Summary
Sygdomsfremkaldende mutationer i actin kan ændre cytoskelet funktion. Cytoskeletal dynamik kvantificeres gennem billeddannelse af fluorescens mærkede proteiner ved hjælp af total intern fluorescens mikroskopi. Som et eksempel har cytoskeletprotein, Aip1p, ændret lokalisering og bevægelse i celler, der udtrykker mutant actin isoform R256H.
Abstract
Mutationer i actin forårsage en række humane sygdomme på grund af specifikke molekylære ændringer, som ofte ændrer cytoskelet funktion. I denne undersøgelse, billeddannelse af fluorescens-mærkede proteiner ved hjælp af total intern fluorescens (TIRF) mikroskopi anvendes til at visualisere og kvantificere ændringerne i cytoskeletale dynamik. TIRF mikroskopi og brug af fluorescerende tags også mulighed for kvantificering af ændringer i cytoskeletal dynamik forårsaget af mutationer i aktin. Ved at bruge denne teknik, kvantificering af cytoskeletal funktion i levende celler værdifuldt supplement in vitro-undersøgelser af protein funktion. Som et eksempel har missense mutationer påvirker actin rest R256 blevet identificeret i tre humane actin isoformer tyder denne aminosyre spiller en vigtig rolle i regulatoriske interaktioner. Virkningerne af actin mutation R256H på cytoskeletal bevægelser blev undersøgt ved hjælp af gær-modellen. Proteinet Aip1, der er kendt for at hjælpe cofilin i actin depolymerisering varmarkeret med grønt fluorescerende protein (GFP) ved N-terminalen og spores in vivo under anvendelse TIRF mikroskopi. Satsen for Aip1p bevægelse i både vildtype og mutant-stammer blev kvantificeret. I celler, der udtrykker R256H mutant actin er Aip1p bevægelse begrænset, og hastigheden af bevægelsen er næsten halvdelen af den hastighed, målt i vildtype-celler (0,88 ± 0,30 mM / sek i R256H celler i forhold til 1,60 ± 0,42 mM / sek i vild type celler, s. <0,005).
Introduction
Actin er den dominerende protein, der omfatter cytoskeleton og deltager i kritiske cellulære processer, herunder celledeling, organelle bevægelse, celle motilitet, sammentrækning, og signalering. Gennem det seneste årti, har sygdomsfremkaldende mutationer i actin blevet opdaget i hver af de seks menneskelige aktin isoformer, der fører til en række lidelser, fra myopathies til koronararteriesygdom 1-7. De processer, som actin mutationer fører til sygdom fortsætter med at blive belyst. Gæren model fortsat guldstandarden til at studere de biokemiske virkninger af mutationer på actin funktion på grund af de fordele ved den fælles væsentlige actin isoform, genetisk sporbarhed og høj bevarelse af actin sekvens og funktion. Undersøgelser viser, at individuelle actin mutationer føre til molekylære specifikke dysfunktioner med dominerende negative virkninger 8. For eksempel døvhed-forårsager mutationer i γ-non-muskel actin som påvirker Lys-118 rest ændre regulering afactin-bindende protein Arp2 / 3 9. Undersøgelser ofte anvender in vitro-analyser af protein: protein-interaktioner. Undersøgelser af virkningen af actin mutationer på cellebiologi og navnlig actinbindende protein lokalisering i cellen er begrænsede.
Undersøgelser af gær cytoskeleton in vivo konventionelt afhængige billeder af fikserede celler fra et inverteret fluorescensmikroskop 10. Disse eksperimenter leveres fundamentale data om morfologien af actin cytoskeleton. Undersøgelser har siden indarbejdet tredimensionel konfokal billedbehandling for at visualisere den komplekse cytoskeletal netværk 11, 12. Denne billeddannelse tillader kvantificering af overflod og relative placering af actin patches og filamenter. Tyndslib elektron tomografi er blevet brugt til billede morfologi de tætte trådformede netværk i forhold til bevarede subcellulære strukturer 13. Overfyldte cellulære sgangarter med et lille tværsnit kan undersøges i fine detaljer med denne teknik. Billeddiagnostiske undersøgelser er blevet udvidet til levende celler ved hjælp af tidsforskydningen fluorescerende mikroskopi. Når foto blegning og baggrundsfluorescens kan modereres, tid bortfalder billeddannelse giver undersøgelser, at dynamikken i cytoskeletproteiner og reaktionen på miljøforhold 11, 14. Separat blev visualisering af dynamikken i actinfilamenter in vitro fremført ved indførelse af total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Sammenlignet med bredt felt mikroskopi TIRF har fordelen af reduceret baggrundsfluorescens og forbedret kontrast til at overvåge individuelle filamenter 15, 16. Med disse kvaliteter har TIRF mikroskopi blevet tilpasset af cellebiologer at overvåge cellulære strukturer på plasmamembranen 17, 18. Cellulære begivenheder, herunder ændringer i cytoskelettet, kanvisualiseres realtid med lav fototoksicitet, maksimal kontrast og minimal baggrund fluorescens 19.
For bedre at forstå virkningen af actin mutationer på bevægelse, lokalisering, og omsætningen af cytoskeletale proteiner i cellen, TIRF mikroskopi og protein tagging blev anvendt. Heri er fremgangsmåder til at studere virkningerne af en klinisk relevant mutation i actin på cytoskeletale dynamik i Saccharomyces cerevisiae beskrevet. Specifikt lokalisering og bevægelse af actinbindende protein Aip1p blev visualiseret og kvantificeret i celler, der udtrykker R256H mutation i actin. Disse teknikker supplere in vitro biokemiske undersøgelser og giver mulighed for en større forståelse af protein interaktioner og funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kloning i PB1996 Plasmid
- Design og orden DNA-primere fra et oligonukleotid produktionsvirksomhed, der flankerer målsekvensen og indeholder unikke restriktionssteder i den valgte forælder plasmid. BEMÆRK: I dette tilfælde blev primere designet til at amplificere 400 basepar ved 5 'enden af Aip1 sekvens. XhoI-restriktionssted blev inkorporeret i primeren omkring 20 bp før Aip1 sekvens og Xmal blev medtaget omkring 20 bp efter målet Aip1 sekvens. Plasmidet, der anvendes til kloning var PB1996, som indeholder en 3XGFP tag for fluorescens, en URA genet for gærstamme udvælgelse og et ampicillinresistensgen for bakteriel valg.
- Oprens genomisk DNA fra en Ura-gær haploide stamme. Bemærk: Se figur 1 for et diagram af kloning proces.
- Køre en standard-PCR-reaktion ved anvendelse af de to primere og gær genomisk DNA til at amplificere Aip1p genet med restriktionsstederne på enten end.. Skær PCR produktet og PB1996 plasmidet med restriktionsenzymer i separate reaktioner pr producenten anbefalede protokoller. I dette tilfælde Xmal og Xhol blev anvendt med den medfølgende buffer ved 37 ° C i 1 time.
- Kør en 0,8% agarose-gelelektroforese for at adskille de fordøjede DNA-fragmenter. I et godt, indlæse en lav DNA masse stigen og i separate brønde, indlæse hele reaktion fra hver fordøjelse. Kør gelen ved 100 volt i ca 1 time, indtil farvefronten er nær enden af gelen. Visualisere gelen under UV-lys og rense ud segment, der svarer til protein segment og snittet plasmid.
- Ligere fordøjet Aip1 segmentet og PB1996 plasmid. Omdan produktet i DH5a-celler ved anvendelse producentens protokoller (10 pi DNA med 100 celler ul i 30 minutter på is, varmechok ved 42 ° C i 2 minutter, vokser i SOC medier i 2 timer ved 37 ° C) og pladen på dyrkningsplader der omfatter antibiotika til selektion, i dette tilfælde LB +Amp plader. Vælg og vokse en koloni i flydende kultur. Rense nydesignede plasmid.
2.. Mutant gærstamme Generation
- Brug en haploide gærstamme, i hvilken actin allelet er blevet slettet for at opbygge en mutant gærstamme. Bemærk: I dette tilfælde forældrestammen var en generøs gave fra Dr. Peter Rubenstein (University of Iowa) og konstruktionen blev beskrevet af Cook et al 20 Denne stamme mangler kromosomalt actin-genet og indeholder et plasmid, der koder for vildtype-gær. actin og uracil.
- Brug af PRS, plasmid, der koder vildtype gær actin med en Trp + udvælgelse som base plasmid til mutagenese 21.
- Udfør mutagenese på PRS plasmid til ingeniør missense mutation i actin.
- For R256H mutation i actin, gør primeren 5 'ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3' for at ændre Arg 256 til hans 256.. Kør en standard mutagenesePCR-reaktion med plasmid fra trin 2.2.
- Omdan mutant actin plasmid fra PCR i DH5a-celler. Isoler plasmid-DNA og sekventere actingenet at kontrollere mutation.
- Transformer plasmid, der koder mutant gær actin i det haploide gærstamme fra trin 2.1.
- Kultur de transformerede celler på Trp-plader for at selektere for gær indeholdende Trp + indeholdende mutant gær actin plasmid.
- Vælg for celler mangler den oprindelige plasmid, der koder for vildtype actin og uracil (beskrevet i 2.1) ved sub-dyrkning af celler fra Trp-plader på plader, der indeholder 5-fluoroorotinsyre (5-FOA). 5-FOA omdannes til giftige form 5-flurouracil i yeas stammer, der udtrykker det funktionelle URA3-gen. De celler, der vokser efter trinvis udvælgelse vil kun indeholde mutant actin-plasmid.
- Renses plasmid-DNA fra den nye gærstamme. Sekventere plasmidet for at sikre mutant actin-genet er til stede. Brug denne stræne i yderligere undersøgelser. Denne fremgangsmåde er afbildet i figur 2.
3.. Omdannelse af Plasmid i gærceller
- Fordøje Aip1p-GFP plasmid med et restriktionsenzym for at tillade integration i gærkromosomet. BEMÆRK: restriktionssted skal være uden for sekvensen blok, der indeholder fluorescerende tag, genet af interesse, og selektionsmarkør. I dette tilfælde skal du bruge 1 ml af Hpal restriktionsenzym med 8 ul DNA og 1 pi af det medfølgende 10x buffer i 1 time ved 37 ° C.
- Kultur S. cerevisiae-celler (fra trin 2.5), der ikke er i stand til at syntetisere uracil (Ura-stamme) natten over i 5 ml i YPD medier (1% gærekstrakt, 2% pepton og 2% dextrose) på et hjul ved 30 ° C. Spin down 1 ml af cellerne i 5 minutter ved 1.000 x g.
- Foretag PLATE blanding. Gør 10XTE ved tilsætning af 5 ml 1 M Tris pH 7,5 og 2 ml 250 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til 43 ml dobbeltdestilleret 2 O. Tilføj 00,204 g lithium acetat til 20 ml 1XTE, så 8 g polyethylenglycol (PEG) (MW ~ 3.300) og Filtersteriliser.
- Dekanteres supernatanten fra cellerne spundet ned i trin 3.2, og cellerne resuspenderes i den resterende væske. Til de suspenderede celler, tilsættes 2 pi 10 mg / ml lakse testes bærer-DNA. Der tilsættes 10 ul af det fordøjede plasmid-DNA fra trin 3.1 og vortex. Tilsæt 0,5 ml plade og vortex. Tilsæt 20 ul 1 M DTT og vortex.
- Inkuber blandingen i 6-8 timer ved 25 ° C. Varmechok cellerne i et vandbad ved 42 ° C i 10 min. Plate 100 ul celler fra bunden af mikrocentrifugerør hvor de har etableret ud på en-Ura plade. Inkuber ved 30 ° C i 2-3 dage, eller indtil kolonier formular.
- Vælg individuelle kolonier og streak ud på en-Ura plade. BEMÆRK: Disse celler indeholder plasmidet med Aip1-GFP og Ura gen integreret i kromosomet, giver mulighed for vækst. Disse celler vil derefter blive anvendt i microscopy.
4.. Visualisere Aip1p Protein Movement Brug total indre refleksion fluorescensmikroskopi
- Dyrk en kultur af gærceller med indbygget Aip1p-GFP i YPD natten over på et hjul ved 30 ° C. Subkultur 1 ml af natten over kultur i 9 ml-Ura medier. Grow cellerne for en yderligere 3-4 hr på en ryster ved 30 ° C for at sikre, at de er i log vækstfase.
- Tilsæt 3 ul celler til et objektglas og tilføje et dækglas. Lad cellerne at bosætte sig på diaset i 5 min. Placer dias i beslaget på bordpladen.
- Overhold Aip1p-GFP-proteinet med en total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskop (488 nm) ved hjælp af en olie fordybelse 100X TIRF objektiv og en digital CCD-kamera. Brug SlideBook 5.0-software, få billeder til 20 sek med en hastighed på 5 billeder / sek (Individuelle rammer af erhvervede billeder er præsenteret i figur 2A).
- At fokusere på calen, åben SlideBook 5.0-software og klik på knappen Focus Vindue i værktøjslinjen for at få adgang til fokus kontrol. Vælg fanen Omfang, og vælg 100X-TIRF mål. Tænd lampen på og skub lampe bar til 15%. Skift indstillingen Bin til 2 x 2. Skift filter til lyse felt.
- På mikroskopet, skal du bruge den fine fokus drejeknappen for at bringe cellerne i fokus som ses på computerskærmen.
- Brug af kontrolelementer i Focus Window, slukke lampen, skifte filteret til Live, og klik på TIRFM knappen.
- På TIRFM illuminator fastgjort til den højre side porten af mikroskopet, drej laseremissionsniveauet til On.
- Vælg fanen Stream i Focus Window, markere feltet ud for at starte optagelsen, og klik derefter på lyse knap felt.
- På TIRFM illuminator, drej mikrometer for at justere indfaldsvinklen af laseren. Dette bruges til at optimere fluorescensemission fra Aip1-GFP foci og minimere baggrundsfluorescens fraceller og dias.
- Når det ønskede billede vises, skal du trykke på Start. Efter 20 sek, skal du trykke på Stop. Gemme billederne. Under fanen Filer på hovedmenuen bar, skal du vælge Gem dias som og indtaste filens placering og navn.
- Brug ImageJ software til at analysere billederne. Brug makro plugin "Manuel Tracker" at spore bevægelse og hastigheden af den fluorescerende Aip1p brændpunkter. Skift tidsintervallet parameter til 0,2 sek.
- Brug valg add spor, skal du vælge og spore en individuel fluorescerende protein gennem 07:56 bindevæv rammer. Brug kommandoen ende sporet og hastigheden af protein bevægelse mellem hver frame vises i et resultat vindue.
- Bestem den gennemsnitlige kurs mellem hver frame bruger en Microsoft Excel-regneark. Bruge værdierne til at beregne den gennemsnitlige hastighed Aip1p bevægelse for hver celle stamme af interesse. BEMÆRK: En scatter plot af hastigheden af Aip1p bevægelse og den gennemsnitlige ikke-lineære hastighed er vist i Figure 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En fremgangsmåde til afbildning af dynamikken i cytoskeletale proteiner i cellen er præsenteret. Actin-bindende protein, Aip1p blev markeret med GFP. Konstruktionen af plasmid, der koder den mærkede produkt er vist i fig. 1. Plasmidet blev derefter transformeret ind i gærceller. Ekspression af fluorescerende mærkede Aip1p tilladt visualisering af proteinet adfærd i cellen. Aip1p typisk lokaliseres aktin pletter på steder af endocytose 22. For at kvantificere Aip1p bevægelse, blev mere end 50 fluorescerende Aip1p foci spores i mere end 10 celler, som vist i figur 2A. Den gennemsnitlige hastighed blev beregnet for hver fluorescerende Aip1p området (se figur 2B). I vild type celler, Aip1p bevægelser rækker over en celle, og senere forsvinder. Den gennemsnitlige hastighed for bevægelsen af Aip1p i vild type celler er 1,60 ± 0,42 mM / sek. Celler, der udtrykker R256H mutant actin, der er kendt for at have abnorm morfologi actin cytoskeleton 23, har en ændret Aip1p fænotype. I mutantstamme Aip1p bevægelse er begrænset og langsommere. Den gennemsnitlige hastighed på Aip1p bevægelse er 0,88 ± 0,30 mM / sek (p <0,005). Den Aip1p migration er begrænset til det umiddelbare område, med foci kredser omkring hinanden i stedet for at krydse cellen. Desuden Aip1p er synlig længere tyder langsommere omsætning Aip1 protein.
Fig. 1. Diagram over plasmidkonstruktion. A) Aip1 fragment amplificeret via PCR er vist at blive fordøjet med restriktionsenzymer (gule bolte). B) Plasmidet PB1996 er fordøjet med restriktionsenzymer for at fjerne Abp140 genet. C) Det fordøjede Aip1 og PB1996 fragmenter ligeret to danne plasmid PB1996 Aip1. D) Den PB1996 Aip1 plasmid er lineariseret og transformeres til gærceller, hvor DNA'et er integreret i kromosomet.
Figur 2. Diagram mutant gær actin stamme konstruktion. Plasmidet koder for mutant actin isoform transformeres derefter ind i en cellelinje og udvælges baseret på evnen til at vokse på medier, der mangler tryptophan. De grønne linjer angiver kromosomalt DNA. Den sorte cirkel er et plasmid. Den brune cirkel repræsenterer en gærcelle. Kasserne viser hver et specifikt gen: gul er actin, orange er leucin, brun er uracil, og pink er tryptophan. X over feltet angiver genet er blevet slettet fra det kromosomale DNA. I trin 2.3 og 2.4, den sorte stjerne på actingenet indicates den R256H mutation.
Figur 3.. Vises Aip1p-GFP bevægelse i levende gærceller. A) billeder af vildtype og R256H celler, der udtrykker GFP-mærkede Aip1p. Celler er i begyndelsen af den logaritmiske vækstfase og billeder blev erhvervet hver 0,2 sek 15 sek. Pilene angiver placeringen af en individuel fluorescerende fokus over tid, blå for vildtype og rød for mutant actin stammer. Det sidste billede viser stien til den Aip1 foci som en grøn linje. Målestokken vist er 5 um. B) Satsen Aip1p bevægelse blev målt ved hjælp af ImageJ. Punktplottet Grafen viser satsen for individuel fluorescerende foci. Den vandrette linje angiver den gennemsnitlige hastighed for vildtype (blå) og mutant (rød) actin stammer.Aip1p bevæger sig 1,60 ± 0,42 mM / sek i vild type celler i forhold til 0,88 ± 0,30 mM / sek celler, der udtrykker R256H mutant actin (p <0,005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En effektiv strategi til at visualisere dynamikken i cytoskelettet og anvendelighed i undersøgelser af patogene mutationer er blevet beskrevet her. Avancerede billeddiagnostiske metoder har skabt nye muligheder for at forstå den intracellulære flytning af proteiner nær cellemembranen. Total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRF) er en følsom teknik til funktionelle studier i levende celler. TIRF bruger en vinklet excitation laser, der skaber et rumligt dæmpede felt på grund af forskellen i brydningsindekser af dækglasset og vandigt medium. Energien af flygtige felt exciterer fluoroforer men aftager eksponentielt med afstanden af grænsefladen mellem dækglasset og vand. Dette resulterer i et højt signal-støj-forhold og effektiv opløsning 50-250 nm over dækglasset / medium interface til. Disse kvaliteter gør TIRF mikroskopi et kraftfuldt værktøj til at visualisere cytoskeletproteiner på enkelt molekyle niveau i levende celler med mindrefototoksicitet og forbedret kontrast i forhold til andre teknikker, 24 - 26.
Cytoskelettet involverer en lang række proteiner, der arbejder i fællesskab for at tilpasse sig til cellulære behov. Effekten af vaskulær-sygdom, der forårsager mutationer i aktin om regulering af cofilin blev for nylig undersøgt af vores gruppe 27. Baseret på vores foreløbige resultater blev Aip1p, en actin-bindende protein, der letter cofilin-afhængige actin overskæring, undersøgt. I indledende undersøgelser, celler, der udtrykker actin mutation R256H vokser dårligt i fravær af Aip1p, især under stress. Dette antyder, at Aip1p regulering af mutant aktincytoskelet ændres. Vores analyser af bevægelse og lokalisering af Aip1p i R256H stammen med fluorescerende tagging og TIRF mikroskopi bekræfter de unormale dynamik. I fremtiden planlægger vi at mærke yderligere proteiner, såsom cofilin, med forskellige fluoroforer at visualisere bevægelsen af flere proteinersamtidig bedre at forstå protein: protein-interaktioner.
Der er visse begrænsninger i at generere en fluorescens-mærkede protein og nogle tilfælde, hvor teknikken ikke er mulig. En fluorescerende mærke kan forstyrre aktiviteten af proteinet eller ændre interaktionen med bindingspartnere. Dette er blevet stødt på i forsøg på at tagge cofilin, en anden actinbindende protein. Angivelse af de mærkede konstruktion har tabt haploidt gær skyldes forstyrret cofilin funktion. Cofilin er et vigtigt protein i gær. Således sletning af cofilin uden samtidig re-introduktion er dødelig; spærring efterfølgende introduktion på et plasmid. En måde at undgå denne begrænsning er at bruge diploid gær. Et eksemplar af cofilin genet blev slået ud, en kodet version blev eksogent introduceret på et plasmid, og derefter selektion for døtreceller der mangler genomisk cofilin men indeholder plasmidet 22 Evnen til fluorescens mærke proteinet varopnået ved at tilføje tag til interne rester i proteinet, der tidligere blev vist sig at have ringe indflydelse på dets protein-protein interaktioner. N-eller C-terminalen er at foretrække steder at tilføje tag, medmindre der er kendt for regionerne for at påvirke relevante protein: protein interaktioner. Hvis dette ikke giver et funktionelt protein, kan den alternative terminalen eller interne rester forsøges.
Der er et par kritiske skridt i gennemførelsen af de teknikker, der er beskrevet. Den ene er fastsættelsen af en passende placering for at mærke det protein, der sparer funktion. Robuste kontroller skal medtages for at validere, at proteinernes funktion bevares. For det andet skal den være overvåget for at sikre cellerne ikke udtørre under billedbehandling. Voks kan anvendes omkring kanterne af dækglasset for at forhindre dehydrering, hvis nødvendigt. Disse skridt til at sikre succes er ligetil at gøre denne tilgang medgørligt og fordelagtigt at billede strukturer nær plasmamembranen. Evnen til at quantify protein lokalisering og bevægelse i levende celler kan øge forståelsen af cellulære funktioner. Da mutationer påvirker cytoskeletproteiner er identificeret, udtryk for fluorescens mærkede proteiner og TIRF mikroskopi kan være nyttigt at undersøge patofysiologi underliggende sygdom hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Peter Rubenstein for nyttige diskussioner og teknisk rådgivning og David Pellman for det oprindelige PB1996 klon. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra March of Dimes og finansiering fra Ride for børnene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis Kit | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, single stranded from salmon testes | Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| Ethidium bromide | Invitrogen | 15585-011 | Warning! Harmful irritation |
| Fungal/Bacterial DNA Kit | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| Lithium acetate | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Any kit will work |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Sodium azide | Sigma | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris Base Ultrapure | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD media | LabExpress | 3011 | |
| -URA Media | LabExpress | 3010 | |
| PCR Machine | Invitrogen | 4359659 | Any PCR machine will work |
| TIRF Microscope | Olympus IX81 | ||
| Hamamatsu ORCA-R camera | Hamamatsu |
References
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al. Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects. Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).
- Zhu, M., et al. Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26). Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).
- Nowak, K. J., et al. Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy. Nat Genet. 23, 208-212 (1999).
- Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure. Science. 280, 750-752 (1998).
- Riviere, J. B., et al. De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome. Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).
- Guo, D. C., et al. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).
- Sparrow, J. C., et al. Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1). Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).
- Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation. J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).
- Amberg, D. C. Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle. Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).
- Pelham, R. J., Chang, F. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe. Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).
- Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast. Science. 319, 97-100 (2008).
- Bertin, A., et al. Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).
- Senning, E. N., Marcus, A. H. Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).
- Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).
- Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM. Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J Vis Exp. (44), (2010).
- Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy. J Vis Exp. (63), e3982 (2012).
- Manneville, J. B. Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells. Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).
- Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus. J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).
- Feng, L., et al. Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments. J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).
- Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo. J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).
- Malloy, L. E., et al. Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization. J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane. Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).
- Bhattacharya, R., et al. Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength. J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).
- Hetheridge, C., et al. The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis. J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).
- Bergeron, S. E., et al. Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function. J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).
