Summary
Bu çalışma, bir katı klinik örneklerden birincil yumurtalık kanser hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir yöntemi tarif etmektedir. Yumurtalık kanseri klinik örnekler alt uygulamalar için son derece uygun olan uygun bir, fibroblast içermeyen epitelyal yumurtalık kanseri (EOC) hücreleri elde etmek için enzimatik sindirme tabi tutulur.
Abstract
Yumurtalık kanseri başlamasını ve ilerlemesini soruşturma için güvenilir araçlar acilen ihtiyaç vardır. Yumurtalık kanseri hücresi hatlarının kullanımı yumurtalık kanseri anlamak için değerli bir araç devam ederken, bunların kullanımı, birçok sınırlamalar vardır. Bu heterojenlik eksikliği ve genişletilmiş in vitro pasaj ile ilişkili genetik değişikliklerin bolluk vardır. Burada birincil yumurtalık kanseri hücrelerinin hızlı kurulması için bir yöntem sağlar: bir ameliyat sırasında toplanan katı klinik örnekler meydana açıklar. Yöntem, 30 dakika boyunca enzimatik sindirme klinik örnekleri tabi oluşur. İzole edilmiş hücre süspansiyonu büyümeye bırakılır ve ilaç taraması gibi alt uygulama için kullanılabilir. Kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları üzerinden birincil yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin avantajı, türetildikleri ve farklı sitelerde olup türetilebilir orijinal spesifik klinik numuneler için temsili olmasıdır primary veya metastatik over kanseri.
Introduction
Nispeten düşük insidansı rağmen, yumurtalık kanseri jinekolojik hastalıklar ve kadınlarda 1,2 arasında kanser ölümlerinin beşinci önde gelen nedeni arasında en ölümcül olanıdır. Bu sadakatle hastalığın 3'ün başlangıcı ve ilerlemesini özetlemek güvenilir araçlar ve model eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Yumurtalık kanseri hakkındaki bilgi, bugün çoğu asitik sıvı 4-7 geri ölümsüzleştirilmiş over yüzey epitel hücreleri (kaybetmez), yumurtalık kanseri hücre hatları ve primer yumurtalık kanser hücrelerinin kullanımı ile mümkün olmuştur. Ne yazık ki, bunların kullanımı ölümsüzleşme işlemi ile ya da in vitro pasajlar ilişkili genetik ve fenotipik bir dizi değişiklik ve asitik sıvı preparattan elde nüfusun heterojenliği dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalara sahiptir.
Bu nedenle, yumurtalık kanseri tanımlanabilir ve belirli katı örneklerden türetilmiş primer yumurtalık kanseri hücrelerinin uniqu temsilyumurtalık kanserinin ilerlemesini eğitim için e araçtır.
Bu habis hücrelerin elde edilmesi ile ilgili başlıca zorluklar canlılık kaybına ve EOC, bu hücrelerin kültürü içinde çoğalma kapasitesinin vaktinden önce eksikliği ile birlikte stromal hücreleri ya da fibroblastlarının bir büyüme kaynaklanmaktadır. Katı tümörlerden tek hücre süspansiyonları oluşturmak için çeşitli yöntemler halen mekanik yollarla ya da enzimatik ayrışma yoluyla, ancak bazı teknikler tercih edilen sonucun 8 daha büyük bir miktarda, verim vardır. Burada, gösteriyor ki uygun, fibroblast içermeyen EOC hücrelerinin etkili bir kurtarma dispase II sonuçları ile enzimatik sindirim. Bu şekilde elde edilen kültürler EOC genetik manipülasyonu için son derece hassastır ve aynı zamanda, ilaç tarama deneylerinde yararlıdır, bu EOC kültürler çok alt uygulamalar için uygun olduğuna işaret etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Bildirimi
Yumurtalık kanseri Katı numuneler Kurumsal Değerlendirme Kurulu Komite sonra Minnesota Üniversitesi Doku Alımı Tesisi (TPF) elde edilmiştir: İnsan Konu Kurulu (KİK) onayı.
1.. Reaktif Kur
- % 10 FBS ve 100 birim penisilin-streptomisin ile takviye DMEM ile tam bir DMEM ortamıyla hazırlayın. 4 ° C 'de sıcak bir orta depolamak ve 37 ° C, kullanımdan önce.
- Birden fazla donma önlemek için 5-10 ml ayrı cilt içine kısım dispase II nonfrost ücretsiz dondurucuda -20 ° C'de çözülür ve mağaza.
2. Doku Toplama
- Makroskopik olarak bir patolog tarafından kanser gibi tanımlanan alanlarda cerrahi sırasında yumurtalık kanseri (boyut olarak ~ 5 g) katı madde örnekleri toplamak. Klinik örnekler-de tespit ve kurumsal protokollere göre kayıtlıdır.
- Steril, sc örnekleri yerleştirinrew kapak, polipropilen, buzla soğutulmuş PBS nin 30 ml 'si ile doldurulmuş bir kap ve numune. Ve numune toplama 30 dakika (Şekil 1) içinde, buz üzerinde işlem için araştırma laboratuvarında için cerrahi patoloji laboratuvar numunelerini taşımak.
3. Doku İşleme
- Steril koşullar altında çalışarak, bir Petri kabı üzerine numune (60 mm x 60 mm), taze, buz soğukluğunda 10 ml PBS ihtiva eden ve bundan başka (2 mm veya daha az) mümkün olan en küçük parçalar halinde kesilmiş, bir steril bir jilet kullanılarak (aktarmak Şekiller 2A ve 2B).
- DMEM dispase II (2.4 U / ml) (30 dakika boyunca 37 ° C) önceden ısıtılmış 10 ml içeren, 15 ml konik tüp içine kıyılmış dokuları aktarın ve 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Örneklerin optimal sindirim sağlamak için, el ile hücre karışımının her bir 5 dakika çalkalayın.
- 30 dakika inkübasyon, transferi (kullandıktan sonra10 ml serolojik pipet) bir hücre süzgecinden (70 um mesh) üzerine hücre bulamacı, 50 ml konik tüp üstüne yerleştirilir ve bir şırınga pistonunun kullanılarak örgü karşı hafif bir basınç uygulamak. (Mesh üstünde kalan) herhangi bir çözülmemiş doku atın ve 50 ml konik bir tüp içinde, steril, elde edilen hücre süspansiyonu toplar. 4 ° C 'de, 7 dakika (Şekil 3) için 320 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatant atılır ve% 10 FBS içeren DMEM, 10 ml hücre pelletini.
- Hücre% 5 CO2 ile bir Petri tabağına ve süspansiyon 37 ° C de (Şekil 4) inkübe edin.
- Ilk kaplama 24 saat sonra, ortam, değiştirin. Bu, hücre kalıntılarının uzaklaştırılmasından ve kültür içinde mevcut olan eritrositlerin çoğunluğu için izin verir.
- ORTA birincil EOC'nin kültürleri aşağı uygulamalar için hazır sonra aşağıdaki iki hafta boyunca her üç günde bir değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yumurtalık kanseri Taze klinik örnekleri (Şekil 1), ameliyat sonrası toplandı ve hücre karışımın küçük parçalar oluşturan (Şekil 2A ve 2B) kesilir. Bu, enzimatik tedaviye numunelerin uygun poz sağlar. Hücre bulamacı enzimatik sindirme maruz bırakılmış ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Inkübasyon süresi boyunca bulamaç (özellikle her ajitasyon sonra) giderek daha bulanık hale gelir ve bu doku ayrıştırma bir işaretidir. İnkübasyon süresi sonunda, harç madde bir çözülmemiş doku (Şekil 3) için EOC hücreleri ayırmak için bir hücre süzgecinden üzerine aktarılır. Elde edilen hücre süspansiyonu,% 5 CO2 ve 37 ° C (F ŞEKIL 4) yerleştirilir. Bu aşamada hücre kültürlerinin morfolojisi tek bir hücre süspansiyonu olarak ve küçük topaklar hem de EOC hücrelerin varlığını ortaya koymaktadır. Bu noktada kültürü de ortaya presen eritrositler ve Şekil 5'te gösterildiği gibi, küçük enkaz ce. EOC yavaş yavaş (1-3 gün süre içinde) plastik, eritrositler ve hücre enkaz yapışır önemlisi ise olmayacak ve sonunda ve giderek "kültürü yok" olacaktır. , Başlangıç ekiminden 3 gün olarak, EOC yapışkan kültürler EOC hücre kümeleri ve Şekil 6'da gösterildiği gibi, daha az giderek artan bir eritrosit ve çöpleri göstermektedir. Gün 6-7 olarak, EOC hücreler girdap benzeri şekiller (ok) formu ve Şekil 7'de gösterildiği gibi, EOC hücrelerin tipik arnavut kaldırımı morfolojiye yol açmıştır daha büyük bütünler oluşturmak için bir çok hücreli plastik yayılmaya başlar. 14. günde, EOC hücreler tipik Konfluent (Şekil 8) haline geldi ve artık alt test ve uygulamalar için hazır.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Klinik numunelerin Şekil 1.. Collection. Yumurtalık kanseri Katı numuneler cerrahi zamanında toplandı ve buz soğukluğunda, 30 ml PBS ile dolu bir steril, vidalı kapak, polipropilen örnekler kaba yerleştirilir.
Klinik örneklerin Şekil 2.. İşleme. A), taze, buz gibi soğuk 1 x PBS. Yatak 10 ml ihtiva eden bir Petri çanağı üzerine transfer katı numune) klinik numuneler bundan başka boyutu yaklaşık 2 mm parçalar halinde kesilir.
Çözüşmemiş dokulardan EOC hücre Şekil 3.. Ayrılması. Enzimatik sindirme sonrasında, klinik numuneler bir hücre süzgecinden üzerine aktarılır ve yumuşak bir basınç bir şırınga pistonunun kullanılarak sindirilmiş klinik numuneler üzerinde tatbik edilir. Bu bağ dokuları ve EOC hücrelerin kurtarma EOC'nin mekanik ayrılması için izin verir.
Şekil 4,. EOC hücreleri süspansiyonun kaplama. Herhangi bir çözülmemiş dokuları ayrılmasından sonra, hücre süspansiyonu santrifüj edilir ve DMEM cont 10 ml içinde tekrar süspanseAining,% 10 FBS ve% 5 CO2 ve 37 ° C de bir Petri kabı içinde inkübe
Hemen hemen sonra kaplama işlem. Hücre süspansiyon sonra EOC hücre kültürlerinin Şekil 5,. Morfoloji bir tek hücre süspansiyonları olarak EOC gösterir ve topaklar (her ikisi de oklarla gösterilen) içinde, eritrositler ve hücre döküntüsü yine bu aşamada boldur. Orijinal büyütme, 20X.
3. günde EOC hücre kültürlerinin Şekil 6,. Morfoloji ile kaplanmış yarı-yapışkan EOC c göstermektedir 3 gün sonra değiştirilmiştir. EOC hücre kültürü kaplama sonrası(okla gösterilen) ell küme ve daha az eritrosit kirlenme. Orijinal büyütme, 20X.
Şekil 7. Sonra ilk kaplama bir hafta. EOC hücre kültürü kaplama bir hafta sonra kurulan EOC kültürler doku kültürü plastik yayılan hücrelerin girdap gibi kümeler gösterir. Orijinal büyütme, 20X.
Şekil 8,. Konfluent EOC kültürleri. Kültür içinde 14 gün sonra normal epitel arnavut kaldırımı morfoloji gösteren EOC hücrelerinin konfluent tek tabaka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yumurtalık kanseri etiyolojisi ve gelişme daha iyi anlaşılması, bu yıkıcı hastalıktan etkilenen kadınların sonucunu iyileştirmek için çok önemlidir. Bu bağlamda, kullanılmasıdır kurulmuş ve "ticari olarak temin edilebilen" yumurtalık kanseri hücre çizgisi şüphesiz son derece yararlı olmuştur. Ancak, bugün biz kanseri hücre hatları onlar heterojenitenin 9,10 eksikliği gibi birçok açıdan kökenli insan tümör temsilcisi olmadığını biliyorum.
Burada, doğrudan cerrahi numune izolasyon 30 dakika içinde yumurtalık kanserinin klinik örneklerden izolasyon ve primer yumurtalık kanseri hücrelerinin kültür için hızlı ve güvenilir bir yöntem rapor.
Birincil hücreler, assit sıvısı karşı sağlam bir örnekten izole edilir, çünkü bu asit önce sıvı oluşumu meydana zaman hastalığın erken aşamalarında hücrelerin izole edilmesi avantajına sahiptir. Bu teknik aynı zamanda zarf varbelirli bir sitenin birincil yumurtalık kanseri hücrelerini izole antage. Bu protokolü kullanarak canlı primer over kanseri hücreleri elde başarısı örnek ameliyatı takiben işlenebilir nasıl çabuk büyük ölçüde bağlıdır. En iyi sonuçlar için, numuneler cerrahi, 30 dakika içinde kabul edilmelidir. Eğer bu mümkün değilse, numune bir gece boyunca (PBS içerisinde) 4 ° C'de tutulmuş ve ertesi gün işlenmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, gece boyunca depolama Aşağıdaki örneklerde işleme verimini düşürür. Daha uzun süre 30 dakika boyunca dispase II maruz kalmak da hücre canlılığını azaltır ve gerçekleştirilmemelidir. II dispaz tedavisi için alternatif bir kolajenaz veya hyaluronidase bir tedavi olabilir. Bununla birlikte, bu azalma verimle 8 ile sonuçlanır. Diğerlerine göre çünkü klinik örneklerde büyük değişkenlik, bazı büyük kırmızı kan hücresi kontaminasyonu olabilir. Bu durumda, biz "yıkama" kıyılmış dokular (adım önermek3.1) PBS ile önceden enzimatik sindirim onları teşhir. Bu hazırlanmasında kırmızı kan hücrelerinin sayısını azaltmak ve sonuçta birinci epitel hücrelerinin yapışmasını kolaylaştırır.
Klinik örnekler (onlar en kısa sürede cerrahi patoloji laboratuvarında varmak gibi sterilite kaybetmek) steril değildir, çünkü kesinlikle steril şartlarda tüm adımları gerçekleştirmek için önemlidir. Kültürün kirlenmesi mümkün olsa da, tipik olarak vakaların% 10'dan daha az görülür. Yukarıdaki protokol klinik numunesinin tutarlı bir biçimde kullanılabilir.
Bu protokolün başlıca sınırlaması her numune elde edilen hücrelerin sayısı, verilen örneklerin boyutuna fazlasıyla bağlıdır olmasıdır. Tipik Numune büyüklüğü, yaklaşık 3 cm x 3 cm 'dir. Diğer bir sınırlama gerçeği ile temsil edilen birincil yumurtalık kanser hücrelerinin in vitro kadar 10 geçişleri (ve bu nedenle yazarlara katlanarak büyürkending canlı stok yapmak için fırsat) onlar sonuçta senesce ve ölürler, böylece tek bir donörden hücre kullanılabilirliğini kısıtlamaktadır. Biz fibroblastlardan tümör hücrelerinin herhangi bir ayrılma yapmazlar birlikte, süreç boyunca serum içinde nispeten yüksek (% 10) konsantrasyonu, yumurtalık kanseri hücreleri, fibroblastlar üzerinde bir avantaj vermeyen olabileceğini hipotez. Ayrıca, stromal bölmesinde (fibroblastlar) ayrılması için daha az eğilimli hücreleri parçalamak olmayabilir ve ayırma sırasında filtre üzerinde kalır olasıdır.
Bu protokol ile elde edilen hücreler yumurtalık kanseri başlangıcı ve gelişimine yol açan süreçleri anlamak yönelik soruşturma dahil, gelecekteki uygulamalar için son derece uygundur. Gelecekteki uygulamalar da in vitro için bu birincil hücreler kullanılarak ve yumurtalık kanseri gibi erken tespiti için biyolojik için yeni kemoterapi maddelerinin in vivo testler içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz hasta doku örnekleri koleksiyonu ile yardım için Minnesota Üniversitesi Doku Alımı Tesisi çalışanlarına teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma MB Minnesota Yumurtalık Kanseri Birliği tarafından ve MB Jinekolojik Onkoloji Bölüm fonunun, Randy Tıraş Kanser Araştırma ve MB Toplum Fonu tarafından, Savunma Bakanlığı Yumurtalık Kanseri Araştırma Programı (OCRP) MB OC093424 tarafından desteklenmiştir. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlamak için karar ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
