Summary
我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。
Abstract
転移は血管外遊出および二ニッチを形成するためのアクセスを取得することにより、腫瘍細胞が原発腫瘍intravasate血液血管およびリンパ系から脱落するプロセスである。血管系からの腫瘍細胞の血管外遊出は、異なる細胞株から得られた内皮細胞（EC）および腫瘍細胞を用いて研究することができる。初期の研究は、静的条件を用いて行ったが、それはウェルのECは生理的流れの条件下では異なる挙動を示すことが実証されている。したがって、異なるフローチャンバアセンブリは、現在のECによる癌細胞の相互作用を研究するために使用されている。電流フローチャンバアセンブリは、異なる剪断応力条件下での異なる細胞株または流体のいずれかを使用して再現性のある結果を提供する。しかしながら、このような循環腫瘍細胞（CTCの）のような希少細胞との相互作用を観察し、研究するために、特定の変更は、従来のフローチャンバアセンブリに行われる必要がある。 CTCの血液細胞数百万人のうち、稀な細胞集団である。これにより、CTCの純粋な集団を得ることは困難である。通常の循環で見られる細胞の異なるタイプのCTCの汚染が存在濃縮または枯渇の技術を使用して避けられない。本報告では、蛍光ラベル、循環前立腺癌細胞に固有の方法を説明し、自己組織化フローチャンバーシステムにおいて、電気部品との相互作用を研究する。この技術はさらに、前立腺のCTCおよび関心対象の任意のタンパク質間の相互作用を観察するために適用することができる。
Introduction
転移は、ほとんど理解さままで複雑な多段階プロセスである。 E-selectin/selectinリガンド軸は、血管内皮細胞と癌細胞との間の1,2主要接着剤の相互作用を促進することによって腫瘍転移において重要な役割を果たすことが示されている。内皮細胞（E）-セレクチン異なるE-セレクチンリガンド（単数または複数）は、腫瘍細胞3で表されているが、活性化された内皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。多数のインビトロのアプローチが成功裏に腫瘍細胞および内皮細胞（EC） は1〜E-selectin/selectinリガンド相互作用をモデル化するために使用されてきた。これらの相互作用を研究するために、異なるフローチャンバーシステムは、血管系をシミュレートするために使用されている。フローチャンバーアセンブリの中でも、電気部品と連動して平行プレートフローチャンバー（PPFC）が日常的にインビボせん断応力条件においてシミュレートインビトロモデルとして使用される。この中法のECは35-mmディッシュ上で増殖させ、単層を達成した後、電気部品は、PPFCに取り付けられており、せん断応力ベースの実験を行っている。
しかし、PPFC、その他の現在のシステムは、CTCのは、血液細胞の何百万人の間で循環して、原発腫瘍から脱落、細胞のまれな集団であるため、主に、患者とのECから派生（CTCの）循環腫瘍細胞の間の接着相互作用を研究するために多くの制約を提示（10 9血液細胞あたり1 CTC）4。従って、培養細胞株の無制限の供給とは異なり、低CTCカウントを再生分析のための相互作用を記録するために適切な流路幅を必要とする非常に少数のまれなCTCおよび/ EC相互作用をもたらす。患者派生のCTCが不純な集団であることからさらに、したがって、識別マーカーは、特定の内のCTCを追跡するために必要とされている。この問題を解決するために、我々は、前立腺癌（PCaの）CTを同定する新しい方法を開発Csの実質的にすべてのこれらのCTCのは、それらの細胞表面上で、5,6、前立腺特異的膜抗原（PSMA）を発現するという事実を利用することにより。本稿では、転移のメカニズムを理解するために、最終的には、ECの前立腺のCTCの相互作用を研究するために我々の新しいシステムの潜在的な有用性を実証するために、前立腺癌細胞株、MDA PCA2B（MDA）を使用しました。
私たちの方法論は、生体内血管系7-9 にシミュレートする様々なせん断基づく実験に適用することができます。 PCaのCTC / ECの相互作用を調べることに加えて、現在のフローチャンバーシステムを容易に電気部品で末梢血単核細胞または腫瘍細胞の相互作用を分析するように適合され得る。分解·フローチャンバーの再組み立ての容易さ、（以下、マイクロスライドという）マイクロスライドIII（0.1）は 、灌流の下で培養のECを可能にし、PRを誘導するために種々のサイトカインでのECを刺激otein式。加えて、培養された電気部品、例えば、E-およびP-セレクチン組換えタンパク質は、腫瘍細胞と相互作用し、マイクロスライド上に被覆することができる層流状態10で観察することができる。
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Protocol
観測CTC - 内皮相互作用のためのマイクロスライド上の1。培養のHUVEC
- 組織培養フードの下では、まず、PBSで1mmのチャネル幅をマイクロスライドをすすぐ。優しくコート1ミリリットルルアーロック注射器を用いて50μg/ mlのフィブロネクチン（PBSに溶解）200μlのマイクロスライド。
- 蓋付きのマイクロスライドをカバーし、30分間組織培養フードの中に保管してください。マイクロスライド内の液体の遅い分注は、チャネル内の気泡の形成を防ぐことができます。
- マイクロスライド上に温かい（37°C）HUVEC増殖培地200μl（M199培地、1M HEPES、20％FBS、5 mg / mlのヘパリン、100μg/ mlの内皮細胞成長因子、及びL-グルタミン）を灌流し、インキュベートRTで20分。灌流中、HUVEC細胞懸濁液を調製。
- PBSでのHUVECをすすぎ、室温で1〜2分間、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5分間180×gでの2mlの増殖培地中でHUVECを遠心分離機。
- neubaを用いて細胞濃度を測定UERの血球計数器および増殖培地μL10 7のHUVEC cells/100を準備します。その後、慎重に200μlのピペットチップを用いてマイクロスライドの入口からメディアを取り出します。
- 目の高さにマイクロスライドを持参し、1 mlのルアーロック注射器を用いて、そっとチャンネルにHUVECの準備濃度の200μLを灌流。注意気泡形成を防ぐために、この段階で必要とされる。気泡が表示された場合、気泡が出口チャネルを入力するまで、わずかにより長い時間灌流キープ。
- マイクロスライドの入口と出口の両方でのHUVECメディア、等量の（〜80μl）を置く。これは、いずれかの方向における細胞の流れを防止する。
- スライドをカバーし、1.5時間、インキュベーター（37℃）に保管してください。
ミクロスライド上で一晩HUVEC文化のためのフロー商工総会の2。準備
- 15マイルのためのインキュベーター内の滅菌20 mlの注射器、メスとオスルアーコネクタ、チューブ、シリンジポンプを配置N。
- 最小限のデッドボリュームの場合は、0.04インチの内径のチューブを使用しています。より小さなチューブ径が気泡形成を防止する。
- 温かい（37℃）、HUVEC培地（12ml）で20 mlの注射器を埋める。注射器の上にコネクタを備えたチューブを取り付けます。気泡を除去する。マイクロスライドにこのアセンブリを接続します。
- 完全HUVEC培地でマイクロスライドの入口を埋める。マイクロスライドの横のコネクタに接続され満たされた20 mlの注射器を持参してください。静かにマイクロスライドにコネクタを取り付けます。
- インキュベーターにセットアップを持参し、10μL/分のせん断速度に設定したシリンジポンプに接続します。 37℃のインキュベーター内で細胞のO / Nを残す
- 次の日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクタを削除することで、セットアップを分解します。
- ECの上、E-セレクチンの発現を上方制御するために、4ミリリットルのメディアが10 ng / mlの時に、IL-1βを含む新鮮な増殖培地を準備します。 10 mlの注射器でメディアを吸引除去する。 Tを削除彼マイクロスライドの入口からメディアやスライドにシリンジを接続します。
- インキュベーター内で4時間10μL/分の剪断速度でシリンジポンプを設定します。
3。抗PSMAの調製（J591-488）ラベル前立腺癌細胞
- HUVECのIL-1βのインキュベーションの間、抗PSMA J591-をAlexa488ラベルのPCa細胞を調製。 1分間MDA細胞を0.05％トリプシン-EDTAを追加します。それが細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を与えることができるように長い時間のために、トリプシンに細胞を放置しないでください。酵素を含まない細胞解離試薬はまた、代わりに、トリプシンを使用することができる。 5分間200×gで遠心分離する。
- 1ミリリットルのH / Hバッファー（ハンクスsolution/0.1％HSA/10のHEPES / 1のCaCl 2）でのMDA細胞ペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-のAlexa488抗体を追加します。インキュベーション中に細胞を再懸濁。
- 30分後、5分間800×gで細胞溶液を遠心する。 ASPIレートと1ミリリットルのH / Hバッファにペレットを再懸濁します。標識されたMDA細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度をもたらす。 J591-488ラベルされたMDA細胞を5 mLの注射器を記入し、気泡を除去。
PCaの患者から4。抗PSMAの調製（J591-488）ラベルのCTCエンリッチ
- （クエン酸ナトリウムを含有する）は青キャップチューブに前立腺癌患者から7.5ミリリットルの血液を収集する。穏やかに0.1％BSA / 1 mMのEDTA / PBS中の血液1:1に希釈する。
- 5.3ミリリットルフィコール·パックプラス50mlのコニカルチューブに追加します。層は、フィコール·パックの上に血を希釈した。 30分間400×gで遠心分離する。
- プレコート全てのチューブまたは先端が2％FBS/RPMI-1640 / 1mMのCaCl 2/4のMgCl 2表面へのCTCの非特異的結合を防ぐために、（R / S緩衝液）を用いたCTCと接触する。 CTCのと接触メディアとバッファの4℃の温度を維持する。
- 末梢血単核細胞（PBMC）を画分を集め30ミリリットルのR / Sバッファを含む別の50 mlのコニカルチューブ内のインタフェースからのCTCを含む。 8分間400×gで遠心分離する。
- ペレットを再懸濁し、8分間、400×gでR / S緩衝液中で再度洗浄する。遠心分離した後、H / Hバッファーでペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-488抗体を追加します。
- 30分後、J591-488を含む遠心PBMCを、5分間、800×gでのCTCを標識した。 H / Hのバッファに再懸濁。試料と（R / S緩衝液で予めコーティング）1mlシリンジを充填する。
5。顕微鏡の準備、シリンジポンプおよびフロー商工総会
- 倒立顕微鏡の電源をオンにして、10倍の対物レンズでケーラー照明を設定します。顕微鏡の試料ステージと同じレベルで、シリンジポンプを持参し、1ダイン/ cm 2のせん断応力（〜10μL/分）で設定してください。
- ツァイスAxioVisionのソフトウェアを起動します。コンピュータ画面上の目的を選択します。新規作成ソフトウェアの[ツール]オプションの下にあるフォルダ。
- AxioVisionのスマート実験オプションを開いて、30分間の短い30秒のビデオを記録するために設定を調整します。
- ライブの蛍光ビデオ、画像オプション-12秒露出、2×2ビン、5ゲインを設定します。これらのパラメータは、ツァイスMRMカメラでビデオのフレームレート（毎秒約23フレーム）に近いビデオを達成するのに役立ちます。
- コンピュータの画面に10のX目的で流路の幅全体を可視化するために、Cマウントアダプター（0.63 xf/60 mmインタフェース）を使用します。
- 水銀ランプのスイッチをオンにします。
- シリンジとシリンジポンプ上に細胞を含むコネクタを配置します。
- IL-1βは、インキュベーターからのHUVECを刺激させる。 HUVECをを含むマイクロスライドの塗りつぶされた入口チャネルへのコネクタを接続します。
- チューブに取り付けられたコネクタと出口チャネルを接続します。フロースルーを収集するために皿または15ミリリットルコニカルチューブにチューブを入れる。
- infusiを開始10μL/分でマイクロスライドを通して上。内皮細胞間の相互作用を観察し、MDA細胞またはエピ蛍光顕微鏡で488 nmのフィルタの下に患者に由来するラベルのCTCのラベル。
- 30秒の短いビデオなどの実験の記録を開始。再生分析中に、ローリング速度を測定。圧延速度は、経時的に細胞が移動した距離を割ることによって測定される。
ミクロスライドの6。免疫染色
- 10分間、IL-1βで刺激したHUVECにMDA細胞を灌流した後にマイクロスライドの入口と出口からメディアを取り出します。
- （37°C）をPBSで5分間、マイクロスライドの入口にカルシウム及びマグネシウムを含有する200μlのチップを用いて、暖かい置く。ベンチで小道具としての蓋を使用してマイクロスライドを傾けます。免疫染色時に全てのインキュベーションのために傾いた位置にマイクロスライドを保管してください。
- 入口に暖かい、2％ホルムアルデヒドを灌流によってHUVECをを修正しました。
- RTで10分間PBS中5％BSAにトリトンX-100（0.1％）を添加する。
- 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 30分間、PBS中の5％BSAでブロックする。
- 一次抗体ヤギ4℃で2.5％のBSA、O / Nでの抗VE-カドヘリン（1:100）でインキュベート
- 次の日、5分間ずつPBSで2回洗浄します。 45分間二次ロバ抗ヤギ抗体647を追加します。 5分間ずつPBSで2回洗浄します。
- 1時間ヒトJ591-のAlexa488結合抗体で、室温でインキュベートする。
- 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 5分間、DAPIを追加します。 5分間蒸留水で洗ってください。
- PBSを追加する（または長期保存のためのMowiol）。共焦点顕微鏡下でマイクロスライドを可視化する。
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Representative Results
図1に、マイクロスライド上のECの単分子層のO / N培養を示しています。 図1Aにスケーリングはマイクロスライドの100％が70％の10倍の対物レンズ（ 図1B）を使用して表示されている間に5 倍の対物レンズを使用して表示されていることを示しています。 E-セレクチン介在性相互作用のため、エッジにローリング細胞は録画と再生の分析のためのマイクロスライドの70％以上を利用できるようにしたとは見なされません。我々の経験では、最初にこのセットアップアセンブリは、せん断応力下で培養するためにECの単層をいくつかの練習が必要です。マイクロスライド上でECの増殖を確立した後、我々は、前立腺癌細胞を標識MDA。 J591-488、抗PSMA抗体の特異性は、健康なドナーの血液にスパイクし、抗PSMA J591-488モノクローナル抗体を蛍光標識で標識しMDA細胞を用いて試験した。無PSMA免疫染色（データは示さず）PBMCにおいて観察されなかった。 J591-488結合および内部移行アルテという可能性を除外するために、RSは行動を転がり、我々は、J591-488とMDA細胞を標識し、1〜10ダイン/ cm 2の範囲のせん断応力で標識されていないMDA細胞と転がり挙動を比較した。ボックスプロットは、異なるせん断応力条件におけるIL-1βで刺激されたECの両方と非標識J591-488で標識したMDA細胞のローリング速度の分布を示す。有意差は1で圧延速度で観察されなかった、それぞれ5ダイン/ cm 2ではp = 0.634およびp = 0.601、（ 図2）。 10ダイン/ cm 2のより高いせん断応力で、統計学的有意差は未標識の圧延速度とJ591-488で標識したMDA細胞に（p <0.05）の間で観察された。以前の研究では、高いせん断応力（> 3ダイン/ cm 2）の条件で、少数の腫瘍細胞が付着し、下側せん断応力条件11,12と比較してのEC上でロールすることを示している。従って、腫瘍細胞と電気部品との間の相互作用を分析する研究は、より低いせん断応力で行われる。目私たち、我々のデータは、CTCのは、J591-488とし、CTCの蛍光標識が大幅にせん断応力の広い範囲でのロール挙動に影響を与えないことを標識することができることを示唆している。注目すべきことに、我々は、電気部品（データは示さず）のIL-1β刺激の非存在下で任意のCTC / ECの相互作用を検出しなかった。また、原理の証明として、我々はまた、J591-488とのCRPC患者から分離し、IL-1βで刺激されたECの上に灌流濃縮のCTCのラベル。時間ステッチビデオは、前立腺のCTCとのEC（ ビデオ1）の間の相互作用の様々なタイプを示しています。ビデオは相互作用 - 安定した接着（のCTCでも30秒後に切り離していなかった）、テザリング（のCTCは、添付して再接続）、無相互作用の3タイプを示しています。マイクロスライドを容易に免疫染色することができ、マイクロスライドは、厚さ1.5mmのカバーガラス7と同様の光学特性を有するため、蛍光画像を撮影することができる。 図3 J591-488標識しMDA細胞後方の強固な接着を示すIL-1βで刺激されたECオーバーER灌流。
図1：マイクロスライド上で培養内皮細胞の単層 HUVECを培養し、O / Nが5倍の対物レンズでのせん断応力下でのフィブロネクチン（50μg/ ml）をコーティングしたマイクロスライドIII（0.1）（1 DYN / cm 2）を A）にあった（ECプランNeofluar 5X/0.16）は、培養された電気部品との完全な流路幅が観察された。チャネルの幅は、1,545.95であると計測された。B）10X対物レンズ（プランNeofluar 10X/0.3 Ph1の）では、チャネルの1,065.79程度を観察した。これは、電気部品は、マイクロスライド上で、O / Nで培養することができ、マイクロスライドの70％が10倍の倍率で表示されていることを示唆している。 VEの拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のrsion。
図2。のEC上でMDA細胞のローリング速度は、マイクロスライド上で培養した。一万人の非標識及びJ591-488ラベルされたMDA細胞は、IL-1βで刺激されたHUVEC上で灌流した。マイクロスライド上の様々な分野で10のビデオを1,5で記録し、10ダイン/ cm 2で行った。せん断応力の計算は、製造業者によって提供された。圧延速度のオフライン分析を行った。 nは圧延速度測定のために計数した細胞数。ボックスプロットは、ローリング速度とラベルされたJ591-488の間の中央値の差異および未標識のMDA細胞の分布を示す。 P <0.05、ウィルコクソン順位和検定。円は異常値を表しています。 VIにこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をEW。
図3。MDA細胞の免疫染色は、マイクロスライド上の電気部品との対話。一万円MDA細胞は、1ダイン/ cm 2のせん断応力でのIL-1βで刺激されたHUVEC上で灌流した。灌流後、免疫染色をマイクロスライド上で実施した。黄色の矢印はしっかりのECに付着したMDA細胞を示しています。 PSMA =赤、VE-カドヘリン=緑、DAPI =ブルー。マージされた画像は、すべての色を示しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ビデオ1。IL-1βで刺激されたHUVECおよび前立腺癌患者から富化抗PSMA J591-488で標識したCTCの間の相互作用を示す映像。単層oをHUVECをマイクロスライドIII（0.1）上で培養したCTCを含有する抗PSMA J591-488-標識された末梢血単核細胞（PBMC）は、患者から富化fは1ダイン/ cmでのHUVEC上で灌流した。灌流中、短い30秒のビデオは、マイクロスライド上の異なるフィールドで、記録した。映像の取得時間は、左下隅に示されている。別の短いビデオ動画をコンパイルするに縫い合わせた。 2時16分36秒で、非相互作用のCTCは、ビューの左上のフィールドに入ります。午前2時19分16秒で、他の非相互作用のCTCは、ビューの左上隅のフィールドに入ります。 2時23分12秒で、ビューの上部中央の分野で安定的に付着し、CTCが見られます。 2時38分09秒で、安定的に付着し、CTCが見られているが、視野の右側に見られている。このビデオは、同様にPBMCの相互作用を示すことが明視野および蛍光チャネルの両方を使用して撮影した。 2時40分18秒で、安定的に付着したCTCのは、ビューの最上部真ん中分野で観察された。この動画は、明視野を使用して撮影されたPBMC中のロール挙動を示すために、蛍光チャンネル。 2時51分39秒から2時51分49秒を通じて、CTCの展示テザリングの動作は、ビューの下のフィールドで観察された。 ビデオを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
による血液細胞の間でのCTCの数が少ないために、それは、細胞の純粋な集団としてのCTCを単離することは困難である。 CTC / ECの相互作用を研究するために、CTCの稀で、不純な人口は、2つの主要な課題提起：血液細胞の間でCTCのa）の特定を; B）CTC / ECの相互作用の観察。
血液細胞のう ち、前立腺のCTCを同定する第一の制限を克服するために、我々は、事実上すべての前立腺腫瘍細胞を6 PSMA を発現するという事実を利用した。モノクローナル抗体J591-488は、細胞表面のPCaのCTCを標識することができることを示唆している結合ex vivoで以下の内部化とCTC / ECの相互作用13のために研究されている。抗体および免疫蛍光極大の最適な内在化のために、我々は30分または1時間のいずれかのために4℃または37℃のいずれかで抗体を用いてMDA細胞をインキュベートした。我々は最大の免疫蛍光が観測されたことを観察した37°Cで30分間（データは示さず）および前立腺細胞の免疫蛍光標識のために非標識前立腺細胞と比べてロール挙動に影響を与えなかった。
第二の制限を克服するために、我々はそのようなPPFC、Biofluxのマイクロ流体システム、およびマイクロスライド7などの異なるフローチャンバーアセンブリをテストしました。 PPFCは生理的流れの条件の下でのEC 9と白血球および腫瘍細胞の相互作用を調べるための主力となっています。このフローシステムは、例えば、癌細胞株のような多数の細胞の相互作用を研究するために良好に機能するが、そのような患者由来のCTCおよび電気部品などの稀な細胞間の相互作用を観察し、研究することは理想的ではない。 CTCのは、希少な細胞であること、そのため、流路の幅全体の記録、再生、分析中のCTC / ECの間の稀な事象の相互作用を観察し、分析するために必要となる、流路内の任意の位置にランダムに電気部品と対話することができます。目PPFC（2.5ミリメートル）で使用されるシラスティックガスケットのE幅は10倍対物レンズ下で全視野を提供していません。一方では、10X対物レンズよりも低い倍率で、それは明らかCTC / EC相互作用を観察することが困難となる。また、接続管が低いデッドボリュームは、連結チューブ中のCTCの捕捉を避けるために不可欠である。標準PPFCを備えシラスティック接続管は広い内径（インチ0.16）を持っています。逆に、Biofluxのマイクロ流体システムは20Xの目的の下で全視野を提供し、ECの14のせん断誘発性の変化を研究する上で有用であるが、癌細胞は不均一な流れにつながるチャンバーウェル中で落ち着い開始。 Biofluxマイクロフルイディクスは、しかし、それは使用することは技術的に煩雑であり、ECのせん断誘発性の変化を研究する上で有用である。マイクロスライドを使用した我々の自己集合したフローチャンバーは、より観測を可能にする、PPFCにおける標準的なチャネル幅より狭いチャネル幅（1 mm）を有するtionalエリア。また、電気部品は、グリーらとは異なり、生理的な血流をシミュレートするマイクロスライドの灌流下で培養される。7、電気部品は、静的条件下で（広いチャネル幅を有する）マイクロスライド上で増殖させる研究。接続管内部デッドボリュームが集合的に、前立腺腫瘍細胞の免疫蛍光標識、適切な流路幅、接続チューブの小さい内径0.02インチの内径と接続管を使用することによって減少する一方、前立腺のCTCを同定することを可能にし、のECとの相互作用を観察します。
プロトコルのいくつかの重要なステップは、適切な注意を払って実験がスムーズに実行することができます、しかし、があります。バブルの防止は、どのフローベースの実験のために重要である。我々の経験では、温かい（37℃）増殖培地、コネクタ、およびシリンジを用いて、温度差を低減することによって、気泡の形成を防止する。 additio中マイクロスライドで注射器を接続しながら、N、注意が必要です。両方の注射器とマイクロスライドの入口に取り付けられたコネクタは、任意の気泡形成を防止し、それによって、あふれんばかりに満たされる必要があります。技術の制限の1つは、マイクロスライドチャネル45×1ミリメートル（長さ×幅）であるので、それだけで、増殖培地中の4.5μLを保持することができることである。したがって、マイクロスライドを静置培養のために使用し、酸性化したHUVECのための栄養素の適切な供給を維持するのを防止するために、増殖培地の連続灌流を必要とすることができない。しかし、培地の連続供給を容易にインキュベータ内マイクロスライドに接続されたシリンジポンプを用いて達成することができる。前立腺癌患者からのCTCを富化しながら、注意をプレコート全てのチューブ、チップ、ピペット、シリンジ、および非特異的結合を防止するためにR / S緩衝液でのCTCと接触するように注意すべきである。フィコール·パック密度遠心分離した後に加えて、すべてのステップ、EXCEPT J591-488抗体インキュベーション、CTCの劣化を防ぐために4℃で実施すべきである。
私たちの技術は、CTCの生物学を理解する別の方法に比較してユニークである。今回の報告は1だけで表現型特性に加えて、前立腺CTCの機能的な特徴を観察することができる前立腺CTCの実行可能な蛍光免疫標識を説明しています。また、記載されている方法は、免疫蛍光研究のための理想的なシステム作り、他の方法よりも低いサンプル/試薬量を必要とします。我々の方法は、前立腺癌転移の発達に関与するメカニズムを理解するのを助ける、従って、前立腺癌患者由来のCTCと電気部品との間の相互作用を研究するためのユニークなプラットフォームを提供する。この技術は、細胞間相互作用8と剪断流に基づいた研究は、細胞-タンパク質相互作用15を含む複数のアプリケーションの可能性を有する16、およびECの14のせん断による変化。
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Disclosures
博士バンダーは、この記事で使用したJ591抗体のためにコーネル研究財団（「CRF」）に割り当てられている特許に関する発明である。博士バンダーはコンサルタントであるMLN-2704の特許は、さらなる研究と開発のためのCRFによってライセンスされていると、会社の株式を所有しています。
Acknowledgments
この作品は、米国国立がん研究所から国防総省前立腺癌研究プログラム（W81XWH-12-1から0124）の、U54CA143876、ロバートMcCooey泌尿生殖器がん研究基金からの資金によってサポートされていました。私たちは、HUVECをを提供するためのVE-カドヘリン抗体を提供し、博士マルコSeandel（外科）博士Annaritaロレンツォ（病理部）に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Plastic tubing | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Male Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Female Luer adapter | GlycoTech | 31-001 | |
| Syringe pump | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Luer-lock syringe | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 medium | Sigma | M7653 | |
| Endothelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology | ||
| Interleukin-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Trypsin | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Department of Surgery | provided by Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objective | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Enzyme free cell dissociation reagent | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque plus | GE healthcare | 17-1440-02 |
References
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