Hastalar ve İnsan endotel hücrelerinden türetildiği Prostat dolaşımdaki tümör hücrelerinin arasında E-selektin aracılı Etkileşimleri gözlemleyin vitro Yöntemi
Summary
Bizim rapor fizyolojik akış koşulları altında prostat kanserinde CTC / EC etkileşimleri görselleştirmek ve analiz etmek için eşsiz bir yöntem açıklanır.
Abstract
Metastaz tümör hücrelerinin ikincil bir niş damar dışına ve form erişim sağlamasını ve böylece, birincil tümör intravasate kan vasküler ve lenf sistemi için tutacak edildiği bir süreçtir. Kan damar sistemi için tümör hücrelerinin ekstravazasyon farklı hücre hatlarından elde edilen endotelyal hücreleri (EC) ve tümör hücreleri kullanılarak incelenebilir. İlk çalışmalar, statik koşullar kullanılarak yapılmıştır ancak iyi EC fizyolojik akış koşulları altında farklı davranır olduğu belgelenmiştir. Bu nedenle, farklı akım odası düzenekleri henüz EC'ler ile kanser hücresi etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Akım akışı odası takımları, farklı kesme stres koşullarında farklı hücre hatları veya sıvının kullanarak tekrarlanabilir sonuçlar sunuyoruz. Ancak, gözlemlemek ve bu tümör hücrelerini (KTC) dolaşan gibi nadir hücreleri ile etkileşimleri çalışmak için, bazı değişiklikler geleneksel akış odası montaj yapılacak gerekmektedir. KTCkan hücrelerinin milyonlarca arasında nadir bir hücre popülasyonu vardır. Sonuç olarak, kapalı zaman eğrileri saf bir popülasyonu elde etmek zordur. Normal olarak, dolaşımda bulunan farklı hücre tipleri ile kapalı zaman eğrileri kirlenmesi mevcut zenginleştirme ya da tükenme teknikleri kullanılarak kaçınılmazdır. Bu raporda, biz floresan etiket dolaşan prostat kanseri hücreleri için benzersiz bir yöntem tarif ve kendine monte akış odası sistemine EC'lere olan etkileşimlerini araştırır. Bu teknik bundan başka, prostat kapalı zaman eğrileri ve ilgi duyulan herhangi bir protein arasındaki etkileşimi gözlemlemek için uygulanabilir.
Introduction
Metastaz az anlaşılmaktadır karmaşık çok-adımlı bir işlemdir. E-selectin/selectin ligand ekseni vasküler endotel ve kanser hücrelerinin 1,2 arasında birinci yapışkan etkileşimi teşvik ederek tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Farklı E-selektin ligand (lar), tümör hücreleri tarafından eksprese 3 ise endotel (E)-selektin, aktive edilmiş endotel hücreleri tarafından eksprese edilen bir transmembran proteindir. Çok sayıda in vitro yaklaşımların başarılı bir tümör hücrelerinin ve endotel hücreleri arasındaki E-selectin/selectin ligand etkileşimlerini (EC) 1 Modele kullanılmıştır. Bu etkileşimleri çalışmak için, farklı akış odası sistemleri, kan damar sistemini simüle etmek için istihdam edilmektedir. Akış odası montajları arasında, EC'ler ile bağlantılı olarak paralel plaka akış bölmesi (PPFC) rutin olarak vivo kesme stresi koşulları simüle eden bir in vitro modeli olarak kullanılır. Bu bağlamdayöntemi, EC 35 mm çanak üzerinde yetiştirilen ve bir tek tabaka elde sonra, EC PPFC bağlı olan ve kayma gerilme tabanlı deneyleri yapılmaktadır.
Bununla birlikte, PPFC ve mevcut sistem hasta ve EC'ler türetilen tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin), dolaşımdaki arasında yapışma etkileşimleri incelemek için pek çok sınırlamalar mevcut temel olarak, kapalı zaman eğrilerinin kan hücrelerinin milyonlarca arasında dolaşan, primer tümörden döken hücre nadir nüfus, çünkü (1 CTC 9 kan hücreleri başına 10) 4. Bu nedenle, kültürlenmiş hücre çizgileri sınırsız kaynağı aksine, düşük CTC sayısı çalma analiz için etkileşimleri kaydetmek için uygun bir akış kanalı genişliği gerektiren, çok az ve nadir CTC / EC etkileşimleri yol açar. Hasta kapalı zaman eğrilerinin elde edilen saf olmayan bir nüfus olduğu ek olarak, bu nedenle tanımlama işareti özel olarak CTCS izlemek için gereklidir. Bu sorunu çözmek için, biz (PCA) CT prostat kanseri tespit etmek için yeni bir yöntem geliştirdiCs neredeyse tüm bu kapalı zaman eğrileri, kendi hücre yüzeyinde 5,6 prostat spesifik zar antijeni (PSMA) belirtisi göstermesi gerçeğinden yararlanarak. Bu raporda, biz sonunda metastaz mekanizmasını anlamak için, EC 'ile prostat CTC etkileşimleri çalışmak için yeni sistemin potansiyel yarar göstermek için, prostat kanseri hücre hattı MDA PCa2b (MDA) kullanılır.
Metodoloji vivo vasküler sistemde 7-9 taklit çeşitli kesme bazlı deneyler için uygulanabilir. PKa CTC / EC etkileşimleri incelemek Bunun yanı sıra, akım odası sistemi kolayca periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ya da analiz EC'ler ile tümör hücrelerinin etkileşimleri için adapte edilebilir. Sökülmesi ve akış odasının Reassembling kolaylığı, bir mikroslayd III (0.1) (bundan sonra mikroslayd olarak anılacaktır), perfüzyon ve pr ikna etmek için farklı sitokinler ile ECS uyarıcı altında kültür ECS sağlarifadesini otein. Bunun yanı sıra, kültürlü EC, örneğin E-ve P-selektin, rekombinant proteinleri, tümör hücreleri ile Mikroslayd ve etkileşimler üzerine kaplanabilir laminar akış koşulları altında 10 gözlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nedeniyle kan hücreleri arasında kapalı zaman eğrileri düşük sayıda, bu hücre popülasyonu olarak saf CTCS izole etmek güçtür. CTC / EC etkileşimleri çalışmak için, kapalı zaman eğrileri nadir ve saf olmayan nüfus iki büyük zorluklar teşkil etmektedir: Kan hücrelerinin arasında kapalı zaman eğrileri a) belirlenmesi; b) CTC / EC etkileşimlerinin Gözlem.
Kan hücreleri arasında prostat CTCS belirlenmesi ilk sınırlamasını aşmak içi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Bölümü Savunma-Prostat Kanseri Araştırma Programı (W81XWH-12-1-0124) fon tarafından desteklenen, Ulusal Kanser Enstitüsü, ve Robert McCooey Genitoüriner Onkoloji Araştırma Fonundan U54CA143876. Biz HUVECler sağlamak için VE-kaderin antikorları sağlamak için Dr Annarita Lorenzo (Patoloji Anabilim Dalı) teşekkür etmek istiyorum, ve Dr Marco Seandel (Cerrahisi Anabilim Dalı) olacaktır.
Materials
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Tygon | AAQ04103 | |
| Male luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer. Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).
- Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis. Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).
- Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer. Cancer Res. , (2013).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).
- Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers. Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J Vis Exp. 24, (2009).
- Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp–/rag2– mice. Gut. 62 (5), 741-750 (2013).
- Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).
- Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. Adhesion of tumor cells under flow. Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).
- Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium. Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).
- Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development. Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).
- Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion. Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).
- Carman, C. V., Springer, T. A. A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them. J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).
