提供有关的路径，速度苍蝇的运动和时间信息的检测。以证明该测定的功效，我们提出的数据表明，它可用于标识：1）在一个爆炸敏感（BS）突变体易受癫痫发作和药物二甲双胍2）的能力，一个自发的缺陷而通常用于治疗II型糖尿病，以减少发作样活性（SLA）Ⅰ的强度n两个学士学位突变体。
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Protocol
1。苍蝇的步态分析个人的制备
- 转让苍蝇轻轻拍打成单独的空瓶子和盖子的小瓶用棉塞。让苍蝇品静置20-30分钟观察之前。它不麻醉前行为观察的时间内苍蝇与以前的研究发现麻醉曝光可以改变的行为相比，非麻醉苍蝇14是非常重要的。
- 轻轻拍打飞出来的小瓶，然后将个别苍蝇在一个直径为5厘米的培养皿盖（5毫米高）的小缝隙，让空气通过。从下面照射并利用安装在上面的培养皿一个摄像头观察苍蝇。
2。苍蝇扣押分析个人的制备
- 喂两天老扣押敏感的苍蝇任何一种标准，酵母/玉米粉/琼脂培养基或标准介质直接混合药物。对于数据呈现在这里，苍蝇喂养或者1合F标准的媒体或1 g和二甲双胍25毫克混合标准介质。
- 之后，苍蝇喂了两天的媒体或媒体加药，轻轻敲击将他们转移到个人的空瓶子和盖子的小瓶用棉塞。让苍蝇静置20分钟前观察。它不麻醉前行为观察的时间内苍蝇与以前的研究发现麻醉曝光可以改变的行为相比，非麻醉苍蝇14是非常重要的。
- 含在实验室涡流混合器单一使用飞10秒的最高设置旋涡个人小瓶。将固定苍蝇在纸张的正下方安装在纸上面的一个摄像头一个空白页。
3。视频录制
- 记录使用HandyAvi软件程序的移动或SLA http://www.azcendant.com/download.htm 。这个程序使用网络摄像头捕获基于用户设置的图像。
- 选择捕捉选项卡下的延时图像选项，当窗口打开时，选择摄像头的捕获设备。对于大多数实验的640×480的视频帧的大小是足够的。
- 选择英特尔IYUV编解码器的压缩和选择0.1秒/帧检化验或选择0.1〜0.5秒/帧的运动检测。在高级选项卡上，选择为每个捕获创建。bmp图像文件，并选择一个文件夹为程序存储，它需要（图像堆栈）的图像。
- 放置纸张上一只死苍蝇。点击视频设置框并调整设置的设备设置选项卡下，这样有一个明亮的白色背景，并与暗飞了明显的反差。
- 单击开始按钮，开始录制。一旦记录周期完成后，请单击停止按钮。图像堆栈现在应该选择的文件夹中。注：在录制之前，确保FOL德选择的图像堆栈是空的。
4。使用ImageJ数据分析
- 美国国立卫生研究院开放的免费图像处理软件ImageJ的，可从以下网址下载http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html 。注：除了下载该程序，多轨插件，必须下载并安装于所示http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html 。
- 导入图像堆栈成的ImageJ通过点击文件选项卡，然后选择导入→图像序列。
- 选择包含图像堆栈的文件夹，突出图像中的一个，并选择开启。序列选项对话框将打开。点击排序数值名称，然后选择确定和图像堆栈将被加载到ImageJ的。
- 门槛都让每一个由一个白色的背景，是苍蝇的图像转换到一个黑点。要开始这个过程中，图像通过图像选项卡下选择类型→8位转换为8位格式。
- 再次单击图像选项卡上，选择调整→阈值。这将打开阈值对话框中，阈值截断点可以调整。
- 通过扫描图像，看是否有多余的黑点，或者如果切片缺少一个黑点。如果是这种情况，调整阈值，以缓解该问题。通常情况下，阈值并不需要进行调整，因为程序默认为一个适当的值。
注：在堆栈中的每一张幻灯片应该只有一个黑点代表苍蝇的位置。 - 选择适用于该阈值对话框和转换到面膜对话框将打开。不要单击任何选项，但只需点击OK阈值图像堆栈。
- 阈值化图像堆栈后，选择多轨插件在插件选项卡下，以测量苍蝇的运动以像素为单位。将出现对象跟踪对话框。
- 点击所有的四个选项在对话框中给定的，然后选择确定。在多轨插件，然后将附加坐标转换为黑点中的每个切片并在结果窗口，以及以像素为单位的总路径长度列出这些。路径窗口给出了飞了路径的图形显示。
- x和y坐标列表从结果窗口复制和粘贴数据到Excel电子表格。如果在堆栈中的任何幻灯片没有一个黑点在它的多轨程序将停止在该幻灯片。如果发生这种情况，就必须返回步骤4.2和重新阈堆栈，以确保在飞行寄存器作为一个黑点在所述的滑动。
- 为了转换像素的路径长度，以厘米，采取的是一个空白的白纸间隔开cm处两个点的单独图像。
- 遵循以上步骤（3.1-4.4.2），以确定在x，y像素坐标的两个点，并使用该信息来确定对应于一厘米的像素的数目。这个转换系数被用在步骤5，以产生在厘米运动数据。注意：一旦做到这一点，保持相机固定以后所有的记录是很重要的。每次摄像机移动或调整，需要重复此步骤，以像素转换为厘米。
- 是由多轨插件生成的路径长度高估运动，因为在身体位置和光量/反射小幅波动会影响该阈值化的图像时产生的黑点的大小和中心。这种噪声必须以获得飞运动的精确估计被除去。
5。使用Excel数据分析
- 通过导入一系列的X从记录的数据去除噪声，Y的多轨公关产生的坐标ogram成飞分析，由作者创建的Excel Visual Basic程序。 （该程序可通过联系作者。）
- 点击Click Me按钮，然后选择一个阈值截止。对于SLA分析选择为0.5厘米/秒的阈值，或者选择0.1-0.3厘米/秒之间的值作为运动分析。单击确定，程序将计算速度，时间和距离的运动。注：本程序采用一个滑动窗口分析，以评估在连续0.5-1.0秒箱中的数据和该窗口中计算速度。任何用户定义的截止频率以上的被视为动态运动。
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Representative Results
这里所描述的技术已被以前用来分析在果蝇突变体学士学位1 SLA差异。这里给出的结果涉及的BS菌株容易感到震惊（EAS），轰的一声毫无意义的（BSS），以及技术性击倒（TKO）。在EAS基因编码参与磷脂酰乙醇胺合成15乙醇胺激酶和将军澳基因编码线粒体riboprotein 16。该BSS突变是麻痹 （ 对 ）电压门控钠通道17的等位基因。在这项研究中所使用的等位基因EAS 1，BSS 1，和TKO25吨 。
测量SLA方法的功效的示意图在图1中，相对于1描绘了一个EAS发作感应控制苍蝇的路径长度可以看出已经喂了药二甲双胍。二甲双胍是一种用于治疗II型糖尿病的双胍类药物。可抑制线粒体呼吸链复合物I，其中， 通过 AMPK的上调，触发器在哺乳动物细胞中18增加糖酵解和葡萄糖摄取。以往的研究发现，二甲双胍上调糖酵解基因，可能是为了弥补有氧代谢的抑制通路19。 图2表明，喂养BS突变EAS和将军澳二甲双胍两天（25毫克/克食物）可降低SLA的路径长度。
除了减少路径的长度，可以使用这种方法产生的数据，以分析在SLA的速度和持续时间的SLA的差异。在这种情况下，该数据表明，SLA的持续时间显著降低（ 图3），而SLA速度没有显著改变（ 图4）。
上面描述的测定，也可用于测量运动在一个限定的时间段， 图5示出了穿过由野生型广-特殊的路径的一个示例（CS）和飞走过一个BSS内的路径飞一段15分钟。虽然这两种果蝇的运动主要集中在圆形区域的边缘，在CS飞展出多运动超过15分钟记录周期。因此，该测定法是在寻找运动的量和苍蝇的运动模式是有用的。
走过BSS苍蝇的平均距离是比CS苍蝇如图6所示显著降低。不仅做了BSS苍蝇显示少运动，他们倾向于用移动较慢的速度。改变两个单独的苍蝇的运动速度被描绘在图7中 。使用此数据，平均速度可以被计算和比较如F中 IGURE 4的SLA。根据图7中所示的代表性的苍蝇，但很明显，在CS苍蝇有快速移动的更加频繁发作，同时在图中所表示的期间在bss苍蝇有闲置更较量。
图1。 SLA的EAS突变体和EAS突变体代表路径喂二甲双胍。个人苍蝇机械震惊诱导的SLA。一个EAS突变体喂食二甲双胍的EAS突变的SLA中的个人飞行的路径表示在图A）路径B）的路径。 （巴表示1厘米）。
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图2。个别苍蝇机械震惊诱导的SLA。在SLA中飞移的距离被用作SLA强度的量度。在检查这两个BS的突变体，二甲双胍显著减少移动的距离。采用Mann-Whitney U检验数据进行分析（* P <0.05; *** P <0.001，N = 15）。
图3。个别苍蝇机械震惊诱导的SLA。苍蝇花经历的SLA作为SLA强度的测量时间。在考察这两个突变体学士学位，二甲双胍显著降低了SLA的持续时间。采用Mann-Whitney U检验数据进行分析（* P <0.05; *** P <0.001，N = 15）。
图4。个别苍蝇机械震惊诱导的SLA。飞的SLA的比赛过程中的平均速度作为SLA的强度的度量。有在平均速度没有显著变化进行测试时，美联储二甲双胍两种BS突变体。采用Mann-Whitney U检验（N = 15）的数据进行了分析。
图5。个别苍蝇在舞台上的路径。痕迹代表个人苍蝇在15分钟监测期间走过在舞台上的路径。 一 ）积极的CS路径与莫飞vement集中在圆形竞技场的典型BSS飞B）路径的边缘。运动仍集中在外围，但有少得多的运动相比，CS苍蝇。 （巴表示1公分）
图6。飞运动时，接触到一个新的环境。个人果蝇放置在直径5厘米的舞台（5毫米高）和运动15分钟进行监控。分别计算每个蝇路径长度和平均长度取为每个基因型。在bss突变体所显示的显著减少路径长度相比，CS苍蝇。采用Mann-Whitney U检验数据进行分析（** P <0.01，N = 10）。
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Discussion
当检查的运动或运动模式在果蝇中 ，它才能够提取关于移动的距离信息，运动的速度和运动模式是有用的。为了提取这些信息，昂贵的设备在传统上一直采用的往往是望而却步那些希望谨慎4,8,9使用这样的检测更小的实验室或实验室。
此处所描述的测定法可用于确定行驶的距离（ 图2和6）的运动，速度（ 图4和7）的运动（ 图1和5）使用的设备，成本不到200美元，而图案。使用我们开发了Excel中的Visual Basic程序中，一系列的X，Y的ImageJ的程序可以分析提取这些信息产生的坐标。该系统具有以前被用来确定在癫痫发作敏感的果蝇突变体学士学位1 SLA的遗传和药理抑制。
尽管该系统可以提取有价值的信息，我们只分析了一只苍蝇在一个时间。这可以是一个显著缺点相比，高度并行的商业选项4。在多轨插件为ImageJ的的确具有同时跟踪多个目标的能力，但我们还没有试过这个选项。对于这个自发测定中，一个单一的苍蝇被放置在一个塑料培养皿盖。根据摄像机的位置，人们可以拍摄多个培养皿做平行录音。其缺点是分辨率会随着网络摄像头被定位成采取在一个更大的领域。这将如何影响记录的是不知道的完整性，但如果想追求平行录制的高端相机将是一种选择。
录音ð1这里是限制在15分钟，但也可以做更长的录音如果一个采用了64位版本的ImageJ的。 32位版本具有限制可以分析这些文件的大小内存限制。对于较长的记录，就必须使用64位版本的ImageJ的。
一个关于此方法的最大问题是，需要由在ImageJ的软件处理它产生的数据去除噪声。然而，这不是唯一的，以该方法作为类似噪声的问题，必须与其它记录选项3,5,6,8来解决。如在方法中所讨论的，当通过ImageJ的处理的静止苍蝇可显示运动的少量的，因为该程序从对象的中心测量的运动，这甚至可以在一个固定的物体不同，由于在光的波动和飞姿势。
我们的Visual Basic中的Excel程序使用一个滑动窗口分析来设定运动的门槛。此图像分割。d可以根据测定不同而不同。对于扣押的分析，滑动窗口看起来十记录点，横跨1秒的实时性。如果蝇已经移动0.5cm或更在这段时间被认为是积极地抓住。如果是更小，它被认为是静止的。看时的正常运动，下阈 值是需要的确定的切断与这必须通过试验和错误来实现。 0.1厘米/秒的阈值被用于这项研究。实现这一目标的最佳途径是记录了一只苍蝇，而它是静止的一小段时间，然后调整截止使其指示在录制过程中并无任何变动。
总之，这种低成本的方法代表一个可行的分析，提取有关飞行运动的各种参数有意义的信息。这是一个理想的筛选技术用来确定是否一个行为，遗传或药理操纵对运动或癫痫敏感性的影响。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者还希望表达感谢克里斯刻录机，斯蒂芬·麦金尼，劳拉·托宾，珍妮Gilbreath，阿什利日Olley，梅根·奥费，以及梅根海德他们在微调工作，此法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WebCam | Logitech | Pro900 | Any quality webcam will suffice. |
| HandiAVI time-lapse software | Azcendant software | Latest version can be found at http://www.azcendant.com/ | |
| ImageJ | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Multiracker Plug-In | NIH | Latest version can be found at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Vortexer | VWR | Vortex Genie 2 | Most standard size vortexers such as the Vortex Genie 2 will suffice. |
| 5 cm Petri dish cover | LabM Limited | D011 | Smaller or larger Petri dish covers can be used for an arena in movement assay. |
| Light box | custom made | Built from scrap material. Illumination is used for the locomotion assay. Depending on the room lighting, it is possible to perform the assay without the light box. |
References
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