Summary
Denne undersøgelse beskriver en detaljeret metode til isolering og karakterisering af primære kræft i æggestokkene celler fra faste kliniske prøver. Ovariecancer kliniske prøver er udsat for enzymatisk fordøjelse at opnå levedygtig, fibroblast-fri epitelial kræft i æggestokkene (EOC) celler yderst velegnet til downstream-anvendelser.
Abstract
Pålidelige værktøjer til at undersøge ovariecancer initiering og progression er et presserende behov. Mens brugen af ovariecancer cellelinier stadig et værdifuldt redskab til at forstå ovariecancer, deres anvendelse har mange begrænsninger. Disse omfatter den manglende heterogenitet og overfloden af genetiske ændringer er forbundet med udvidet in vitro passage. Her beskriver vi en metode, der giver mulighed for en hurtig etablering af primære kræft i æggestokkene celler danne faste kliniske prøver indsamlet på tidspunktet for operationen. Metoden består i at underkaste kliniske prøver til enzymatisk nedbrydning i 30 minutter. Det isolerede cellesuspension lov til at vokse og kan anvendes til efterfølgende anvendelse, herunder medicin screening. Fordelen ved primær ovariecancer cellelinjer end etablerede æggestokkene kræft cellelinjer er, at de er repræsentative for de oprindelige specifikke kliniske prøver de stammer fra, og kan afledes fra forskellige steder, om primary eller metastatisk ovariecancer.
Introduction
På trods af sin relativt lave incidens, kræft i æggestokkene er den mest dødelige af de gynækologiske sygdomme og den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt kvinder 1,2. Dette er primært på grund af manglen på pålidelige værktøjer og modeller, der trofast rekapitulere initiering og progression af sygdommen 3.. De fleste af vores viden i dag om kræft i æggestokkene har været muligt ved hjælp af udødeliggjort æggestokkene overflade epithelceller (tabere), kræft i æggestokkene cellelinjer og primære kræft i æggestokkene celler udvundet fra ascitesvæske 4-7. Desværre, deres anvendelse har flere begrænsninger, herunder en række af genetiske og fænotypiske ændringer i forbindelse med immortalization proces eller in vitro-passager og heterogenitet i befolkningen som følge af væske forberedelse ascitiske.
Derfor primær ovariecancer celler fra identificerbare og specifikke faste eksemplarer af kræft i æggestokkene repræsenterer en unique værktøj til at studere ovariecancer progression.
De største vanskeligheder i forbindelse med opnåelse af disse maligne celler skyldes en overvækst af stromaceller eller fibroblaster sammen med tab af levedygtighed og for tidlig mangel på proliferativ kapacitet i kulturen i disse EOC celler. I øjeblikket findes flere metoder til at skabe encellede suspensioner fra solide tumorer, ved hjælp af mekaniske midler eller enzymatisk dissociation dog visse teknikker giver en større mængde af det foretrukne resultat 8. Her viser vi, at enzymatisk nedbrydning med dispase II resultater i en effektiv inddrivelse af levedygtige, fibroblast-fri EOC celler. De således opnåede EOC kulturer er meget modtagelige for genetisk manipulation, og er også anvendelige i lægemiddel-screening tests indikerer, at disse EOC kulturer er velegnet til mange efterfølgende anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiske retningslinjer
Solid eksemplarer af kræft i æggestokkene blev opnået fra University of Minnesota vævsudtagning Facility (TPF) efter Institutional Review Board Udvalg: Human Emne Board (IRB) godkendelse.
1.. Reagens Setup
- Forbered komplet DMEM-medium ved at supplere DMEM med 10% FBS, og 100 enheder penicillin-streptomycin. Opbevar ved 4 ° C og opvarmes til 37 ° C før brug.
- Alikvot dispase II i separate mængder af 5-10 ml for at undgå flere fryse tøet op og opbevares ved -20 ° C i en nonfrost-fri fryser.
2. Tissue Collection
- Saml solide eksemplarer af kræft i æggestokkene (~ 5 g i størrelse) på tidspunktet for operationen fra områder makroskopisk identificeret som kræft ved en patolog. Kliniske prøver er de-identificeret og registreret i henhold til de institutionelle protokoller.
- Placer prøver i en steril, screw låg, prøver polypropylen container fyldt med 30 ml iskold PBS. Transportere prøver fra den kirurgiske patologi laboratorium til laboratorium til behandling på is, og inden for 30 min fra prøvetagning (figur 1).
3. Tissue Processing
- Arbejde under sterile forhold, overføre prøver onto en petriskål (60 mm x 60 mm) indeholdende 10 ml frisk, iskold PBS og ved hjælp af en steril barberblad yderligere skåret i de mindst mulige (2 mm eller mindre) stykker ( 2A og 2 B).
- Overfør hakket væv i et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml forvarmet (37 ° C i 30 min) dispase II (2,4 U / ml) i DMEM og inkuberes ved 5% CO2 og 37 ° C i 30 min. For at sikre optimal fordøjelse af prøverne manuelt agitere celleopslæmningen hver 5 min.
- Efter 30 minutters inkubation, overførsel (ved hjælp afen 10 ml serologisk pipette) celleopslæmningen på et cellefilter (70 um mesh) placeret på toppen af en 50 ml konisk rør og anvende et let tryk mod masken ved hjælp af et sprøjtestempel. Kassér udissocieret væv (resterende på toppen af mesh) og indsamle den opnåede celle suspension i 50 ml sterilt konisk rør. Der centrifugeres ved 320 xg i 7 minutter ved 4 ° C (figur 3).
- Bortkast supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml DMEM indeholdende 10% FBS.
- Inkubér cellesuspensionen i en petriskål på 5% CO2 og 37 ° C (figur 4).
- Skift mediet efter 24 timer fra den indledende udpladning. Dette giver mulighed for at fjerne cellerester og størstedelen af erytrocytterne til stede i kulturen.
- Skift medium hver tre dage for de følgende to uger, hvorefter kulturer primær EOC er klar til downstream-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Friske kliniske prøver ovariecancer opsamles efter kirurgi (figur 1) og skæres i små stykker (figur 2A og 2B) udgør celleopslæmningen. Dette giver mulighed for optimal eksponering af prøverne til den enzymatiske behandling. Cell opslæmning udsat for enzymatisk fordøjelse og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. I inkubationstiden bliver gyllen stadig uklar (især efter hver agitation), og dette er et tegn på væv opdeling. Ved slutningen af inkubationstiden opslæmningen overført til et cellefilter til at adskille EOC celler fra dissocieret væv (figur 3). Det udvundne cellesuspension anbringes på 5% CO2 og 37 ° C (F IGUR 4). På dette stadium morfologi cellekulturer afslører tilstedeværelse af både EOC celler som en enkelt cellesuspension og i små klumper. Kulturen på dette tidspunkt viser også præsentation ce af erytrocytter og små rester, som vist i figur 5. Vigtigere mens EOC langsomt vil (over en periode på 1-3 dage) holde sig til plast, erytrocytter og celle debris vil ikke, og de vil med tiden og progressivt "forsvinder fra kulturen". Ved dag 3 fra indledende plating, viser EOC kulturer stigende vedhængende EOC celle klynger og gradvist mindre erythrocyt og snavs, som vist i figur 6.. Ved dag 6-7, EOC celler danner hvirvel-lignende former (pil) og begynde at sprede sig til plast til dannelse af større multicellulære aggregater, der fører til den typiske brosten morfologi EOC celler som vist i figur 7. På dag 14, EOC celler bliver typisk sammenflydende (figur 8), og er nu klar til downstream test og applikationer.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Figur 1.. Indsamling af kliniske prøver. Solid eksemplarer af kræft i æggestokkene er samlet på tidspunktet for kirurgi og anbringes i et sterilt, skrue låget eksemplar polypropylen container fyldt med 30 ml iskold PBS.
Figur 2. Behandling af kliniske prøver. A) Solid model overføres på en petriskål indeholdende 10 ml frisk, iskold 1x PBS. B) kliniske prøver yderligere skåret i stykker omkring 2 mm i størrelse.
Figur 3.. Adskillelse af EOC celler fra udissocieret væv. Efter enzymatisk nedbrydning, er kliniske prøver overføres til en celle si og et let tryk anvendes på de spaltede kliniske prøver ved hjælp af en sprøjte stemplet. Dette giver mulighed for mekanisk afkobling af EOC fra bindevæv og inddrivelse af EOC celler.
Fig. 4. Belægning af resulterende EOC cellesuspension. Efter fjernelse eventuelle dissocierede væv cellesuspensionen centrifugeres og resuspenderes i 10 ml DMEM containing 10% FBS og inkuberet i en petriskål på 5% CO2 og 37 ° C.
Figur 5.. Morfologi EOC cellekulturer straks efter forarbejdningen. Cell suspension umiddelbart efter plating viser EOC som en enkelt celle suspensioner og i klumper (begge angivet med pilene), erytrocytter og celle debris stadig vrimler på dette stadium. Original forstørrelse, 20X.
Figur 6.. Morfologi EOC cellekulturer på dag 3 efter galvanisering. EOC cellekultur på dag 3 efter plating viser semi-klæbende EOC cell klynge (angivet ved pilen) og mindre erythrocyt forurening. Original forstørrelse, 20X.
Figur 7. Etablerede EOC kulturer efter en uge fra plating. EOC cellekultur en uge efter indledende udpladning viser hvirvel-lignende klynger af celler spredes på vævskulturplast. Original forstørrelse, 20X.
Figur 8. Sammenflydende EOC kulturer. Konfluerende monolag af EOC celler, der viser den typiske epitelial brosten morfologi efter 14 dage i kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En bedre forståelse af kræft i æggestokkene ætiologi og udvikling er afgørende for at forbedre resultatet af kvinder ramt af denne ødelæggende sygdom. I denne sammenhæng etableret brugen af og "kommercielt tilgængelige" kræft i æggestokkene cellelinie har uden tvivl været uhyre nyttigt. , Vi i dag kender dog, at kræft cellelinjer er ikke repræsentative for den menneskelige tumor de stammede fra i mange aspekter, herunder den manglende heterogenitet 9,10.
Her rapporterer vi en hurtig og pålidelig metode til isolering og dyrkning af primære kræft i æggestokkene celler direkte fra kliniske prøver på kræft i æggestokkene inden 30 min af kirurgisk eksemplar isolation.
Da de primære celler isoleret fra en solid prøve versus ascitesvæske, har dette den fordel at isolere celler fra den tidlige stadier af sygdommen, før det tidspunkt, hvor ascitesvæske dannelse forekommer. Denne teknik har også ADVAntage isolere primære kræft i æggestokkene celler fra et bestemt websted. Succesen med at opnå levedygtige primære kræft i æggestokkene celler ved hjælp af denne protokol er i høj grad afhængig af, hvor hurtigt prøven kan behandles efter operationen. For de bedste resultater, bør prøverne være modtaget senest 30 min fra kirurgi. Hvis dette ikke er muligt, skal prøven opbevares ved 4 ° C (i PBS) natten over og behandlet den efterfølgende dag. Det er vores erfaring, behandling af prøver efter natten opbevaring nedsætter udbyttet. Udsættelse for dispase II i længere tid end 30 minutter reducerer også cellelevedygtighed og bør ikke udføres. Et alternativ til dispase II behandling kan være behandling med collagenase eller hyaluronidase. Dette resulterer imidlertid i nedsat udbytte 8. På grund af den store variation i kliniske prøver, kan nogle have større røde forurening blodlegemer i forhold til andre. Hvis det er tilfældet, foreslår vi, "vask" hakket væv (trin3.1) med PBS før udsætte dem for enzymatisk fordøjelse. Dette vil reducere antallet af røde blodlegemer i forberedelsen og i sidste ende lette vedhæftning af de primære epitelceller.
Fordi de kliniske prøver er ikke sterile (de mister sterilitet, så snart de ankommer til kirurgisk patologi laboratorium), er det vigtigt at udføre alle trinene under strengt sterile forhold. Mens forurening af kulturen er muligt, typisk det forekommer i mindre end 10% af tilfældene. Ovenstående protokol kan bruges med enhver konsekvens af klinisk prøvemateriale.
Den største begrænsning i denne protokol er, at antallet af celler genvundet fra hver prøver er meget afhængig af størrelsen af de prøver, der er fastsat. En typisk prøvens størrelse er omkring 3 cm x 3 cm. En anden begrænsning er repræsenteret ved den kendsgerning, at mens de primære kræft i æggestokkene celler vokse eksponentielt i op til 10 passager in vitro (derfor bestemding mulighed for at lave levedygtige bestande) de i sidste ende senesce og dø, hvilket begrænser adgangen af celler fra en enkelt donor. Selvom vi ikke udfører nogen separation af tumorceller fra fibroblaster, vi hypotesen, at den relativt høje (10%) koncentration af serum hele processen kan give ovariecancerceller en overlevelse fordel over fibroblaster. Det er også sandsynligt, at celler, der er mindre tilbøjelige til adskillelse fra det stromale rum (fibroblaster), der ikke kan løsrives og vil forblive på filtret under adskillelse.
Celler opnået med denne protokol er særdeles velegnet til fremtidige applikationer, herunder undersøgelser for at forstå de processer, der fører til kræft i æggestokkene initiering og udvikling. Fremtidige anvendelser omfatter også ved hjælp af disse primære celler til in vitro og in vivo afprøvning af nye kemoterapeutiske midler til ovariecancer samt biomarkører for tidlig påvisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke personalet i anlægget af University of Minnesota udtagning af væv for at få hjælp med patient vævsprøver kollektion. Dette arbejde blev støttet af Department of Defense æggestokkene Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB, som Randy Shaver Cancer Research og EU-fond til MB, som Minnesota Kræft i æggestokkene Alliance til MB og ved gynækologisk onkologi afdelings fond til MB. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
