Summary
本研究では、固体の臨床検体からの原発性卵巣癌細胞の単離および特徴付けのための詳細な方法を記載している。卵巣癌臨床検体は、下流の用途に非常に適した生存可能な、線維芽細胞を含まない上皮性卵巣癌（EOC）細胞を得るために酵素消化に供される。
Abstract
卵巣癌の発生および進行を調査するための信頼性の高いツールが緊急に必要とされている。卵巣癌細胞株の使用は、卵巣癌を理解するための貴重なツールのままで、それらの使用は多くの制限がある。これらは、異質性の欠如および拡張のin vitro継代に関連した遺伝子変異の過多があります。ここでは、手術時に回収した固体臨床検体を形成原発性卵巣癌細胞の迅速な確立を可能にする方法を記載している。この方法は、30分間酵素消化に臨床検体を施すからなる。単離された細胞懸濁液を増殖させ、薬物スクリーニングを含め下流側のアプリケーションのために使用することができる。確立された卵巣癌細胞株上の原発性卵巣癌細胞株の利点は、それらが由来し、異なる部位か否かに由来することができる元の特定の臨床検体の代表的なものであるということで一応RYまたは転移性卵巣癌。
Introduction
その比較的低い発生率にもかかわらず、卵巣癌は婦人科疾患と女性の1,2のがんによる死亡の第五の主要な原因の最も致命的である。これは主に忠実疾患3の開始および進行を再現信頼性の高いツールとモデルの不足が原因です。卵巣癌についての我々の知識今日のほとんどは、腹水から回収4-7不死化卵巣表面上皮細胞（IOSが）、卵巣癌細胞株および原発性卵巣癌細胞の使用により可能であった。残念ながら、それらの使用は、不死化プロセスまたは体外路及び腹水製剤から得られた集団の異質性に関連する遺伝的および表現型変化の数など、いくつかの制限があります。
そのため、卵巣癌の特定可能な、特定の固体標本由来の初代卵巣癌細胞はuniquを表す卵巣癌の進行を研究するための電子ツール。
これらの悪性細胞の取得に必要な主な困難は、生存率およびこれらのEOC細胞の培養における増殖能力の早期不足の損失に伴う間質細胞や線維芽細胞の異常増殖によるものである。固形腫瘍からの単細胞懸濁液を作成するには、いくつかの方法が、現在、しかし、特定の技術が有利な結果8より多くの量が得られ、機械的手段または酵素的解離によって、存在しています。ここでは、実行可能な、線維芽細胞のないEOC細胞の効果的な回復のディスパーゼIIの結果とその酵素消化を示しています。このようにして得られたEOC培養物は、遺伝子操作を非常に受けやすいと薬物スクリーニング試験においても有用であり、これらのEOC培養物は、多くの下流の用途に適していることを示している。
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Protocol
倫理に関する声明
ヒト被験者の委員会（IRB）の承認：卵巣癌の固体試料は、治験審査委員会委員の後にミネソタ大学の組織調達機能（TPF）から得た。
1。試薬のセットアップ
- 10％のFBS、100単位ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEMを補充することにより完全DMEM培地を準備します。 4℃でメディアを格納し、温める37℃、使用前に。
- 複数の凍結を回避するため5〜10 mlを別々のボリュームに分量のディスパーゼIIはnonfrostフリー冷凍庫に-20℃で解凍して保存。
2。組織採取
- 肉眼的病理学者によって癌と識別領域から手術時に卵巣癌（サイズは〜5グラム）の固体の試料を収集します。臨床検体は、制度的なプロトコルに従って脱識別され、登録されている。
- 無菌、サウスカロライナ州での試験片を置きREW蓋、ポリプロピレン、氷冷PBS 30mlで充填された容器を片。氷上での処理のための研究室に外科病理検査室からの検体を輸送し、検体採取（ 図1）から30分以内。
3。組織処理
- （（2mm以下）、さらに可能な限り最小の断片に切断、無菌条件下で作業し、ペトリ皿（X 60ミリメートル60ミリメートル）、新鮮な、氷冷PBSの10ミリリットルを含有し、滅菌したカミソリの刃を使用して上にサンプルを転送図2Aおよび2B）。
- DMEM中のディスパーゼII（2.4 U / ml）を（30分間37℃）温めておいた10mlのを含む15ミリリットルの円錐管に刻んだ組織を移し、30分間、5％CO 2、37℃でインキュベートする。標本の最適な消化を確実にするために、手動で細胞スラリーごとに5分を攪拌する。
- 30分間のインキュベーション、移動（使用した後10ミリリットルの血清学的ピペット）セルストレーナー（70ミクロンメッシュ）上に細胞スラリーは、50ミリリットルコニカルチューブの上に配置し、シリンジプランジャを使用してメッシュに対する穏やかな圧力を適用します。 （メッシュの上に残っている）すべての未解離組織を捨て、50ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内の得られた細胞懸濁液を収集します。 4℃（ 図3）で7分間320×gで遠心します。
- 上清を捨て、10％のFBSを含むDMEMの10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。
- 5％のCO 2、37℃（ 図4）でのシャーレ中の細胞懸濁液をインキュベートする。
- 最初のプレーティングから24時間後に培地を変更します。これは細胞片の除去及び培養物中に存在する赤血球の大半を可能にします。
- メディアをプライマリEOCの文化が下流のアプリケーションのための準備ができているし、その後、次の2週間、3日ごとに変更します。
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Representative Results
卵巣癌の臨床検体を、新鮮な細胞スラリーを構成する（ 図1）手術後に収集し、小片（ 図2Aおよび2B）に切断される。これは酵素処理への検体の最適な露出が可能になります。細胞スラリーを酵素消化に曝し、30分間37℃でインキュベートする。インキュベーション時間の間、スラリーは、（特に、各攪拌後）ますます濁り、これは、組織脱凝集のサインです。インキュベーション時間の最後に、スラリーは、任意の組織解離していない（ 図3）からEOC細胞を分離する細胞ろ過器上に転写される。回収した細胞懸濁液を、5％CO 2、37°C（Fのigure 4）に配置される。この段階で、細胞培養物の形態は、単一細胞懸濁液として、小塊の両方のEOC細胞の存在を明らかにする。この時点での培養もPRESENを明らかに赤血球と、図5に示すように、小さな破片のCE。 EOCがゆっくり（1〜3日の期間にわたって）プラスチックに付着する重要なのが、赤血球や細胞破片が、彼らは最終的かつ漸進的」文化から消え」になることはありません。最初のプレーティングから3日目までに、EOC培養は、接着性、EOC細胞クラスターと図6に示すように徐々に少なく赤血球や破片の増加を示している。一日6-7により、EOC細胞は、スワール状の形状（矢印）を形成し、 図7に示すように、EOC細胞の典型的な敷石状形態をもたらすより大きな多細胞凝集体を形成するためにプラスチックに拡散し始める。 14日までに、EOC細胞は、典型的にコンフルエント（ 図8）になり、現在は下流のテストとアプリケーションのための準備が整いました。
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図1の臨床検体の収集。卵巣癌の固体片は、手術時に採取し、氷冷PBS 30mlで充填し、滅菌したネジ蓋、ポリプロピレン検体容器内に配置される。
図2。臨床検体の処理。新鮮な氷冷した1×PBSを10ミリリットルを含むペトリ皿上に移しA）固体試料。さらに、サイズが2ミリメートル程度の断片に切断B）臨床検体。
図3解離していない組織からEOC細胞の分離。酵素消化に続いて、臨床検体は、細胞ストレーナーに転写され、穏やかな圧力は、シリンジプランジャーを用いて消化し た臨床検体に適用される。これは結合組織とEOC細胞の回収によるEOCの機械的剥離を可能にします。
図4 EOC細胞懸濁液を得られるのメッキは解離していない任意の組織を除去した後、細胞懸濁液を遠心分離し、DMEMの続き10mlに再懸濁aining 10％FBSおよび5％CO 2、37℃でペトリ皿中でインキュベートし
図5直ちに処理後のEOC細胞培養物のモルフォロジー。細胞懸濁液めっき（共に矢印で示される）単一細胞懸濁液として塊にEOCを示した直後に、赤血球および細胞破片は、まだこの段階ではたくさんある。オリジナルの倍率、20倍。
3日目EOC細胞培養物の図6形態メッキ半付着EOC cを示した後3日目。EOC細胞培養物をプレーティングした後（矢印で示される）のエル·クラスターの少ない赤血球汚染。オリジナルの倍率、20倍。
図7。初期めっき後一週間。EOC細胞培養をメッキから一週間後に確立EOC培養は組織培養プラスチック上で広がった細胞の渦巻き状のクラスターを示しています。オリジナルの倍率、20倍。
図8。コンフルエントEOC培養。培養14日後に、典型的な上皮丸石の形態を示すEOC細胞のコンフルエントな単層。
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Discussion
卵巣がんの病因と開発のより良い理解は、この壊滅的な疾患に罹患した女性の結果を改善することが重要です。この文脈での使用が確立され、「市販の「卵巣癌細胞株は、間違いなく飛躍的に有用であった。しかし、今日、我々は癌細胞株は、彼らが異質9,10の欠如など、多くの面で由来するヒト腫瘍を代表するものではないことを知っている。
ここでは、直接手術標本の分離の30分以内に卵巣癌の臨床検体からの分離と原発性卵巣癌細胞を培養するための迅速かつ信頼性の高い方法を報告している。
初代細胞は、腹水対固体試料から単離されるので、これは前の腹水形成が起こる時間に疾患の初期段階からの細胞を単離するという利点を有する。この技術はまた、副を有する特定のサイトからの原発性卵巣癌細胞を単離するアンテージ。このプロトコルを使用して実行可能な原発性卵巣癌細胞を得ることに成功した試料は、手術後に処理することができるいかに迅速に大きく依存する。最良の結果を得るには、標本は手術から30分以内に受信する必要があります。これが不可能な場合、試料は、一晩（PBS）で4℃で保存し、翌日に処理されるべきである。我々の経験では、一晩保存後のサンプルの処理は、歩留まりを低下させる。 30分よりも長い間ディスパーゼIIへの曝露は、細胞の生存率を低下させ、実行しないでください。 II治療をディスパーゼの代替は、コラゲナーゼやヒアルロニダーゼによる治療することができます。しかしながら、これは収率低下8もたらす。なぜなら臨床検体における大きな変動のため、あるものは他のものと比較してより大きな赤血球汚染を有することができる。その場合は、我々は、「洗浄」みじん切り組織（工程を示唆している3.1）PBSで前に酵素消化にさらす。これは、製剤中の赤血球の数を減少し、最終的に一次上皮細胞の接着を促進する。
臨床検体は、（彼らはすぐに彼らは外科病理検査室に到着するように無菌性を失う）無菌ではないので、厳密に無菌条件下でのすべての手順を実行することが重要です。培養物の汚染が可能であるが、典型的には、症例の10％未満で起こる。上記のプロトコルは、臨床検体のいずれか一貫して使用することができる。
このプロトコルの主な制限は、各サンプルから回収された細胞の数が設けられて標本の大きさに大きく依存することである。典型的な試験片の大きさは約3センチ×3cmである。別の制限は、原発性卵巣癌細胞がin vitroで 10継代まで（従ってproviために指数関数的に増加しつつあるという事実によって表される。丁実行可能なストックを作る機会を）彼らは最終的には老化と死ぬ、このように単一のドナーからの細胞の利用可能性を制限する。我々は、線維芽細胞からの腫瘍細胞のいずれかの分離を行っておりませんが、我々はプロセス全体を通じて、血清の比較的高い（10％）濃度は卵巣癌細胞を線維芽細胞上の延命効果を与えることができると仮定した。また、間質コンパートメント（線維芽細胞）からの分離の可能性も低くなります細胞は脱凝集せず、分離中、フィルター上に残っている可能性が高い。
このプロトコルで得られた細胞は、卵巣癌の発生と発展につながるプロセスを理解することを目的とした調査を含めた将来のアプリケーションに非常に適している。将来のアプリケーションはまた、 インビトロのためのこれらの一次細胞を用いおよび卵巣癌などの早期発見のためのバイオマーカーのための新規の化学療法剤の生体内試験に含める。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、患者の組織サンプルの収集の支援については、ミネソタ大学の組織調達施設のスタッフに感謝したいと思います。この作品は、MBにし、MBに婦人科腫瘍学部門の資金によってミネソタ卵巣がんのアライアンスにより、MBにランディシェーバー癌研究およびコミュニティ基金によるMBに国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424、サポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
