Summary
Este estudo descreve um método detalhado para o isolamento e caracterização de células de cancro do ovário a partir de espécimes clínicos primários sólidos. Espécimes clínicos de câncer de ovário são submetidos a digestão enzimática para obter, câncer viável sem fibroblastos epitelial de ovário células (EdC) altamente adequados para aplicações a jusante.
Abstract
Ferramentas confiáveis para investigar a iniciação do câncer de ovário e progressão são urgentemente necessários. Embora a utilização de linhas celulares de cancro do ovário permanece uma ferramenta valiosa para a compreensão do cancro do ovário, o seu uso tem muitas limitações. Estas incluem a falta de heterogeneidade e a pletora de alterações genéticas associadas com passagens em extensas in vitro. Aqui nós descrevemos um método que permite a criação rápida de células de câncer de ovário primários formar espécimes clínicos sólidos coletados no momento da cirurgia. O método consiste em submeter as amostras clínicas para a digestão enzimática durante 30 minutos. A suspensão de células isoladas é deixada crescer e podem ser usadas para aplicação a jusante, incluindo o rastreio de drogas. A vantagem de linhas celulares de cancro do ovário primários mais linhas de células de câncer de ovário estabelecidos é que eles são representativos dos espécimes clínicos específicos originais são derivadas e podem ser derivadas a partir de diferentes locais quer primacâncer de ovário ry ou metastático.
Introduction
Apesar da sua relativa baixa incidência, o câncer de ovário é o mais mortal das doenças ginecológicas ea quinta causa de morte por câncer entre as mulheres 1,2. Isto é principalmente devido à falta de ferramentas confiáveis e modelos que recapitulam fielmente a iniciação ea progressão da doença 3. A maioria do nosso conhecimento hoje sobre o câncer de ovário foi possível através do uso de células imortalizadas ovarianos epiteliais da superfície (IOSEs), linhas de células de câncer de ovário e células de câncer de ovário primários recuperados de líquido ascítico 4-7. Infelizmente, a sua utilização tem várias limitações, incluindo uma série de mudanças genéticas e fenotípicas associadas com o processo de imortalização ou em passagens in vitro e a heterogeneidade da população resultante da preparação de fluido ascítico.
Portanto, as células de câncer de ovário primários derivados de amostras sólidas identificáveis e específicos do câncer de ovário representam uma unique ferramenta para estudar a progressão do câncer de ovário.
As principais dificuldades na obtenção dessas células malignas são devido a um crescimento excessivo de células do estroma ou fibroblastos, juntamente com perda de viabilidade e prematuro falta de capacidade proliferativa na cultura destas células EOC. Vários métodos para criar suspensões de célula única de tumores sólidos existem actualmente, através de meios mecânicos ou de dissociação enzimática, contudo certas técnicas de produzir uma quantidade maior do resultado preferido 8. Aqui, vamos mostrar que a digestão enzimática com dispase II resulta em uma recuperação eficaz de células EOC sem fibroblastos viáveis. As culturas EOC assim obtidos são altamente susceptíveis a manipulação genética e são também úteis em ensaios de rastreio de drogas, o que indica que estas culturas EOC são adequadas para muitas aplicações a jusante.
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Protocol
Declaração de Ética
Amostras sólidas de câncer de ovário foram obtidos a partir da Facilidade Universidade de Minnesota colheita de tecidos (TPF) após o Comitê de Revisão Institucional Board: Conselho Assunto Humano (IRB) de aprovação.
1. Setup Reagente
- Prepare meio DMEM completo, completando DMEM com FBS a 10%, e 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Armazenar o meio a 4 ° C e aquecer a 37 ° C antes de usar.
- Alíquota dispase II em volumes separados de 5-10 ml para evitar congelamento múltipla descongela e armazenar a -20 ° C em um freezer sem nonfrost.
2. Recolha de Tecidos
- Recolher amostras sólidas de cancro do ovário (~ 5 g de tamanho), no momento da cirurgia a partir de zonas macroscopicamente identificados como cancro por um patologista. Espécimes clínicos são de-identificados e registados de acordo com protocolos institucionais.
- Coloque as amostras em um estéril, sctampa rew, polipropileno espécimes recipiente cheio com 30 ml de PBS gelado. Transportar as amostras de laboratório de patologia cirúrgica para o laboratório de pesquisa para o processamento no gelo, e dentro de 30 minutos a partir de coleta de amostras (Figura 1).
3. Processamento de Tecidos
- Trabalhando sob condições estéreis, a transferência das amostras para uma placa de Petri (60 mm x 60 mm) contendo 10 ml de fresco, PBS gelado e utilizando uma lâmina de barbear esterilizada, ainda cortado em peças mais pequenas possíveis (2 mm ou menos) ( As figuras 2A e 2 B).
- Transferir os tecidos picados num tubo cónico de 15 ml contendo 10 ml de pré-aquecido (37 ° C durante 30 min), dispase II (2,4 U / ml) em DMEM e incubar em 5% de CO 2 e 37 ° C durante 30 min. Para assegurar uma digestão óptima dos espécimes, agitar manualmente a suspensão celular a cada 5 min.
- Após 30 min de incubação, a transferência (usando10 ml de uma pipeta serológica) a suspensão de células em um filtro celular (malha de 70 um) colocados na parte superior de um tubo de 50 ml e aplica uma pressão suave contra a malha utilizando um êmbolo de seringa. Descartar qualquer tecido não dissociado (restante no topo da malha) e recolher a suspensão celular obtida no tubo de 50 ml estéril. Centrifugar a 320 xg durante 7 minutos a 4 ° C (Figura 3).
- Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS.
- Incubar a suspensão de células em placas de Petri de 5% de CO 2 e 37 ° C (Figura 4).
- Mude o meio após 24 horas do início do cultivo. Isto permite a remoção de detritos celulares e a maioria dos eritrócitos presentes na cultura.
- Troca da mídia a cada três dias para as duas semanas seguintes, após o que as culturas de EOC primário estão prontos para aplicações a jusante.
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Representative Results
Espécimes clínicos frescas de cancro do ovário são recolhidas após a cirurgia (Figura 1) e cortado em pequenos pedaços (Figuras 2A e 2B), que constituem a suspensão de células. Isto permite uma exposição óptima dos espécimes para o tratamento enzimático. Suspensão de células é exposto a digestão enzimática e foram incubadas a 37 ° C durante 30 min. Durante o tempo de incubação da suspensão torna-se cada vez mais turva (especialmente depois de cada agitação) e este é um sinal de desagregação de tecido. No final do tempo de incubação, a suspensão é transferida para um filtro de células para separar células EOC de qualquer tecido não dissociado (Figura 3). A suspensão de células recuperado é colocado em 5% de CO 2 e 37 ° C (F igura 4). Nesta fase, a morfologia das culturas de células revela a presença de ambas as células EOC como uma suspensão de células individuais e em pequenos tufos. A cultura, neste ponto também revela o presen ce de eritrócitos e de pequenos detritos, como mostrado na Figura 5. Importante enquanto o EOC vai lentamente (durante um período de 1-3 dias) aderir ao plástico, eritrócitos e restos celulares não e eles acabarão por e progressivamente "desaparecer da cultura". Pelo dia 3 de plaqueamento inicial, as culturas EOC indicam crescimento aglomerados de células aderentes EOC e progressivamente menos eritrócitos e detritos, como mostrado na Figura 6. Por dia 6-7, as células EOC formar formas redemoinho-like (seta) e começar a espalhar para o plástico, para formar agregados multicelulares maiores conduzem a morfologia típica de células paralelepípedos EOC como mostrado na Figura 7. No dia 14, as células tornam-se normalmente confluentes EOC (Figura 8) e agora está pronto para testes e aplicações a jusante.
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Figura 1. Recolha de amostras clínicas. Amostras sólidas de cancro do ovário são recolhidos no momento da cirurgia e colocados em um, a tampa de rosca, o recipiente de amostra de polipropileno estéril cheio com 30 ml de PBS gelado.
Figura 2. Processamento de espécimes clínicos. A) amostra sólidos transferidos para uma placa de Petri contendo 10 ml de fresco, em gelo PBS 1x. B) espécimes clínicos ainda cortada em pedaços de cerca de 2 mm de tamanho.
Figura 3. Separação de células a partir de tecidos não dissociado EOC. Após digestão enzimática, as amostras clínicas são transferidos para um filtro de células e uma pressão suave seja aplicada sobre os espécimes clínicos digeridos usando um êmbolo de seringa. Isto permitir desapego mecânica EOC de tecidos e recuperação das células EOC conjuntivos.
Figura 4. Chapeamento de células resultante EOC suspensão. Após remoção de todos os tecidos não dissociada, a suspensão de células é centrifugada e ressuspensa em 10 ml de DMEM containing 10% de FBS e incubadas numa placa de Petri com 5% de CO 2 e 37 ° C.
Figura 5. Morfologia de EOC culturas de células imediatamente após a suspensão de processamento. Celular imediatamente após o plaqueamento mostra EOC como uma única suspensão de células e em tufos (ambos indicados por setas), os eritrócitos e os detritos celulares ainda abundam nesta fase. Ampliação original, 20X.
Figura 6. Morfologia de culturas de células EOC no dia 3 após o plaqueamento de cultura celular. EOC no dia 3 após o plaqueamento mostra semi-aderente EOC caglomerado ell (indicado pela seta) e menor contaminação de eritrócitos. Ampliação original, 20X.
Figura 7. Culturas EOC estabelecida após uma semana de chapeamento de cultura de células EOC. Uma semana após o início do cultivo mostra aglomerados redemoinho tipo de células se espalhando sobre a cultura de tecido plástico. Ampliação original, 20X.
Figura 8. Culturas confluentes EOC. Confluent monocamada de células EOC mostrando a morfologia típica calçada epitelial após 14 dias em cultura.
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Discussion
Uma melhor compreensão da etiologia do câncer de ovário e de desenvolvimento é crucial para melhorar o resultado de mulheres afetadas por esta doença devastadora. Neste contexto, a utilização de estabelecida e "comercialmente disponível" linha de células de cancro do ovário, sem dúvida, tem sido extremamente útil. No entanto, hoje sabemos que linhas celulares de cancro não são representativos do tumor humano que originou, em muitos aspectos, incluindo a falta de heterogeneidade 9,10.
Aqui, apresentamos um método rápido e confiável para o isolamento e cultivo de células de câncer de ovário primários diretamente de espécimes clínicos de câncer de ovário em 30 min de isolamento espécime cirúrgico.
Porque as células primárias são isoladas a partir de um sólido espécime contra fluido ascite, este tem a vantagem de isolar as células de estágios iniciais da doença antes do momento em que ocorre a formação de ascite fluido. Esta técnica também tem o advantage de isolamento de células de câncer de ovário primário a partir de um site específico. O sucesso na obtenção de células de câncer de ovário primárias viáveis utilizando este protocolo é em grande parte dependente da rapidez com que a amostra pode ser processado após a cirurgia. Para melhores resultados, as amostras devem ser recebidos dentro de 30 min de cirurgia. Se isso não for possível, o material deve ser mantida a 4 ° C (em PBS) durante a noite e transformadas no dia seguinte. Na nossa experiência, o processamento das amostras após armazenagem durante a noite diminui o rendimento. A exposição a dispase II durante mais de 30 minutos, também reduz a viabilidade das células e não deverá ser executado. Uma alternativa para o tratamento de dispase II pode ser tratamento com colagenase ou hialuronidase. No entanto, isso resulta em diminuição da produção de 8. Por causa da grande variabilidade em amostras clínicas, alguns podem ter maior contaminação de células vermelhas do sangue, em comparação com outros. Se for esse o caso, sugerimos "lavar" os tecidos picados (passo3.1) com PBS antes expondo-os a digestão enzimática. Isto irá reduzir o número de células vermelhas do sangue na preparação e, finalmente, facilitar a adesão das células epiteliais primárias.
Porque as amostras clínicas não são estéreis (eles perdem a esterilidade assim que eles chegam ao laboratório de patologia cirúrgica), é fundamental para realizar todas as etapas em condições rigorosamente estéreis. Enquanto a contaminação da cultura é possível, tipicamente ocorre em menos de 10% dos casos. O protocolo acima pode ser utilizado com qualquer consistência da amostra clínica.
A principal limitação deste protocolo é que o número de células recuperadas a partir de cada amostra é altamente dependente do tamanho das amostras fornecidas. O tamanho de um espécime típico é cerca de 3 cm x 3 cm. Outra limitação é representada pelo facto de que, enquanto as células de cancro do ovário primárias crescer exponencialmente até 10 passagens in vitro (por conseguinte, providing a oportunidade de fazer ações viáveis) eles finalmente senesce e morrem, limitando assim a disponibilidade de células a partir de um único doador. Apesar de não realizar qualquer separação de células tumorais de fibroblastos, que a hipótese de que a relativamente alta (10%) concentração de soro ao longo do processo pode dar células de câncer de ovário uma vantagem de sobrevivência sobre fibroblastos. É também provável que as células que são menos propensas a separação do compartimento estromal (fibroblastos) não pode desagregar e permanecerá no filtro durante a separação.
As células obtidas com este protocolo são altamente adequados para aplicações futuras, incluindo investigações destinadas a compreender os processos que levam à iniciação do câncer de ovário e de desenvolvimento. As aplicações futuras também incluem o uso destas células primárias para in vitro e testes in vivo de novos agentes quimioterapêuticos para o cancro do ovário, bem como biomarcadores para a detecção precoce.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao pessoal da Facilidade de recolha de tecidos, da Universidade de Minnesota para obter ajuda com a coleta de amostras de tecido do paciente. Este trabalho foi apoiado pelo Programa do Departamento de Defesa do ovário Cancer Research (OCRP) OC093424 a MB, pelo Randy Shaver Cancer Research Fund e da Comunidade para MB, pelo Minnesota cancro do ovário Aliança para MB e pelo fundo de Oncologia Ginecológica Departamental de MB. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
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