在体外的方法来观察派生病人和人内皮细胞前列腺循环肿瘤细胞之间的E-选择素介导的相互作用

Summary

我们的报告描述了一种独特的方法来可视化和分析生理流动条件下，在前列腺癌CTC / EC相互作用。

Abstract

转移是一个过程，其中肿瘤细胞从原发肿瘤intravasate血液血管和淋巴系统散出，从而接触到外渗形成一个次级定位。肿瘤细胞从血液中血管系统的渗漏可以通过从不同的细胞系获得的内皮细胞（EC）和肿瘤细胞进行研究。最初的研究是使用静态条件下进行，但也得到了很好的记载，内皮细胞的生理流动条件下表现不同。因此，不同的流动腔室组件当前被用于研究内皮细胞与癌细胞相互作用。电流流室组件使用提供了在不同的剪切应力条件下两种不同的细胞系或液体可重复的结果。然而，观察和研究稀有细胞如循环肿瘤细胞（CTCs的）的相互作用，还需要一定的变化作出常规的流室组件。车辆检验中心是在数以百万的血细胞的罕见细胞群。其结果是，难以得到的CTC的纯群体。使用目前富集或耗损技术的CTC的污染与不同类型的细胞中循环通常存在是不可避免的。在本报告中，我们描述了一种独特的方法，以荧光标记的循环前列腺癌细胞，并研究在自组装的流动腔室系统它们与内皮细胞的相互作用。这种技术还可以进一步应用到观察前列腺的CTC和任何感兴趣的蛋白质之间的相互作用。

Introduction

转移是一个复杂的多步骤的过程，仍然知之甚少。该E-selectin/selectin配体轴已被证明通过促 ​​进血管内皮细胞和癌细胞^1,2之间主要粘附相互作用在肿瘤转移中发挥重要作用。内皮（E）-选择素是由活化的内皮细胞上表达的跨膜蛋白，而不同的E-选择素配体（s）是由肿瘤细胞表达^3。许多体外方法已被成功地应用到模型的肿瘤细胞和内皮细胞之间E-selectin/selectin配体相互作用^{（ECS）1。}为了研究这些相互作​​用，不同的流室系统被用来模拟血液血管系统。之间流动室组件，平行平板流动腔室（PPFC）与内皮细胞一起被常规用作体外模型模拟体内剪切应力条件。在这种方法，内皮细胞生长在35毫米培养皿，并实现了单层后，内皮细胞附着到PPFC和剪切应力为基础的实验中进行。

然而，PPFC和其它现有系统存在许多局限性，研究循环从患者和内皮细胞衍生的肿瘤细胞（CTCs的）之间的粘合相互作用主要是因为CTCs的是一种罕见的细胞群，从原发肿瘤脱落，其中数百万的血细胞循环（1 CTC每10 ⁹血细胞^）4。因此，无限量供应的培养细胞系的不同，低CTC计数导致很少和罕见的四氯化碳/ EC相互作用，需要适当的流道宽度来记录回放分析的相互作用。此外，由于来自患者的车辆检验中心是不纯的人口，因此识别标记是需要在特定的跟踪检验中心。为了解决这个问题，我们开发了一种新的方法，以确定前列腺癌（PCa）的CTCS通过利用几乎所有这些的CTC的表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）在其细胞表面^5,6的事实的优点。在这份报告中，我们使用了前列腺癌细胞株，MDA PCa2b（MDA）含量，以展示我们的新系统来研究前列腺四氯化碳相互作用与内皮细胞的潜在效用，最终以了解有无转移的机制。

我们的方法可以应用于各种基于剪切实验模拟体内血管系统^7-9。除了检查前列腺四氯化碳/ EC相互作用，电流流室系统可以很容易地适应用于分析的外周血单核细胞或肿瘤细胞“与内皮的相互作用。拆卸和流动室的重新组装的简易性，一个^{microslideⅢ（0.1）（}以下简称microslide），使培养内皮下灌注和刺激内皮细胞有不同的细胞因子以诱导PRotein表达。此外，培养的内皮细胞，重组蛋白，如E-和P-选择素，可涂覆在microslide和相互作用与肿瘤细胞可以层流条件¹⁰下被观察到。

Protocol

1，培养内皮细胞上Microslides观察四氯化碳内皮的相互作用

1. 根据组织文化引擎盖，第一冲洗microslide，1毫米，用PBS通道宽度。轻轻外套用200μl的50微克/毫升用1毫升鲁尔锁注射器纤连蛋白（溶于PBS中）的microslide。
2. 盖上盖子的microslide，并保持它的组织培养罩内30分钟。在microslide液体的慢分配可防止气泡形成的通道。
3. 灌注200μl的温水（37℃）的HUVEC的生长培养基（M199媒体，1M HEPES，20％FBS，5毫克/毫升肝素，100μg/ ml的内皮细胞生长因子，和L-谷氨酰胺）在microslide孵育20分钟，在室温。在灌注，准备HUVEC细胞悬液。
4. 冲洗脐静脉内皮细胞用PBS加0.05％胰蛋白酶-EDTA在室温1-2分钟。离心机在内皮细胞在180×g离心5分钟2毫升生长培养基。
5. 使用neuba测量细胞浓度UER血球并准备10 ⁷个细胞HUVEC微升生长培养基。然后，小心地从用200微升枪头microslide的入口取出介质。
6. 使microslide到眼睛的高度，并用1毫升的鲁尔锁注射器，轻轻灌注200μl的脐静脉内皮细胞的制备的浓度的进入通道。注意，需要在这一步，以防止泡沫的形成。如果出现气泡，保持灌流一个稍长的时间，直到气泡进入出口通道。
7. 放HUVEC媒体等体积的（约80微升）在这两个入口和microslide的插座。这可以防止细胞在两个方向上的流动。
8. 覆盖滑动，并保持它在培养箱（37℃）为1.5小时。

2，准备流室组件的隔夜培养的HUVEC在Microslide

1. 放置一个无菌的20毫升注射器，女性和男性的鲁尔连接器，管道和注射器泵在培养箱中培养15分钟Ñ​​。
2. 对于最小的死体积，使用与0.04英寸内径的管道。较小的管径可以防止泡沫的形成。
3. 用温水（37℃）介质内皮细胞（12毫升）填充20毫升注射器。安装与连接器的油管到注射器。除去气泡。这个组件连接到microslide。
4. 完全充满HUVEC媒体microslide的入口。使填充20毫升的注射器连接到连接器旁边的microslide。轻轻将连接器连接到microslide。
5. 使集上放入培养箱，并将其连接到注射器泵中，设置在10微升/分的剪切速率。离开细胞O / N在孵化器在37°C
6. 第二天，通过去除附着在microslide的入口连接器拆卸的设置。
7. 上调内皮细胞上的E-选择素的表达，制备含IL-1β在10在4毫升媒体纳克/毫升的新鲜生长培养基。吸媒体在10毫升注射器。除去叔他从microslide的入口媒体和注射器连接到幻灯片中。
8. 设定注射器泵以10微升/分的剪切速率为在孵化4小时。

3，抗PSMA的制备（J591-488）标记的前列腺癌细胞

1. 在内皮细胞中IL-1β孵育，制备抗PSMA J591-ALEXA488标记前列腺癌细胞。添加0.05％胰蛋白酶-EDTA对MDA细胞1分钟。请勿将细胞胰蛋白酶更长的时间，因为它可以影响存在于细胞表面的糖肽。酶无细胞解离试剂，也可用于代替胰蛋白酶。离心机在200×g离心5分钟。
2. MDA重悬细胞沉淀于1毫升的H / H缓冲液（Hanks平衡盐solution/0.1％HSA/10毫米肝素钠/ 1毫米氯化钙_2）。添加抗PSMA J591-ALEXA488抗体在黑暗的地方20微克/毫升在室温30分钟。在温育过程中重悬细胞。
3. 30分钟后，离心分离，在800×g离心5分钟，将细胞溶液。 ASPI率和悬浮颗粒在1ml H / H缓冲液中。计数标记的MDA的细胞和使终浓度为1×10 ⁶细胞/ ml。填补5毫升注射器J591-488标记的MDA细胞及消除气泡。

4，抗PSMA（J591-488）标记的CTC富集的前列腺癌患者的制备

1. 收集7.5毫升血液前列腺癌患者在一个蓝色的帽筒（含柠檬酸钠）。轻轻地稀释血液1:1 0.1％BSA / 1毫摩尔EDTA / PBS中。
2. 加5.3毫升的Ficoll-Paque上加在50ml的锥形管中。层稀释血液的菲可帕克的顶部。离心机在400×g离心30分钟。
3. 预涂所有的管子或提示来在接触的CTC用2％FBS/RPMI-1640 / 1毫米氯化钙_2/4毫摩尔MgCl _2（R / S缓冲液），以防止的CTC的非特异性结合到表面上。维护媒体和缓冲区来与接触的CTC 4°C的温度。
4. 收集的外周血单核细胞（PBMCs）中馏分含的CTC从另一个50毫升锥形管中装有30ml的R / S缓冲器的接口。离心机在400×g离心8分钟。
5. 重悬沉淀，并在400×g离心8分钟的R / S缓冲洗一遍。离心后，沉淀重悬在H / H缓冲液中。添加抗PSMA J591-488抗体在黑暗的地方20微克/毫升在室温30分钟。
6. 30分钟后，离心分离含J591-488标记的CTC，在800×g离心5分钟的PBMC。重悬在H / H缓冲。填补1-ml注射器（预涂覆的R / S缓冲液中）与样本。

5，准备显微镜，注射泵和流动室组件

1. 打开倒置显微镜和设置柯勒照明在10X物镜。使注射器泵以相同的水平显微镜的试样台上，并将其设置为1达因/厘米²的剪切应力（〜10微升/分钟）。
2. 打开蔡司的AxioVision软件。选择计算机屏幕上的目标。创建一个新的在该软件中的工具选项文件夹。
3. 在的AxioVision打开智能实验选项，并调整设置为30分钟记录短短30秒的视频。
4. 对于实时荧光的视频，设置图像选项 - 12毫秒曝光，2×2箱，5增益。这些参数，可以在实现视频接近视频帧速率（〜每秒23帧）与蔡司MRM相机。
5. 可视化的流道的整个宽度在计算机屏幕上10 X目标，使用C型安装转接器（0.63 xf/60 mm接口）。
6. 开关上的水银灯。
7. 将注射器和含有细胞的连接器上的注射器泵。
8. 带来的IL-1β刺激的HUVECs从孵化器。请将此接头连接到含有内皮细胞的microslide的填充进口通道。
9. 连接的出口通道与连接到管道的连接器。把管子插入一盘菜或15毫升锥形管通过收集流量。
10. 启动infusi上通过microslide以10μl/分钟。观察内皮细胞和MDA标记细胞或下488纳米过滤器是来自于患者的落射荧光显微镜标记的CTC之间的相互作用。
11. 开始记录实验的30秒短片。在播放过程中分析，测量滚动速度。轧制速度除以细胞随时间移动的距离测量。

该Microslide 6。免疫染色

1. 对IL-1β刺激血管内皮细胞MDA灌注细胞10分钟后，从microslide的入口和出口中取出介质。
2. 用200微升尖，放温水（37℃）PBS中含有钙和镁成microslide 5分钟的入口。利用其作为盖在板凳上的一个道具倾斜microslide。保持microslide在一个倾斜的位置为免疫染色在所有的温育。
3. 修复血管内皮细胞由暖灌注2％的甲醛进入入口
4. 添加曲拉通X-100（0.1％）在PBS中5％BSA于室温10分钟。
5. 用PBS漂洗两次，每次5分钟。用在PBS中的5％BSA阻断30分钟。
6. 孵育一抗山羊抗VE-钙粘蛋白（1:100）在2.5％BSA的O / N在4℃下
7. 第二天，用PBS洗两次，每次5分钟。添加辅助驴抗山羊647抗体45分钟。用PBS，每次5分钟洗涤两次。
8. 在室温下孵育以人源化J591-ALEXA488缀合的抗体1小时。
9. 用PBS，每次5分钟洗涤两次。加DAPI 5分钟。用蒸馏水5分钟洗净。
10. 添加PBS（或MOWIOL对于长期贮存）。可视化的共聚焦显微镜下microslide。

Representative Results

图1显示了内皮细胞上的microslide单层的O / N培养。 图1A上的定标显示，microslide 100％是可见用5X物镜，而70％是可见的用10倍的目标（ 图1B）。对于E-选择素介导的相互作用，细胞滚动的边缘不认为这使得microslide的70％以上，可用于视频录制和回放分析。根据我们的经验，最初这个设置程序集需要一些练习来培养内皮细胞的剪切应力作用下单层。在microslide建立EC生长之后，我们标记的MDA，前列腺癌细胞。使用MDA细胞掺入的健康供体的血液和标记有荧光标记的抗PSMA J591-488单克隆抗体J591-488抗PSMA抗体的特异性进行测试。没有PSMA免疫染色观察到的PBMC（数据未显示）。为了排除这种J591-488结合和内阿尔特的可能性RS滚行为，我们标记MDA细胞J591-488，并与未标记细胞的MDA在剪切应力范围从1〜10达因/厘米²的滚动行为。的方块图显示了这两个未标记的和J591-488-标记的MDA细胞对IL-1β刺激的内皮细胞在不同的剪切应力条件下的滚动速度的分布。没有显著差异，观察在轧制速度在1和5达因/厘米^2时 ，p = 0.634和p = 0.601，分别为（ 图2）。在10达因/厘米²高的剪切应力，未标记的滚动速度和J591-488-标记的MDA细胞（P <0.05）之间，观察到统计学显著差异。以前的研究表明，在较高的剪切应力（> 3达因/厘米^2）的条件下，减少肿瘤细胞粘附和轧辊上的EC相比较低的剪切应力条件^11,12。因此，研究分析肿瘤细胞和内皮细胞之间的相互作用在较低的剪切应力进行。钍我们，我们的数据表明，车辆检验中心可以带有J591-488和车辆检验中心的那个荧光标记不会显著影响在大范围的剪切应力的滚动行为。值得注意的是，我们没有发现任何四氯化碳/ EC相互作用在没有ECS（数据未显示）中IL-1β刺激。此外，作为原则的证明，我们还标有丰富的CTC分离CRPC患者与J591-488和过度灌注IL-1β刺激内皮细胞。一时间缝制的视频显示了不同类型的前列腺的CTC和内皮细胞之间的相互作用（ 视频1）。该视频展示了三种类型的相互作用，稳定的附着力（CTCs的根本即使经过30秒不分离），网络共享（CTCs的重视和重新连接），并没有互动。 Microslides可以容易地进行免疫染色和荧光图像可以采取因为microslides具有相似的光学特性为1.5毫米厚的玻璃罩^7， 图3所示的J591-488标记的MDA细胞船尾的牢固的粘合呃过度灌注IL-1β刺激内皮细胞。

图1：血管内皮细胞上的microslide培养的单层内皮细胞培养O / N在纤维连接蛋白（50微克/毫升）涂microslide三^（0.1）的剪切应力作用下（1达因/厘米^2）A）在5X目标。 （EC计划NEOFLUAR 5X/0.16），观察与培养的内皮细胞完整的流道宽度。该通道的宽度进行测量，为1,545.95微米。B）在10倍的目标（计划NEOFLUAR 10X/0.3 PH1），1,065.79通道微米进行了观察。这表明，内皮细胞可以培养O / N上microslide和microslide的70％是在10倍放大下可见。 请点击此处查看大图已经rsion这个数字。

MDA细胞对内皮细胞的图2。滚动速度培养的microslide。一百万未标记和J591-488标记的MDA细胞过度灌注IL-1β刺激的HUVECs。十大视频在上microslide不同的领域被记录了在1,5，和10达因/厘米^2。剪切应力的计算是由制造商提供。进行离线分析的滚动速度。 N =细胞计数的滚动速度测量的数量。箱形图显示了轧制速度和J591-488标记的和未标记的MDA细胞之间的平均差异的分布。 P <0.05，Wilcoxon秩和检验。圆圈代表的离群值。 请点击这里为viEW这个图的放大版本。

MDA细胞与内皮细胞上的microslide相互作用的图3。免疫染色。一百万MDA细胞灌注过的IL-1β刺激的HUVECs在1达因/厘米²的剪切应力。灌注后，免疫染色的microslide执行。黄色箭头显示的MDA细胞牢固地粘附于内皮细胞。 PSMA =红，VE-钙粘蛋白=绿色，DAPI =蓝色。合并后的新图像显示了所有的颜色。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频1视频显示IL-1β刺激血管内皮细胞和抗PSMA在前列腺癌患者富含J591-488标记的CTC之间的相互作用。单层Øf是内皮细胞培养在含有的CTC从患者富集的^{microslideⅢ（0.1）}和抗PSMA J591-488-标记的外周血单个核细胞（PBMC）中的灌注上的HUVECs在1达因/厘米^2。在灌注，短短30秒的视频记录，在对microslide不同的领域。视频的采集时间会显示在左下角。不同的短片被缝合在一起来编译此视频。在2点16分36秒时，无相互作用CTC进入视左上字段;在二时19分16秒，另一个非交互四氯化碳进入视左上角领域;在二时23分12秒，一个稳定的坚持反恐委员会在视图顶部中间场被看见。在2点38分09秒，一个稳定地附着CTC被认为是对右侧的视场的被看见。同时使用明场和荧光通道显示外周血单个核细胞之间的相互作用，以及这段视频拍摄。在二点40分18秒，稳定地附着的CTC中观察到的视图的顶部中间场。使用明场这段视频拍摄和荧光通道显示外周血单个核细胞中的滚动行为。从二时51分39秒至2时51分49秒，一个CTC参展圈养行为观察的视图底部的字段中。 点击此处查看视频。

Discussion

由于CTCs的血细胞中的数量低，这是难以分离的CTC作为信元的纯群体。为了研究四氯化碳/ EC相互作用，车辆检验中心的稀有和不纯的人口带来了两大挑战：1）血细胞中车辆检验中心鉴定的;二）四氯化碳/ EC相互作用观察。

为了克服识别血细胞中前列腺车辆检验中心的一个限制，我们注意到，几乎所有的前列腺肿瘤细胞表达PSMA ⁶的事实。单克隆抗体J591-488是内在下列细胞表面结合这表明前列腺癌的CTC可以被标记的体外研究和四氯化碳/ EC互动^13。对抗体和免疫荧光最大的最优的内化，我们培养的MDA细胞与抗体在任4℃或37℃或30分钟或1小时。我们观察到最大免疫荧光观察到37℃30分钟（数据未显示）和前列腺细胞免疫荧光标记与未标记的前列腺细胞相比，并没有影响到轧制的行为。

为了克服第二个限制，我们测试了不同的流室组件，例如PPFC，Bioflux微流体系统，并Microslides ^7。该PPFC已经成为中流砥柱，研究生理流动条件下^，9内皮细胞与白细胞和肿瘤细胞之间的相互作用。该流动系统的正常工作，研究大量的细胞，如肿瘤细胞系的相互作用，但是不理想的观察和研究稀有细胞，如患者来源的CTC和内皮细胞之间的相互作用。的CTC，即稀有细胞，可与内皮随机在流动通道的任何位置进行交互，因此，需要记录在流路的整个宽度上的播放过程中分析来观察和分析的CTC /内皮细胞之间的罕见事件的交互。钍在PPFC（2.5毫米）所用的硅橡胶垫片电子宽度不提供视满场下10倍的目标。同时，在较低的放大倍率超过10倍的物镜时，难以清楚地观察四氯化碳/ EC相互作用。另外，在连接管的低死体积是必不可少的，以避免在连接管的CTC的俘获。提供与标准PPFC硅橡胶连接管具有广泛的内径（0.16英寸）。与此相反，Bioflux微流体系统提供全视场下20X物镜，并且在研究中的EC ¹⁴的剪切造成的变化非常有用，但是，癌细胞开始在腔孔中，导致非均匀流动沉淀下来。 Bioflux微流体是在研究中的内皮细胞的剪切造成的变化非常有用，然而，它在技术上是麻烦的使用。使用microslide我们的自组装流室有一个狭窄的通道宽度（1毫米）比PPFC标准的通道宽度，让更多的观测际区域。此外，内皮细胞是根据灌注microslide模拟生理性血流培养，不像古利等^。7，其中内皮细胞在静态条件下生长的microslides（与更宽的通道宽度）的研究。连接管内的死体积减小通过使用一个连接管为0.02内径英寸总的来说，免疫前列腺肿瘤细胞的标记，适当的流道宽度，并且所述连接管的内径小使人们能找出前列腺的CTC和观察它们之间的相互作用与内皮细胞。

有在协议中几个关键步骤，但是，与适当的照顾实验可以流畅运行。防止气泡的是任何基于流的实验是至关重要的。根据我们的经验，用温水（37℃）生长培养基，连接器和注射器防止通过降低温度差异形成气泡。在additioN，护理应在连接注射器与microslide服用。两个附连到注射器和microslide的入口连接器，应填得满满的，由此，防止任何气泡的形成。其中一项技术的局限性在于，由于microslide通道为45×1毫米（长x宽），它只能容纳4.5微升生长培养基。因此，microslide不能用于静态培养，需要生长培养基的连续灌注，以防止酸化并维持营养物质的正常供应的HUVECs。然而，介质的连续供应，可以很容易地通过使用注射泵连接到在孵化器中microslide实现。而丰富的前列腺癌患者的CTC，应注意预涂覆所有的管子，提示，吸液管和注射器进来与R / S缓冲区的CTC，以防止非特异性结合接触。此外，所有的步骤之后，菲可 - 帕克密度梯度离心，电子XCEPT ​​J591-488抗体孵育后，应在4℃下进行，以防止的CTC的降解。

我们的技术是独特的，比较不同的方法理解CTC生物。本报告说明前列腺的CTC可行的荧光免疫标记它允许一个观察前列腺的CTCs的功能特点，除了刚才的表型特征。此外，所描述的方法需要低采样/试剂的体积比其它方法使其成为免疫荧光研究的理想系统。我们的方法提供了一个独特的平台，研究从病人和内皮源性​​前列腺检验中心之间的相互作用，从而有助于理解参与前列腺癌转移的发展机制。这种技术具有用于涉及剪切流为基础的研究，如细 ​​胞间的相互作用^8，细胞-蛋白质相互作用¹⁵的多个应用程序的潜在16，并在内皮¹⁴剪切引起的变化。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02