En modifierad<em> In vitro</em> Invasion analys för att fastställa den potentiella roll Hormoner, cytokiner och / eller tillväxtfaktorer vid medie Cancer Cell Invasion

Summary

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Abstract

Blodserum fungerar som en kemoattraktant mot vilken cancerceller migrerar och invadera, underlätta deras intravasering i mikrokärl. De faktiska molekylerna mot vilken cellerna migrera förblir gäckande. Denna modifierade invasion analys har utvecklats för att identifiera mål som driver cellmigration och invasion. Denna teknik jämför invasionen index under tre villkor för att fastställa om ett specifikt hormon, tillväxtfaktor, eller cytokin spelar en roll i att förmedla den invasiva potentialen hos en cancercell. Dessa villkor omfattar i) normalt fetalt bovint serum (FBS), ii) träkol-strippad FBS (CS-FBS), som avlägsnar hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner och iii) CS-FBS + molekyl (betecknad "X"). En betydande förändring i cellinvasion med CS-FBS jämfört med FBS, indikerar inblandning av hormoner, cytokiner eller tillväxtfaktorer vid medie förändringen. Enskilda molekyler kan sedan läggas tillbaka till CS-FBS att analysera deras förmåga att återvers eller rädda invasionen fenotypen. Vidare kan två eller flera faktorer kombineras för att utvärdera additiva eller synergistiska effekter av flera molekyler i körning eller hämma invasion. Sammantaget gör denna metod utredaren att avgöra om hormoner, cytokiner, och / eller tillväxtfaktorer spelar en roll i cellinvasion genom att fungera som kemoattrahenter eller hämmare av invasion för en viss typ av cancer cell eller en specifik mutant. Genom att identifiera specifika kemoattraktanter och hämmare, kan denna modifierade invasion analys bidra till att belysa signalvägar som styr cancercellinvasion.

Introduction

En ny invasion analys har utvecklats med målet att identifiera medverkan av specifika hormoner, cytokiner och / eller tillväxtfaktorer som kemoattraktanter i cancercellinvasion. Förmågan hos tumörceller att invadera genom den extracellulära matrisen (ECM) är ett kännetecken för den metastatisk fenotyp ^1-3. Invasion kammare har i stor utsträckning använts som in vitro verktyg för att studera cancercellinvasion och migration och kan ge kunskap om mekanismerna för in vivo tumörinvasion och metastas. Kamrarna består av cylindriska cellodlingsinlägg kapslade inom brunnarna i cellodlingsplattor. Bottnarna hos skären är semipermeabla polykarbonat eller polystyren membran av definierade porstorlekar.

I standardinvasionsanalys, celler sås på insatsmembran med serumfritt medium och placeras i cell odlingsbrunnar som är fyllda med serum eller serumliknande kemoattraktanter till set upp en chemoattractive kraft. Denna kraft enheter celler att röra sig genom semi-membran (migration) eller alternativt genom en beläggning av extracellulär matrix (invasion), som sedan kan färgas med konventionella färgämnen för att detektera och kvantifiera antalet celler. Cellnumret därefter normalis enligt omfattningen av migration och invasion i en icke-invasiv cellinje. Denna metod tillåter en undersökare att utvärdera den invasiva potentialen hos olika celltyper under en mängd olika förhållanden, inklusive genetiska manipulationer.

Hormoner, cytokiner och tillväxtfaktorer är kritiska komponenter i serum och i allt större utsträckning visat sig vara associerade med att köra den invasiva fenotypen ^4. Men naturen, roll, och specificitet av dessa chemoattractive serum molekyler i medla invasion fortfarande svårfångade. Utmaningen kvarstår att avgöra vilka specifika faktorer i serum eller serumliknande kemoattraktanter ansvarar för körningcancercellinvasion samt vilka molekyler kan hämma invasionsprocessen. I denna rapport beskriver vi en metod för att utvärdera den potentiella medverkan av hormoner, cytokiner och / eller tillväxtfaktorer som finns i serum, som molekyler som driver kemoattraktion och invasionen av cancerceller.

I denna föreslagna modifierat protokoll, är träkol stripp används för att avlägsna hormoner, cytokiner och tillväxtfaktorer från 2% fetalt bovint serum (FBS) för att generera 2% kol strippad FBS (CS-FBS). Både 2% FBS och 2% CS-FBS används som medel för att ställa in chemoattractive kraft för att driva cancercellinvasion. Använda 2% CS-FBS som chemoattractive agent i jämförelse med normala 2% FBS ger flera fördelar, inklusive första och mest framträdande, förmågan att studera cancer invasionen fenotyp i den reducerade / relativa frånvaro av hormoner, cytokiner och tillväxtfaktorer. Det möjliggör också utredaren att bedöma om den kollektiva borttagning av hormoner, tillväxtfaktorer, och cytokines orsakar en ökning eller minskning i den invasiva indexet. Analysen är sedan utformade för att bestämma huruvida tillsatsen av en individuell komponent, som betecknas som "X" kan hämma, minska, öka, eller återställa den invasiva indexet till sitt ursprungliga värde (se figurerna 2 och 3). Även om denna metod är specifik för att uppnå de fysiologiska nivåerna av den komponent som avlägsnas från serum under träkol stripp bör det också noteras att träkol stripp också kan påverka signaltransduktionsvägar. Till exempel har det rapporterats att träkol stripp kan minska alkaliskt fosfatas aktivitet osteoprogenitorceller celler och inducerar adipogenes genom reduktion av MAPK aktivatorer ^5. Charcoal avskalade medier är kommersiellt tillgängliga och är baserade på det protokoll som beskrivs som kombinerar träkol med dextran och inkuberades med fetalt bovinserum O / N ^6.

Denna analys utvecklades i RespoNSE till ett resultat som rapporterats av et al. Zucker ⁷ Författarna visade att en mutant fenotyp som påverkar kanalförbindelsekommunikation visade en ökning i invasionen indexet vid migrering mot media med normal 2% FBS. Denna ökning eliminerades med substitution av träkol-strippad serum. Från detta resultat drog författarna att denna mutant påverkade migrationen mot en lipofil molekyl (mer specifikt, ett hormon, tillväxtfaktor eller cytokin) ^7. Det är väl känt att hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner medierar signalvägar som är involverade i tumörpromotion och invasion ^4. Sålunda är det viktigt för vetenskapliga utredare att avgöra vilken faktor (er) driver tumörinvasion av deras särskilda cancerceller eller mutanter under studie. Analysen är utformad för att ta itu med den roll som individuella komponenter på deras fysiologiska koncentration som bestämts i enlighet med skillnaden mellan koncentrationen av komponenten &# 8220; X "i normalt FBS och CS-FBS. Genom utvecklingen av denna analys, kan utredarna få mer insikt i den specifika invasiva väg styr deras system.

Hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner har ofta klassificerats som tumörpromotorer ^8. Några av dessa faktorer såsom EGF används som direkta källor för kemoattraktanter i invasionskamrarna ^9. Således verkar det troligt att dessa utgör de viktigaste komponenterna i serum som direkt tumörinvasion. Detta protokoll föreslår en enkel, men ändå signifikant, modifiering av den konventionella in vitro-invasionsanalys som tillåter en undersökare att bedöma medverkan av hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner vid mediering av invasiv potential av cancerceller. Dock är analysen utformad för att ge utredaren med ett svar på om förfarandet kommer att vara effektiva för sin studie på ett tidigt steg i analysen, för att inte använda dyrbar tid och resources om det bedöms onödigt. Denna metod använder CS-FBS och förlitar sig på utredare diskretion om vilka molekyler att driva som bly kandidater som potentiellt medierar cancercellinvasion. Resultaten från dessa analyser skulle visa sig vara användbara för att identifiera vilka serumkomponenter fungerar som kemoattraktanter eller hämmare för särskilda cellinje eller mutant som studeras. Dessutom kan denna metod hjälpa utredaren identifiera viktiga signalvägar antingen främjar eller hämmar cancercellinvasion; därmed styra framtida läkemedelsdesign.

Protocol

1. Förbered de olika medierna och tilläggskomponenter Före experimentera, förbereda media bestående av DMEM eller andra specificerade media med tillägg av antingen normal FBS, kol strippad FBS, eller kol strippad FBS plus den komponent som ska testas. Notera att flera komponenter kan testas i varje experiment. Väg ut och späd hormoner, tillväxtfaktorer eller cytokiner lämpligt att vara lösta i kol strippad serum vid den fysiologiska koncentrationen. 2. Fö…

Representative Results

Invasionen index beräknas för varje tillstånd enligt normalisering till en icke-invasiv cellinje. För våra experiment använder vi 1205Lu melanomcellinjen och etablerade variant stabila cellinjer som våra invasiva linjer samt premaligna icke-invasiv varianten, WM793 från vilken 1205Lu cellerna härleddes 10 som tjänar som en logisk kontroll. Vi använder även kollagen I som invasionen matrisen eftersom det är den främsta komponenten i dermis. Detta är i enlighet med en tidigare studie som innebär…

Discussion

Tumörmetastas är en flerstegsprocess. Cellerna måste bryta igenom basalmembranet, intravasate i antingen lymfsystemet eller blodmikrokärl, i vilka de transporteras till avlägsna platser. Tumörcellerna extravasera sedan och kolonisera i en macrometastasis ^12. Progression genom epiteliala till mesenkymala övergång (EMT), tumörinvasion och metastaser har förbättrats genom steroidhormoner ^13,14, faktorer tillväxt ^15-18, och cytokiner ^19-21. Dessa molekyler är så avg?…

Materials

Item	Vendor	Catalog #	Comments/Description
BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates)	Corning	354578	polyethylene teraphthalate (PET) membranes
Collagen I, rat tail	Corning	354236	Source = rat tail tendon, purity = 90%
Fixative; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin
Fetal bovine Serum	Life Technologies	16000	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12676	Designated as CS-FBS
Fetal bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	Designated as CS-FBS