Summary
Den zebrafisk embryot är en utmärkt modell för utvecklingsbiologisk forskning. Under embryogenes, zebrafisk utvecklas med en äggula massa, som presenterar tredimensionella utmaningar för prov observation och analys. Detta protokoll beskriver hur man skapar tvådimensionella platta mount beredningar av hela montera in situ (WISH) färgade zebrafisk embryo exemplar.
Abstract
Den zebrafisk embryot är nu vanligt för grundläggande och biomedicinsk forskning för att undersöka den genetiska kontrollen av utvecklingsprocesser och att modellera medfödda avvikelser. Under den första dagen i livet, fortskrider den zebrafisk embryot genom många utvecklingsstadier, inklusive gödsling, klyvning, gastrulation, segmentering, och organogenesen av strukturer såsom njure, hjärta och centrala nervsystemet. Anatomi av en ung zebrafisk embryo presenterar flera utmaningar för visualisering och analys av vävnader som är inblandade i många av dessa händelser, eftersom embryot utvecklas tillsammans med en rund äggula massa. Således, för noggrann analys och avbildning av experimentella fenotyper i fasta embryonala exemplar mellan tailbud och 20 somit stadiet (10 och 19 timmar efter befruktning (HPF), respektive), såsom de som färgas med hela montera in situ hybridisering (WISH), det är ofta önskvärt att avlägsna embryot från gulan ball och för att positionera den platt på ett objektglas. Däremot kan utföra ett platt fäste förfarande vara tråkiga. Därför framgångsrik och effektiv plan montera beredning underlättas i hög grad genom den visuella demonstration av dissektion tekniken, och också hjälpt av att använda reagens som hjälper till optimal hantering vävnad. Här ger vi vår WISH protokoll för en eller två-färgs detektion av genuttryck i zebrafisk embryot, och visa hur platt monteringsförfarandet kan utföras på detta exempel på en färgade fasta prov. Denna platta montering protokoll är brett tillämpbar på studiet av många embryonala strukturer som uppstår under tidig zebrafisk utveckling, och kan genomföras parallellt med andra färgningsmetoder som utförs på fasta embryoprov.
Introduction
Den zebrafisk, Danio rerio, har blivit en allmänt använd organism i studien av utvecklingsbiologi. Zebrafisk är en tropisk, sötvatten ryggradsdjur som tillhör familjen Cyprinidae. Zebrafisk användes ursprungligen för miljöforskning för att få information om riskerna med potentiella vattenföroreningar, eftersom de var lätt att få, billig och lätt att underhålla 1. Under de senaste trettio åren har zebrafisk blivit erkänd som en genetiskt lätthanterlig ryggradsdjur modellsystem för en mängd orsaker. Zebrafish visar en hög grad av anatomiska och fysiologiska bevarande med högre ryggradsdjur inklusive däggdjur 2,3. Nyligen genomsekvensen anteckning har visat att cirka 70% av mänskliga gener har minst en zebrafisk motsvarighet 4. Till exempel har många ortologa gener som spelar en viktig roll under njurutveckling förekommer mellan dessa arter 5-7. Denna DRAmatic grad av bevarande med avseende på cell-och molekylärbiologi har gjort det möjligt för forskare att skapa modeller för ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar i zebrafisk 8, och zebrafisk har blivit ett värdefullt verktyg för att identifiera potentiella läkemedelsbehandlingar med hjälp av kemiska genetiska skärmar 9.
Dessutom är inte bara möjlighet att rekapitulera en mängd komplexa utvecklingsprocesser och sjukdomstillstånd som ses hos människor, men flera ytterligare attribut öka även sitt överklagande som modellorganism för embryologiska studier av zebrafisk modell. Zebrafisk är oviparous och reproducera genom broadcast lek, vilket ger forskare med enkel tillgång till de embryon från uppkomsten av befruktning 10. Andra fördelar är embryo storlek, öppenhet, och snabb, extern utveckling 10. Dessutom, zebrafisk vuxna har hög fruktsamhet och vanligtvis producerar relativt stora kopplingsstorlekar som kan variera mellan 200-500per vecka, i slutändan gör det möjligt för forskare att utföra hög genomströmning experiment, såsom fenotyp baserad kemiska skärmar, med lätthet 9.
Trots detta, trots de många fördelar som är utställda av zebrafisk modell, det finns utmaningar som hänför sig till analys och kommunikation av de experimentella resultaten från tidiga utvecklingsstadier. I vissa fall kan den inneboende anatomin i zebrafisk embryot skymma visualiseringen av en data. Efter befruktningen, genomgår den initiala cell flera klyvningshändelser som utvecklingen fortskrider 11. Efter gastrulation, framträder den embryonala axeln vid tailbud stadiet (10 HPF) så att den lindas runt äggulan 11. Som senare utveckling fortskrider genom segmenteperioden, kommer stammen att växa i massa och även förlänga med axiell töjning så att en svans tillsammans med en del av gulesäcken själv sträcker sig ut från den centrala äggula massan11. Mellan tailbud och 20 somit stadiet (19 HPF), försök att följa särskilda utvecklingsfunktioner efter utnyttjande av olika färgningsprotokoll som vill kan vara en utmaning både för att visualisera och fotografera på grund av geometrin hos embryot och opacitet gulesäcken. Ett sätt att eliminera dessa problem är att ta bort äggulan och därefter platta till embryo i en två-dimensionell prov som kan analyseras på ett mer rättframt sätt.
Följande protokoll och videoresurser ger en guide för hur man framgångsrikt deyolk och platt montera ett embryo efter fixering och färgning, med hjälp av exempel på en eller två färger WISH färgning. WISH är en allmänt använd teknik som möjliggör detektering av specifika nukleinsyror i konserverade prover och därmed gör det möjligt att ställe (n) av genuttryck som skall detekteras inom vävnader. WISH-tekniker har beskrivits utförligt, och kan utföras med olika färgsubstrat liksom influensaorescent detektionssystem 12-20. Här ger vi vår modifierade WISH protokoll som används för zebrafisk embryon mellan tailbud och segmenteutvecklingsstadier. Alternativa WISH protokoll, dock är kompatibla med den platta fästet förfarande som beskrivs här, som inledningsvis av protokollet nedan. Dessutom kunde platt monterings användas tillsammans med vilket som helst antal av existerande visualiseringstekniker, som till exempel hela montera immunohistokemi eller cellhärstamnings tracking etiketter, som inte beskrivs i detta protokoll. Sammantaget kan tekniken med platta montering bättre möjliggör överlägsen analys och presentation av data från experiment med de tidigaste stadierna av embryonal utveckling i zebrafisk.
Protocol
Förfarandena för att arbeta med zebrafisk embryon som beskrivs i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Notre Dame. Anm: De förfaranden som beskrivs i delarna 1-5 användes för att generera embryot bilder, som presenteras här i representativa resultat. De förfaranden som beskrivs i delarna 1-5 kan ersättas enligt önskemål med alternativa WISH rutiner 12-16 eller andra visualiseringstekniker såsom immunhistokemisk märkning av specifika proteiner med hjälp av specifika antikroppar. Vid utförandet av platta fästen på WISH zebrafisk embryon med det protokoll som beskrivs i delarna 1-5, den första embryo fixering och slut färgning fixeringssteg är de stora manipulationer som påverkar möjligheten att ta bort äggula granulat från provet för platt montering. De bästa platt monterings resultat erhålls när den initiala upptagningen utförs med färskt tinade iskall 4% paraformaldehyd (PFA) / 1 x PBS och fixering avden sista önskan färgningsreaktion med iskall 4% PFA/1x PBS (som inte behöver vara nyligen tinas), och vi rekommenderar att läsare att överväga detta när ersätter alternativa färgningsmetoder i kombination med delarna 6-8.
1. Embryo Insamling, Fixering, och lagring
- Förbered parning burar genom att placera vuxna zebrafisk män (s) och kvinnliga (er) i kamrarna i systemets vatten, så att de är åtskilda av en avdelare över natten.
- Ta bort avdelare mellan vuxna och samla de befruktade äggen med hjälp av en fin trådnät tesil i ~ 15-30 min för parning för att samla kopplingar som har motsvarande embryonala stadier.
- Vrid silen upp och ner och skölj ytan med en fin ström av E3 dispenseras från en sprutflaska för att överföra embryon till inkubations-skålar innehållande ungefär 25 ml av E3-lösning.
- Efter insamling kopplingarna, dela upp dem i flera rätter så att cirka 50-60 embryon inkuberasi varje skål med 25 ml E3-lösning. Anm: Överbeläggning av embryon kan leda till dramatiska utvecklings asynchrony inom kopplingen och försiktighet bör vidtas för att undvika detta för att möjliggöra snabb insamling av det önskade steget (n).
- Inkubera embryon vid 28,5 ° C för att göra det möjligt för utvecklings bedömning enligt den zebrafisk standard iscensättning serie 11.
- Använd en plast överföringspipett att försiktigt placera det önskade antalet embryon i utvald tidpunkt, fram till den 20 somit steget (19 HPF), in i en plan botten mikrocentrifugrör. Obs: Var försiktig i hanteringen av unga embryon, eftersom de är ömtåliga och kan lätt skadas genom att krossa eller aggressiv behandling med överföringspipetter. Alternativt kan glasflaskor användas för fixering och bearbetning av embryon. För alla efterföljande protokoll tvättar plastöverföringspipetter kan användas, med undantag av riboprob tillsats och avlägsnande (steg 3,11, 3,14).
- Byt ut E3 med iskall 4% PFA/1x PBS, ochfixa embryona i sina chorions i 4% PFA/1x PBS under 4 h vid rumstemperatur eller vid 4 ° C över natten. Varning: PFA är giftig och PFA lösningar ska hanteras vid en kemisk huva iklädd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive handskar och skyddsrock. Dessutom bör PFA pulver hanteras med exceptionell försiktighet vid förrådslösningen, som även den granulerade PFA kan tendera att dispergera genom statisk laddning. Typiskt PFA framställes genom uppvärmning av 1 x PBS till kokning för upplösning av PFA-pulver, och sedan lösningen lagrades i alikvoter vid -20 ° C. Om fina sediment är närvarande i 4% PFA/1x PBS en gång lösningen kyls, filter sterilisera den kylda lösningen före alikvotering för fryslagring genom att passera den genom ett 0,45 pm filter systemet. Endast nygjord eller nyligen tinade PFA används för denna första (dvs. primär) fixering av embryot.
- Ta bort fix och tvätta embryon två gånger med 1x PBST, sedan överföra tillen inkubering skålen.
- Visa embryon under ett stereomikroskop och använder två par fin pincett för att ta bort chorions omger embryon, så att ett par används för att försiktigt dra nytta embryot medan det andra paret används för att riva upp chorion.
2. Embryo Permeablization
- Överför dechorionated embryon tillbaka in mikrocentrifugrör eller glasflaska på, skölj två gånger med 1x PBST för att avlägsna eventuella kvarvarande chorion skräp.
- Avlägsna 1x PBST och tvätta embryona två gånger med 100% metanol (MeOH).
- Placera embryon vid -20 ° C under åtminstone 20 min. Not: Embryon kan lagras vid -20 ° C i MeOH i ett år eller mer. Metanol gör chorions klibbig, alltså inte vidare till det här steget, om inte chorions har tagits bort.
- Rehydrera embryona genom att avlägsna 100% MeOH och tvätta dem vid rumstemperatur i 5 minuter vardera i 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, sedan två gånger med 1 x PBST. </ Li>
- Bered en färsk proteinas K-arbetslösning (5 pg / ml) genom att tillsätta 25 | il färskt tinade proteinas K lager (10 mg / ml) till 50 ml 1x PBST.
- Avlägsna 1x PBST från embryon, sedan ersätta med proteinas K arbetslösning och inkubera baserad på fosterstadiet: <= 5 somites för 1 min; 10-12 somites under 1,5 min; 15 somiter för 2 min och 20 somiter för 3 min.
- Avlägsna proteinas K-arbetslösning och tvätta embryona två gånger med 1x PBST.
- Avlägsna 1x PBST och ersätta med iskall 4% PFA/1x PBS under minst 20 min vid rumstemperatur.
3. Ribosond Synthesis, Förhybridisering, hybridisering, och Probe borttagning
- Montera antisense riboprobe in vitro transkriptionsreaktion vid rumstemperatur i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, och samtidigt hålla enzymer på is, genom att kombinera en DNA-mall innehållande sekvensen som motsvarar genen av intresse (antingen 100 till 200 ng av PCR-produkt eller 1,5 | ig av lineariserad DNA-plasmid, framställd såsom beskrivits 12,13), 2 | il av digoxigenin eller fluoresceinmärkt ribonukleotider, 2 | il av den lämpliga RNA-polymeras (SP6, T3, T7, beroende på vilken sekvens är inkorporerad i PCR-produkt eller närvarande på DNA-plasmid), 2 ^ il 10 x transkriptionsbuffert, 0,5 | il RNas-inhibitor, och sätta till en total volym på 20 ul med molekylärbiologisk kvalitet destillerat vatten (DNas, RNas-fritt). Obs: 10x transkription buffert bör förvärmd genom att placera röret i ett 37 ° C vattenbad i 10-20 minuter, och virvlas efteråt för att se till att alla komponenter är i lösning. Om vita flingor är närvarande, inkubera röret för en annan 5 till 10 min och vortexa igen. Transkriptionsreaktioner kan misslyckas eller ha dåliga utbyten om transkriptionsbuffert inte är helt upplöst och blandas ordentligt.
- Blanda komponenterna och inkubera varje reaktion vid 37 ° C under 2 h i ett vattenbad.
- Ta reaktionen tuvara (s) från vattenbadet, och förstöra DNA-mallen i varje prov genom att tillsätta 5 pl av 10x DNas buffert, 2 pl DNas I enzym och 23 l av molekylärbiologisk kvalitet destillerat vatten för att bringa den totala volymen till 50 pl, och sedan inkubera varje rör vid 37 ° C under 20 min i ett vattenbad.
- Utföra en etanolutfällning i varje mikrocentrifugrör genom att tillsätta 5 | il 3 M natriumacetat, pH 5,2 och 110 ul av iskall 100% etanol, följt av 1 | il glykogen lager för att underlätta RNA-pelleten visualisering i efterföljande steg, och sedan inkubera röret vid -20 ° C i minst 1 h eller över natten.
- Centrifugera varje mikrocentrifugrör vid maximal hastighet 4 ° C i 20 minuter, ta sedan bort 100% etanol supernatanten och ersätta med 100 pl 70% iskall etanol.
- Centrifugera varje mikrocentrifugrör vid 4 ° C under 5 min, sedan ta bort 70% etanol supernatanten och lufttorka pelleten under 5 minuter och sedan slutligen lägga till 100 | il av molecular grade destillerat vatten för att resuspendera pelleten och kvantifiera riboprob förrådskoncentration med användning av en Nanodrop spektrofotometer. Obs: När pellets har gått i lösning, bör riboprobe lager hållas på is och förvaras vid -20 ° C.
- För att förbereda de fasta embryon för förhybridiserings processen, ta bort 4% PFA/1x PBS från varje prov och tvätta embryon två gånger med 1x PBST.
- Överföring mellan 25-40 embryon i 1x PBST i varje enskild plan botten mikrocentrifugrör. OBS: Trångboddhet av embryon kommer att leda till ojämn färgning senare, och försiktighet bör vidtas för att begränsa urvalsstorleken i varje rör till ca 40 embryon.
- Byt 1x PBST i varje rör med 500-1000 l av HYB +.
- Placera röret (n) av embryon i en ugn inställd på 70 ° C och inkubera dem vid denna temperatur under 4 h för att utföra förhybridisering.
- Förbered riboprobe / HYB + lösning genom att lägga 100-500 ng riboprob (digoxygenin och / eller fluorescerein-märkt) till 500 | il färskt HYB + och sedan inkubera denna lösning vid 70 ° C under minst 20 min före steg 3,11 till Förvärm den. OBS: För att upptäcka om flera gentranskript, med hjälp av singel och / eller dubbel kolorimetrisk märkning, var och en av de riboprobes motsvarar dessa gener måste kombineras till en riboprob / HYB + cocktail.
- Avlägsna förhybridiseringen HYB + från varje rör av embryon och ersätta med tillräcklig riboprob / HYB + att täcka embryon. Anm: Normalt är nödvändig för att täcka embryon i en plan botten mikrocentrifugrör 200-250 pl riboprob / HYB +. Riboprob / HYB + tillägg och borttagning är vanligtvis utförs med hjälp av en pipett och barriär tips för att förhindra korskontaminering mellan prover.
- Inkubera embryon vid 70 ° C över natten med ribroprobe / HYB ^.
- Förbered följande uppsättning tvättlösningar och pre-värma dem över natten vid 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT, och 0,2 x SSCT. OBS: Det är lämpligt att framställa 50 ml aliquots hos varje tvättlösning, eftersom överskottet kan lagras vid rumstemperatur och därefter återupphettas för framtida användning.
- Avlägsna riboprobe / HYB + med en pipett och barriär tips och förvara vid -20 ° C. Anm: Normalt varje riboprobe / HYB + blandning kan användas flera gånger (t.ex. 3 eller fler) utan minskning av signal. Medan åter riboprob / HYB + associeras med lägre bakgrund dock hålla i minnet att åter riboprob blandningar kan bli föremål för nedbrytning.
- Tvätta embryona två gånger med 50% formamide/2x SSCT under 30 min vid 70 ° C.
- Tvätta embryona gång med 2x SSCT under 15 min vid 70 ° C.
- Tvätta embryona två gånger med 0,2 x SSCT under 30 min vid 70 ° C.
- Avlägsna 0.2x SSCT och tvätta embryona två gånger med MABT vid rumstemperatur.
4. Anti digoxygenin Antikropp Inkubation och Detection
- Bered färsk blocket lösning.
- Avlägsna MABT och ersätt med blocket lösningtion.
- Inkubera embryon i blocket lösning för 2-4 timmar vid rumstemperatur. OBS: Längre blockera inkubationer ger optimala resultat med unga zebrafisk embryon stadier (<15 somites). För att göra den långa blocket förfarandet, utför blocket inkubation under 8-12 timmar i rumstemperatur eller en kombination av rumstemperatur plus (upp till ~ 8 tim) en efterföljande 4 ° C inkubering över natten.
- Förbered anti digoxygenin antikroppslösningen genom att göra en 5000-faldig utspädning i färskt blocket lösning (t.ex. 1 l per 5 ml blocket).
- Ta blocket och lägga antikroppen / blocket lösning.
- Täck provet i folie och inkubera över natten vid 4 ° C eller under 4 h vid rumstemperatur.
- Avlägsna anti-digoxygenin/block och tvätta embryona minst 10 gånger med MABT. OBS: Överför embryon till 12-brunnar för MABT tvättar. Detta ökar den hastighet med vilken embryona kan tvättas, vilket är användbart vid behandling av stora provkvantiteter, ennd gör det enkelt att övervaka utvecklingen av färgningsreaktionen (steg 4.11) under ett stereomikroskop. OBS: På den här embryon steg kan "super-tvättade" genom att inkubera dem över natten i MABT vid 4 ° C innan du fortsätter till steg 4,8, vilket är en användbar behandling för sonder som tenderar att ge hög bakgrund eller fläckar som kräver lång uppföljning under arbeta dag.
- Förbered före färgning buffert och den önskade färgningslösning (lila eller rött substrat).
- Avlägsna MABT och tvätta embryona i pre-färgningsbuffert under 5 min vid rumstemperatur.
- Ta pre-färgning buffert och tillsätt färglösningen.
- Övervaka utvecklingen av rumstemperaturen färgreaktion var 15-30 min genom att kontrollera utseendet på embryon under ett stereomikroskop. Anm: Hastigheten för färgningsreaktionen kan bromsas genom att överföra proven till 4 ° C, om det är nödvändigt att ge mer tid för slutförandet av fläcken. När kylas till 4° C, men reaktionen kan inte påskyndas genom uppvärmning till rumstemperatur.
- När färgningsreaktionen är klar, ta bort färglösningen och ersätta med 1x PBST.
- Tvätta två gånger med 1 x PBST under 5 min. OBS: Om inte upptäcka andra gener med ett annat substrat, därefter fastställa proverna i iskall 4% PFA/1x PBS under minst 20 minuter, och gå vidare till steg 6.1. Annars går du vidare till steg 5.1.
5. Anti fluorescein Antikropp Inkubation och Detection
- Avlägsna 1x PBST och tvätta embryona två gånger med 0,1 M glycin, pH 2,2 under 15 min vardera vid rumstemperatur. Notera: Tiden för glycin tvättar är nödvändigt att helt stänga av första färgreaktion.
- Avlägsna 0,1 M glycin och tvätta embryona två gånger med MABT under 5 min vid rumstemperatur.
- Förbered anti-fluorescein-antikropp-lösning genom att ge ett 5000-faldig spädning med färskt blocket lösning (t.ex. en fil per 5 ml av blocket).
- Avlägsna MABT och lägga antikroppen / blocket lösning. Följ steg från 4,6 till 4,13 för att utföra detekteringen av fluoresceinmärkt ribroprobe. Anmärkning: När det slutliga färgningsreaktionen är fullbordad, är det väsentligt att den sista fixering av provet sker i iskall 4% PFA/1X PBS. Fixering med varmare PFA lösningar tenderar att förknippas med klibbiga äggula som är svåra att ta bort från embryot under dissekering och deyolking för den platta monteringsförfarandet.
6. Embryo Dissection och Initial Deyolking av Embryo
- Välj en fast, färgas embryo för platt montering.
- Använd en pipett för att placera den valda embryot provet i en plast eller glas petriskål med 1x PBST.
- Placera skålen under ett stereomikroskop, och rulla embryot med hjälp av ett par fina pincett eller frans verktyg så att en lateral vy uppnås och de huvud-och stjärtändarna visualiseras.
- Använd ett par fina pincett för att göra ett snitt i the äggula i en position som ligger centralt mellan huvudet och svansen av embryot, och under tiden använda ett andra par fina pincett för att hålla embryot för att ge hävstång för att gulan snittet. Anmärkning: Alternativt göra två stora snitt i äggula, en nära huvudet och den andra nära den bakre delen av embryot.
- Använd fin pincett och / eller en frans verktyg för att ösa ut gulan ur äggulan cell hålighet.
- Skölj embryot försiktigt med 1x PBST att ta bort strö äggula.
7. Skön Deyolking av embryot
- Överför embryot till en plan glasskiva med 1-2 droppar 1x PBST.
- Använd en fransverktyg och fin pincett för att försiktigt placera embryot med den ventrala (äggula) uppåt på glasskiva.
- Dra embryot till kanten av 1x PBST-lösning med användning av frans verktyget så att embryot förblir i ett plant läge mot glasplatta.
- Skrapa den ventrala ytan av embryot försiktigt med piskan tillol för att ta bort äggula granulat utan att rippa embryot. Samtidigt använder ett par fina pincett för att förankra embryot medan skrapning med piskan verktyget. Notera: Borttagning av äggula granulat kan kräva upprepad skrapning 5-10 min.
- Om PBST lösningen blir belamrad med överskott äggula eller börjar att avdunsta, tillsätt 1-2 färska droppar 1x PBST till bilden med hjälp av en plast-eller glas överföringspipett och dra embryot till området med den rena lösningen för ytterligare äggula granulat borttagning.
- När gulan har på ett tillfredsställande avlägsnas, använd en överföringspipett att försiktigt röra embryot tillbaka in i en plast-eller glaspetriskål innehållande 1x PBST för en slutlig sköljning för att avlägsna strögule granuler.
- Överför deyolked embryo med hjälp av en plast-eller glas överföringspipett i en plast eller glas petriskål med 100% glycerol.
- Inkubera embryot i 100% glycerol under ~ 5 min för att acklimatisera embryot.
8. Montering på en glasplatta
- Överför deyolked embryot till ett rent objektglas i 1-2 droppar av 100% glycerol.
- Placera embryot med den ventrala (äggula) uppåt glasskiva.
- Med hjälp av en fransverktyget drar embryot till kanten av glycerolen droppe så att embryot förblir i ett plant läge mot glasplatta. Om den embryonala axeln är böjd, använda fin pincett för att försiktigt göra mycket små snitt i den kvarvarande äggula cellmembranet för att lindra spänning, så att embryot kan placeras plant på objektglaset med en rak axel.
- Placera små divots av modellera på de fyra hörnen av en 18 x 18 mm täckglas. Obs: Alternativt kan små droppar av vakuum fett 15 ersätta modellera.
- Placera glastäckglas långsamt på embryot, vinkla täckglas för att minimera uppkomsten av luftbubblor i glycerol runt provet.
- Lägg till ytterligare en minskning med 100% glyceroltill den sida av täckglas för att fylla utrymmet mellan täckglas och objektglas.
- Tryck ner långsamt och försiktigt på de fyra hörnen på täckglas för att stadigt placera embryot mellan glaset och eliminera drifting. Obs: Var noga med att inte krossa embryot.
- Om embryot inte är placerad så önskas, använda fin pincett för att ta bort täckglas. Använd piskan verktyget för att flytta embryot och / eller fin pincett för att göra ytterligare snitt så att embryot kan flyttas. Upprepa steg från 8,4 till 8,7.
- Observera och / eller bild provet med hjälp av antingen en stereo-eller sammansatt mikroskop.
- Förvara den platta montera beredningen lägenhet med en pappglashållare i mörker vid 4 ° C under flera veckor eller tillfälligt vid rumstemperatur. Obs: WISH fläcken kommer att blekna gradvis över tiden, särskilt röda substratreaktioner, och kan inte bevaras i glycerol obestämd tid. Lila fläckar blekna också lättare om de hålls i glycerol jämfört medPFA (se Steg 8.11). Intressant nog har det publicerats som monterings embryon i Permount stället för glycerol kan möjliggöra obegränsad förvaring i rumstemperatur 15.
- För långtidslagring av lila substrat färgade prover, ta bort täckglas och skölj embryot sköljas två gånger i 1x PBST, sedan överföra till en mikrocentrifugrör med 4% PFA/1x PBS för långtidslagring. Obs: Alternativt kan embryon i 1x PBST behandlas för ytterligare analyser, till exempel DNA-isolering för genotypning.
Representative Results
Den platt monteringsprotokoll förfarande innebär omvandling av zebrafisk embryo från dess normala anatomi, i vilket kroppen axel är lindad runt ett centralt beläget äggula boll, i en två-dimensionell framställning (Figur 1A). Whole mount avbildning av den unga zebrafisk embryot är begränsad av den typ av hur den embryonala axeln är virad runt äggulan. Som ett resultat, sido-eller rygg utsikt över hela montera färgade embryo exemplar kan bara fånga en del av den axel eller obskyra vissa vävnader (Figur 1B). Som jämförelse möjliggör deyolking och utplattning av embryot hela embryonala axeln som skall visualiseras på en gång (Figur 1B). Dessa begränsningar demonstreras genom att undersöka en WISH färgade embryo som var märkt med antisens riboprober att upptäcka irx3b (lila), vilket markerar en delmängd av njur stamceller belägna intill somites 7 till 13, och myod1 (röd) som etiketter försomiter (Figur 1B). Området irx3b + njur stamceller skyms i hela montera lateral vy eftersom irx3b avskrifter är riklig i det centrala nervsystemet, vilket gör njurområdet praktiskt taget omöjligt att visualisera med sidokameravinkel; vidare är området för irx3b + renala progenitorer endast delvis synliga när embryot roteras in i en dorsal kamera vy eftersom fältet är lindad runt äggulan (Figur 1B). Men en rygg bild av samma embryo efter platt montering gör hela det irx3b + njur progenitorceller som ska analyseras på ett enkelt sätt i förhållande till de somites längs stammen och andra embryonala strukturer (Figur 1B). Sålunda kan elaborate spatiala domäner vara ideal dokumenterat med denna metod.
Flera viktiga steg är involverade i ett framgångsrikt genomförande av den platta monteringsförfarandet. För att utföra denna technique måste äggulan kulan första lossades från embryo korrekt (figur 2A), vilket kan göras med fina instrument, såsom ett par av fin pincett medan embryot visualiseras med användning av ett stereomikroskop. Efter den råa avlägsnande av äggula boll, är ett fint lash verktyg utnyttjas för att skrapa bort äggula granuler som förblivit bunden till embryot (Figur 2B). Avlägsnandet av återstående äggula granulat hjälper till att underlätta visualisering av de embryonala vävnader. Slutligen är det deyolked embryot manipuleras för att placera den stabilt på en glasplatta (figur 2C), som möjliggör observation och hjälpmedel dokumentation av provet med hjälp av bildbehandlingsprogram och en kamera ansluten till mikroskopet. De lash verktyg är hemgjord enheter som kan konstrueras genom att fästa en lämplig piska till en pipett spets med superlim, som kan monteras på ett handtag om så önskas (Figur 3A, Material tabell). Olika lash prover kan tas tillvara för att produceralash verktyg med lite olika egenskaper i fråga om längd och kona (Figur 3B), där varje användare kan ha olika preferenser för när de börjar experimentera med den platta fästet proceduren. Exempel på lash prover inkluderar naturligtvis kasta mänskliga ögonfransar, naturligt fäller djur sträv päls eller morrhår, och slutligen syntetiska sorter av kommersiellt tillgängliga fransar finns i detaljhandeln kosmetiska avdelningar.
Det lokala området som omger och som innehåller provet (er) som är placerad på en glasplatta (figur 4A) kan avbildas för högupplösande analys. En kombination av prober användes för att märka utvecklingsnjur stamceller som ger upphov till njurarna hos vildtypen embryot i tidiga utvecklingsstadier med tvåfärgad WISH, och sedan platt montera förberedelser utfördes för att se proverna (Figur 4B, 4C ). Under de tidiga somit stadierna, är njur progenitorceller avgränsade i ett U-format mönster av ThEIR uttryck för pax2a avskrifter (lila) som omger axelparallella mesoderm som samtidigt uttrycker delta C (dlc) (röd) (vänster kolumn, figur 4B) 6,7. I jämförelse, när DLC-transkripten detekterades med ett purpurfärgat substrat, och märktes i kombination med bakhjäman markör krox20 (röd), gjordes en rostral domän i njur progenitorer visualiseras som uttrycker dlc (högra kolumnen, figur 4B), såsom nämnts ovan 6,7. Platta mount beredningar kan användas på liknande sätt för att studera senare somitogenesis etapper. Vid 14 somit stadiet, analyserade vi uttrycket av njurmarkörer pax2a, slc4a4 och slc12a3 (lila) tillsammans med smyhc1 (röd), som markerar de somites (Figur 4C). Dessa kombinationer gör det möjligt att kartlägga hela den renala progenitor domän med pax2a samtidigt avslöjar att en undergrupp av celler i en rostralt domän exprbetas slc4a4a och utmärkte sig genom en icke-överlappande svansdomän av njurgångare som uttryckte slc12a3.
Tvåfärgad WISH och platta montera beredningen är också värdefull för studier av cellulära domäner under organogenesen i zebrafisk med genetiska mutationer eller andra störningar från miljö exponering för små molekyler 6,7 (Figur 5). De zebrafisk NLS och lib mutanter hamnen mutationer i aldehyddehydrogenas 1a2 (aldh1a2, tidigare känd som raldh2), som kodar för ett enzym som krävs för biosyntesen av retinoinsyra (RA). RA är en förutsättning för en sund utveckling av många njurcelltyper inklusive bildandet av podocyte celler som bidrar till att göra blodfilter av den embryonala njure, som kallas glomeruli 6,7. WISH utfördes för att märka podocyte gångare med wt1a samtidigt med avgränsning av tHan utvecklar somites med smyhc1 och hindbrain med krox20 i vildtyp embryon, NLS muterade embryon, lib muterade embryon och embryon som behandlats med en ALDH-enzym kemisk inhibitor, DEAB (Figur 5). Embryon med bristfällig aldh1a2 uttryck visade minskad wt1a uttryck jämfört med vilda embryon typ, medan DEAB-behandlade embryon visade ett upphävande av wt1a avskrifter (Figur 5, höger kolumn). Sammantaget visar dessa representativa resultat visar hur den platta mount teknik kan användas för att analysera och dokumentera anatomiska skillnader med precision i det tidiga embryot, och därmed implementeras för värdefulla utvecklingsstudier.
Figur 1. Översikt av den platta montera förbereration för zebrafisk embryon. A) Förfarandet för platt montering möjliggör samtidig bild av vävnader längs den embryonala axeln eftersom den centrala äggula massan avlägsnas och embryot stabilt placerad på en plan yta. B) Bilder av en hela berget WISH färgade embryo i laterala och dorsala vyer, och sedan efter en platt fäste beredning genomfördes. Embryot färgades med antisens-prober för att detektera gen-transkript som kodar irx3b (lila) och myod1 (röd).
Figur 2. Schematisk bild av den plana monteringsförfarande för zebrafisk embryon. A) Embryot första grovt deyolked att avlägsna huvuddelen av äggulan massa, sedan (B) den ventrala ytan finfördelas deyolked att undanröja kvarvarande äggula granuler, ochefter tvättning embryot är (C) monterad ryggsidan upp på ett objektglas för visuell analys och / eller fotografisk avbildning.
Figur 3. Fotografier av exempel lash verktyg jämfört med fin pincett. A) Hembakade lash verktyg avbildades tillsammans med ett par vanliga fin pincett, belägen intill en metrisk linjal för att ge en referens. B) Förstorad bild av frans verktyg intill fin pincett, med millimeterreferens anordnade längs den övre delen av vyn . Två olika lash verktyg visas med en asterisk (*) används för att markera den frans erhållas från en naturligt skjul mänsklig ögonhår, och dubbla asterisker (**) används för att markera en frans som erhölls från en naturligt skjul feline morrhår och trimmas till göra en något trubbig ände. I varje case, var frans träs genom pipettspetsen och fäst med flera lager av superlim för att successivt skapa en stark tätning för att stabilisera / förankra lash till pipetten fäst till en hanteringsenhet.
Figur 4. Karakterisering av utvecklingsmässiga förändringar i njurstamfader fältet i vildtyp zebrafisk embryo. A) Skjut schema som anger området avbildas för analys (B, C). B) vildtyp embryon vid 1, 3 och 5 somit skede färgades med tvåfärgad vill utvärdera sammansättningen av njurstamfader fält som ger stiga till den embryonala njur eller pronephros. (Vänster kolumn) Transkript som kodar för transkriptionsfaktor pax2a (färgade i lila) markera flera populationer i embryot, inklusive njur progenitor område som framgår av den mellanliggande mesoderm. Transkript som kodar för Notch-liganden dlc markera somites som bildar från paraxiala mesoderm (färgas i rött). (Höger kolumn) När uttrycket av DLC-transkript (färgade i lila) och bakhjäman rhombomere markören krox20 (färgas i rött) granskas i samma embryon, kan observeras dlc uttryck i en rostral domän i njur progenitorceller placerade intill somites 1-5, som var skymd vid samtidig färgning av dlc med pax2a. C) Vilda typ embryon vid 14 somit scenen var dubbel eller trippel-färgade med en kombination av en njur markör (lila), den somit markör smyhc1 (röd) , och bakhjäman rhombomere markören krox20 (även röda). (Övre panel) I detta skede pax2a avskrifter fortsätter att avgränsa njurstamfäder. (Mellanöstern, lägre paneler) Inom njurstamfader territorium, är en rostral subdomän märktgenom slc4a4 och avskrifter som kodar slc12a3 markera en svansdomän.
Figur 5. Användningen av schablon monterade förberedelser för att karakterisera de fenotyper som orsakas av genetiska mutationer eller kemiska genetiska störningar som modulerar retinoic biosyntesen syra. I WISH uttrycksmönster vid 15 somit skede av wt1a (lila) och smyhc1/krox20 (röd) jämfördes mellan vilda typer och embryon med brister i retinoinsyra (RA) produktion på grund av brister i aldehyddehydrogenas 1a2 (NLS och lib mutationer) eller kemisk hämning av retinaldehyde dehydrogenasaktivitet med diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Minskningen av RA produktionen i lib är något allvarligare än NLS, t.ex.att lib embryon uttrycker något reducerad färgning av wt1a avskrifter än på liknande iscensatt nls muterade embryon, medan DEAB behandling av vilda typer förknippas med komplett upphäva wt1a uttryck.
Discussion
Zebrafisk har visat sig vara ett mycket värdefullt modellorganism i hela forskarvärlden under de senaste åren. Zebrafisk uppvisar en betydande grad av genetisk konservering med det av högre ryggradsdjur, och fördelar som rör deras anatomi, avel, och livscykel gör denna art mycket mottagliga för experimentella analyser. Dessutom har utvecklingen av molekylära tekniker som gäller för zebrafisk främjas ytterligare användningen av denna modellorganism i vetenskaplig forskning. Till exempel har ett stort utbud av transgena zebrafisk linjer tagits fram för att studera sjukdomsförloppet och besvara många grundläggande frågor som ligger bakom de viktigaste mekanismerna för utveckling inklusive organogenesen.
Följaktligen, baserat på dynamisk användning av zebrafisk i både sjukdomen och dess utvecklingsforskning, cellmärkningsmetoder och signal kvantifiering är en viktig aspekt av dataanalyser. Även metoder som använder fluorescerande etttibodies kan användas för att detektera proteinuttryck i transgena zebrafisk, forskare förlitar sig typiskt på standardförfaranden som WISH 12-16 att undersöka spatiotemporal lokalisering av gentranskript i en fast, icke-transgena zebrafisk provet. I själva verket är WISH en av de mest använda teknikerna i biologi 16, och är ett viktigt verktyg som används för att karakterisera fenotypen av genetiska mutationer och kemiska genetiska störningar. Icke desto mindre är WISH associerad med ett antal potentiella fallgropar och utmaningar. För att bekräfta specificiteten av antisens ribroprobe kan sens-riboprober användas som en kontroll för att bedöma specificiteten av antisens-riboprob färgningsmönster. Medan avsnitten 4 och 5 presenteras i den ordning märkning och upptäckt av en digoxygenin märkt prob följt av fluorescein-märkta sonden, kan denna ordning vändas. Normalt är svagare signaler (gener med lägre uttryck nivåer) bäst upptäckas med digoxigenin-märkta prober och denna fläckutvecklades först med en lila substrat, följt av detektion och färgning av starkare signal (mer rikligt uttryckt gen) genom att använda den röda underlaget. Men om två-färgreaktioner kommer att genomföras, är det rekommenderat att olika kombinationer av etiketter och substrat testas för att finna det förfarande som är mest lämpad för insamling och analys av data. Dessutom, de tider som anges blockering, antikropps inkubation och tvätt i avsnitten 4-5 är anpassade för embryon yngre än 24 timmar efter befruktning; långa intervaller av samma steg med äldre embryon kan leda till salt ackumulering på provet. Omfattande tips för felsökning standard zebrafisk embryo WISH har redan dokumenterats i litteraturen 12-16. Förmodligen den vanligaste dilemmat är hög bakgrund. Vi rekommenderar att öka antalet MABT tvättar i steg 4,7 till 15-20 tvättar om det behövs, men i vår erfarenhet tillägget av natten MABT "super-wash"ger enastående resultat när den används tillsammans med 10 eller fler korta MABT tvättar innan du går vidare till steg 4,8. Ett annat exempel dilemma är dålig sond infiltration, vilket kan förekomma med långa riboprobes. Klippning av riboprobe följande steg 3,6 genom alkalisk hydrolys kan motverka detta. I vår erfarenhet med unga prover, är sond klippning normalt inte behövs. Man bör dock ha i åtanke att parametrar som detta kan vara bidragande faktorer i resultatet av en WISH experiment, och vi föreslår granskning av dessa användbara felsökningsinstruktioner redan finns tillgänglig i samhället som behövs för att förfina de experimentella parametrar för WISH i din egen forskning 12.
Förutom traditionella WISH tekniker 12-16, har det skett en kontinuerlig växten av framsteg inom WISH metoder och alternativa protokoll som har formulerats. Dessa omfattar nya sätt att signaldetektering, såsom genom användning av fluorescens 17-19, att metoder som möjliggör lokalisering av microRNAs 20. Trots detta, trots de många förbättringar som har gjorts till aktuella cellmärkningsmetoder, är hur effektiva dessa förfaranden negeras om fläcken (s) inte lätt kan visualiseras i provet av intresse vid en önskad tidpunkt. Denna begränsning är problematiskt för forskare, särskilt när det avser de tidiga embryonala stadier av zebrafisk ontogeni, vilket potentiellt kan leda till luckor i vår förståelse av olika utvecklingsprocesser som uppstår vid dessa tillfällen. Under normal zebrafisk utveckling kommer gulesäcken successivt minskar i storlek eftersom embryot åldrarna 11. Därför är vid dessa senare utvecklingsstadier (> 24 h efter befruktning), är ganska okomplicerad WISH-färgning för att analysera på grund av att embryot är större i jämförelse med dess angränsande gulesäcken. Detta är dock inte fallet från svansen knoppstadiet till tidig somitogenesis (när embryonalamassan är placerad runt gulan) där den opaka gulesäcken ibland kan skymma visualiseringen av fläcken. Följaktligen var metoden för platt montering fram för att lindra de bild-och dataanalys problem i samband med karakteriseringen av tidiga zebrafisk embryo prover (schematiserade i Figur 1 och Figur 2), och har varit i stort sett används sedan systematiskt fenotypning av genetiska mutationer isolerade från de första storskaliga genetiska skärmar 21.
Sedan tillkomsten av den plana monteringsteknik, har analysen av tidiga utvecklingsstadier förbättrats betydligt. När gulan avlägsnas från embryot, är det möjligt att lägga embryot platt på ett objektglas i den önskade orienteringen för avbildning. Denna tvådimensionella läget möjliggör visning av hela embryot på en gång, vilket eliminerar behovet av att rotera provet. Många vävnader finns i breda områden av embryot, till exempelprekursorerna, som bildar blod och njure. Vidare kan man behöva jämföra flera olika utvecklings vävnader på en gång. Platt montering möjliggör att forskaren att samtidigt visa hela domänen av sådana cellgrupper, och därmed i hög grad kan underlätta kvantifieringar såsom ett mätningsområde för en vävnad eller cellräkningar. Denna teknik har i slutändan hjälpt leda till många upptäckter rörande en rad viktiga utvecklings mekanismerna bakom blodbildningen, neurogenes, och organogenesen. Således, en gång bemästrat, ansökningarna om denna enkla teknik för forskare är ganska betydande.
Till exempel i en studie för att undersöka härstamning val under blodbildningen, platt montera beredningar av zebrafisk embryon vid 14 och 18 somit steg (ss) användes för att illustrera de förändringar som skett i uttrycksmönstret för PU.1 zinkfingertranskriptionsfaktor mellan vildtyp och GATA1 morpholino injiceras embryon 22.Denna metod gjorde det möjligt för detektion av en expanderad PU.1 domän vid 18 ss, vilket indikerar att GATA1 är mest sannolikt att reglera expressionen av PU.1 i det mellanliggande cellmassan (ICM) runt denna tidpunkt. Ytterligare platt monterade embryon som färgats för olika erytroida gener inklusive gtpbp1 och epsin visade en förlust i uttrycket av dessa gener i vlt mutanter som var GATA1 - / -. Ytterligare analyser visade ingen förändring i uttrycket av erythoid gener som biklf och testhymin som var kända för att vara oberoende av gata aktivitet. Därför, tillsammans med sina andra experimentella resultat, visade det sig att GATA1 är viktigt att reglera differentiering av celler i Myelosuppression erytroid härstamning. I en studie på neural crest utveckling, var platt fästen används för att undersöka Crestin expression i Mont Blanc (MOB M610)-mutanter i en studieundersöka roller Mont Blanc och tfap2a geners funktion 23. Vid 10 och 20 ss, var Crestin uttryck helt upphävts i huvudet och minskade i bakluckan regionen mob M610 mutanter i jämförelse med den normala vildtyp uttryck, i slutändan hjälpa denna grupp att dra slutsatser om vikten av Mont Blanc och tfap2a reglering under neural crest bildning. Dessutom, i termer av organogenesen har platta fästen möjliggjort upptäckten av närvaron av distinkta domäner i den tidiga njur progenitor fältet under utveckling av zebrafisk embryonala njur-, känd som pronephros. Den zebrafisk embryot ger en konserverad och ändå anatomiskt okomplicerat system för att studera hur njur stamceller ger upphov till nefronet funktionella enheter som utgör de pronephros, en process som kallas nephrogenesis 6,7 (Figur 4). Flat montera analys har varit till nytta för dokument domäner av reinterna stamfäder och att dissekera resultatet av förändringar i RA signalering under pronephros mönstring 6,7 (Figur 5), som tidigare var okänd. Sammantaget dessa exempel visar att det faktiskt finns många breda applikationer för denna platta montera protokoll i studiet av olika processer som uppstår vid normal utveckling och sjukdomstillstånd.
Begreppsmässigt är ganska enkel övergripande denna platta mount procedur. Däremot kan de manipulationer och grad av finess som krävs för att bemästra denna metod vara ganska utmanande att bemästra i avsaknad av visuell demonstration. Därför var detta protokoll sammanställts för att göra det möjligt för forskare, särskilt de nya i zebrafisk modellen, med en möjlighet att bättre förstå hur man utför den här tekniken och dela våra råd om de reagenser som kan optimera vävnadshantering. Vi hoppas att detta protokoll i slutändan gör att andra i samhället för att förfina de mest idealiska provförhållanden som used för premium bildbehandling, dataanalys och kommunikation av resultaten i publikationer. I slutändan bör det göra det möjligt för forskare att övervinna de anatomiska hinder i zebrafisk under tidig embryogenes, vilket kan skymma presentation av experimentella resultat, och lösa dem med hjälp av denna enkla men betydelsefulla teknik.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis stöd av finansiering till RAW från var och en av följande: NIH bidrag K01 DK083512, DP2 OD008470, och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar beviljande av bidrag nr 5-FY12-75; starta fonder från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences. Vi vill särskilt tacka Elizabeth och Michael Gallagher, tillsammans med hela Gallagher Family, som förmedlade en generös gåva till University of Notre Dame för att främja stamcellsforskning. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar de stavar av Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning på Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg om våra zebrafisk koloni. Slutligen, vi tackar medlemmarna i vår forskningslabb för sina kommentarer, diskussioner och insikter om detta arbete, somsamt Marigold (Maripooka) och Zinnia Wingert för att ge naturligt kasta katt morrhår för att göra mest utmärkt lash verktyg för vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
- Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
- Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
- Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
- Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
- Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
- Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).
