Summary
Sebrafisk embryo er en utmerket modell for utviklingsbiologi forskning. Under embryogenesis, sebrafisk utvikle med en eggeplomme masse, som presenterer tredimensjonale utfordringer for prøve observasjon og analyse. Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter todimensjonale flate montere preparater av hele fjellet in situ (skulle ønske) farget sebrafisk embryo prøver.
Abstract
Sebrafisk embryo er nå ofte brukt for grunnforskning og biomedisinsk forskning for å undersøke den genetiske kontroll av utviklingsprosesser og for å modellere medfødte misdannelser. I løpet av første dag av livet, utvikler sebrafisk embryo gjennom mange utviklingsstadier, inkludert befruktning, cleavage, gastrulation, segmentering, og organogenesen av strukturer som nyre, hjerte og sentralnervesystemet. Anatomien til en ung sebrafisk embryo presenterer flere utfordringer for visualisering og analyse av vev som er involvert i mange av disse hendelsene, fordi fosteret utvikler seg i forbindelse med en runde plommemassen. Således, for nøyaktig analyse og avbildning av eksperimentelle fenotyper i anleggs embryoniske prøver mellom tailbud og 20. somitt trinn (10 og 19 timer etter befruktning (HPF), henholdsvis), slik som de som farget med hele montering in situ hybridisering (WISH), er det er det ofte ønskelig å fjerne embryoet fra eggeplomme balt og å plassere den flatt på et glass lysbilde. Imidlertid utføre en flat mount prosedyren kan være kjedelig. Derfor, vellykket og effektiv flat mount preparatet er mye lettere gjennom visuell demonstrasjon av disseksjon teknikk, og også bidratt ved å bruke reagenser som bistår i optimal vev håndtering. Her gir vi vår WISH protokoll for én eller to farger påvisning av genuttrykk i sebrafisk embryo, og demonstrere hvordan flat montering prosedyren kan utføres på dette eksempel på en farget faste prøven. Denne flat montering protokollen er bredt anvendelig til studiet av mange embryonale strukturer som dukker opp i løpet av tidlig sebrafisk utvikling, og kan gjennomføres i forbindelse med andre farvemetoder som utføres på faste embryo prøver.
Introduction
Sebrafisk, Danio rerio, har blitt et utbredt organisme i studiet av utviklingsbiologi. Sebrafisk er en tropisk, ferskvanns virveldyr arter som tilhører familien cyprinidae. Sebrafisk ble opprinnelig brukt til miljøforskning for å få informasjon om farene ved potensielle vannforurensninger, som de var lett oppnåelig, billig og lett å vedlikeholde en. I løpet av de siste tretti årene har sebrafisk blitt anerkjent som en genetisk medgjørlig virveldyr modellsystem for en rekke grunner. Sebrafisk viser et høyt nivå av anatomiske og fysiologiske konservering med høyere virveldyr, inkludert pattedyr 2,3. Nyere genomsekvens merknad har avdekket at ca 70% av menneskets gener har minst en sebrafisk motstykke fire. For eksempel har mange ortologe gener som spiller en viktig rolle under nyre utviklingen blitt identifisert mellom disse artene 5-7. Dette dramatiskmatic grad av bevaring med hensyn til mobilnettet og molekylærbiologi har aktivert forskerne å lage modeller for et bredt spekter av menneskelige sykdommer i sebrafisk 8, og sebrafisk har blitt et verdifullt verktøy for å identifisere potensielle narkotika terapi ved hjelp av kjemiske genetiske skjermer ni.
Videre er sebrafisk-modellen ikke bare i stand til å rekapitulere en rekke komplekse utviklingsprosesser og sykdomstilstander som er sett hos mennesker, men flere andre attributter også høyne sin appell som modellorganisme for embryologiske studier. Sebrafisk er oviparous og reprodusere gjennom kringkasting gyting, noe som gir forskerne med lett tilgang til embryoene fra utbruddet av befruktning 10. Andre fordeler er embryo størrelse, gjennomsiktighet, og rask, ekstern utvikling 10. I tillegg, sebrafisk voksne besitter høy fruktbarhet og produserer vanligvis relativt store clutch størrelser som kan variere mellom 200-500per uke, til slutt slik at forskerne å utføre store gjennomgangs eksperimenter, som for eksempel fenotype basert kjemiske skjermer, med letthet ni.
Likevel, til tross for overfloden av fordelene som er utstilt ved sebrafisk-modellen, det er utfordringer som gjelder for analyse og kommunikasjon av de eksperimentelle resultatene fra tidlige utviklingsstadier. I noen tilfeller kan den iboende anatomi av sebrafisk embryo tilsløre visualisering av ens data. Etter befruktning, den første cellen gjennomgår flere cleavage hendelser som utviklingen skrider 11. Etter gastrulation, framgår det embryonale aksen på tailbud scenen (10 HPF) slik at det er pakket rundt plommen 11. Som senere utvikling går fremover gjennom segmentering perioden, vil stammen vokse i massen og også forlenges ved aksial forlengelse, slik at et hale sammen med en del av plommesekken i seg selv strekker seg ut fra den sentrale plommemasse11.. Mellom tailbud og 20. somitt trinn (19 HPF), forsøk på å observere spesifikke utviklings egenskaper etter at utnyttelsen av forskjellige fargings protokoller, for eksempel ønsker det kan være utfordrende både for å visualisere og fotografiet på grunn av geometrien av embryoet og opasiteten plommesekken. En måte til å eliminere disse utfordringene er å fjerne plomme og deretter flate embryoet i en to-dimensjonal prøve som kan analyseres på en mer direkte måte.
Følgende protokoller og video ressurser gi en guide for hvordan du lykkes deyolk og flat montere et embryo etter fiksering og farging, med eksempel på en eller to farger WISH farging. WISH er en mye brukt teknikk som muliggjør påvisning av spesifikke nukleinsyrer i konserverte prøver, og dermed gjør det mulig for området (e) av genekspresjon som skal påvises i vev. WISH-teknikker har blitt omfattende beskrevet, og kan utføres med forskjellige farge substrater samt influensaorescent deteksjonssystemer 12-20. Her gir vi vår modifiserte WISH protokollen som brukes for sebrafisk embryo mellom tailbud og segmenterings stadier av utviklingen. Alternativt WISH-protokoller, men er forenlig med den flate monteringsprosedyren er beskrevet her, som nevnt i begynnelsen av protokollen nedenfor. I tillegg kunne flat montering utnyttes i forbindelse med hvilket som helst antall av eksisterende visualiseringsteknikker, som for eksempel hele fjellet immunhistokjemi, eller celle lineage sporing av etiketter, som ikke er beskrevet i denne protokollen. Generelt kan teknikken for flat montering bedre at overlegen analyse og presentasjon av data innhentet fra eksperimenter med de tidligste stadier av fosterutvikling hos sebrafisk.
Protocol
Prosedyrene for å jobbe med sebrafisk embryo som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame. Merk: Prosedyrene som beskrives i del 1-5 ble brukt til å generere embryo bilder gitt her i de representative resultater. Fremgangsmåtene som er beskrevet i deler 1-5 kan være substituert som ønsket med alternative WISH-prosedyrer 12-16 eller andre visualiseringsteknikker slik som immunohistokjemisk merking av spesifikke proteiner ved hjelp av spesifikke antistoffer. Ved gjennomføring av flate mounts på WISH sebrafisk embryo med protokollen beskrevet i deler 1-5, den første embryo fiksering og endelige flekker fiksering trinnene er de store manipulasjoner som påvirker evnen til å fjerne eggeplomme granulat fra prøven for flat montering. De beste flat monterings resultater oppnås når den første fiksering er utført med ferskt tint iskald 4% paraformaldehyd (PFA) / 1 x PBS og fiksering avden endelige WISH fargningsreaksjon med iskald 4% PFA/1x PBS (som ikke trenger å være ferskt tint), og det anbefales at leserne å vurdere dette når de erstatter alternative farvemetoder i kombinasjon med deler 6-8.
En. Embryo Collection, Fiksering og bagasje
- Forbered parring bur ved å plassere voksen sebrafisk male (s) og kvinne (r) i kamre system vann, slik at de er atskilt med en skillevegg over natten.
- Fjern skillevegger mellom voksne og samle de befruktede eggene med en fin netting tesil innenfor ~ 15-30 min av parring å samle clutcher som har tilsvarende embryonale stadier.
- Snu silen opp ned og skylle overflaten med en fin strøm av E3 dispenseres fra en sprut flaske for å overføre embryoene i ruge skåler inneholdende omtrent 25 ml E3-løsning.
- Etter å samle klørne, dele dem inn i flere retter slik at ca 50-60 embryoer inkuberesi hver skål med 25 ml E3-løsning. Merk: Overbefolkning av befruktede egg kan føre til dramatiske utviklings asynchrony innenfor clutch og omsorg bør tas for å unngå dette for å aktivere rettidig samling av ønsket scene (r).
- Inkuber embryoene ved 28,5 ° C for å muliggjøre utviklingsvurdering i henhold til sebrafisk standard iscenesettelse serien 11.
- Bruk en plast overføringspipetten til påfør ønsket antall embryoer ved det valgte endepunktet, opp til 20 somitt trinn (19 HPF), inn i en flat bunn mikrosentrifugerør. Merk: Vær forsiktig i håndteringen av unge embryo, som de er skjøre og kan lett bli skadet ved å knuse eller aggressiv behandling med overføringspipetter. Alternativt kan glassflasker benyttes til fiksering og behandling av embryoer. For alle etterfølgende protokoll vasker plast overføringspipetter kan anvendes, med unntak av riboprobe addisjon og fjerning (trinn 3.11, 3.14).
- Sett på E3 med iskald 4% PFA/1x PBS, ogfikse embryoene i sine chorions i 4% PFA/1x PBS i 4 timer ved romtemperatur eller ved 4 ° C over natten. Notat av forsiktighet: PFA er giftig og PFA løsninger skal håndteres på en kjemisk hette mens iført egnet personlig verneutstyr, inkludert hansker og labfrakk. I tillegg bør PFA pulver behandles med eksepsjonell forsiktig ved å gjøre lager-løsning, som til og med det granulerte PFA kan en tendens til å spre seg gjennom statisk ladning. Vanligvis PFA blir fremstilt ved oppvarming av 1x PBS til å koke for å oppløse PFA pulver, og hvorpå løsningen ble lagret i alikvoter ved -20 ° C. Dersom fint sediment er til stede i 4% PFA/1x PBS en gang oppløsningen er avkjølt, filtersteriliser den avkjølte løsning før aliquoting for fryselagring ved å føre den gjennom et 0,45 mikrometer filter-system. Bare nylaget eller fersk tint PFA brukes for denne første (dvs. primær) fiksering av embryoet.
- Fjern fikse og vaske embryoene to ganger med 1x PBST, deretter overføre tilen inkubasjonstid fatet.
- Se embryoene under et stereomikroskop og bruke to par av fin pinsett for å fjerne chorions omgir embryoene, slik at ett par er brukt til å forsiktig utnytte embryoet, mens det andre par er brukt til å rive opp chorion.
2. Embryo Permeablization
- Overfør dechorionated embryo tilbake i mikrosentrifuge tube eller hetteglass, skyll deretter to ganger med 1x PBST å fjerne eventuelle gjenværende chorion rusk.
- Fjern 1x PBST og vaske embryoene to ganger med 100% metanol (MeOH).
- Plasser embryoene ved -20 ° C i minst 20 min. Bemerk: Embryoer kan lagres ved -20 ° C i MeOH i ett år eller mer. Metanol gjør chorions klissete, derfor ikke fortsette til dette trinnet med mindre chorions har blitt fjernet.
- Rehydrere embryoene ved å fjerne 100% MeOH og vaskes ved romtemperatur i 5 minutter hver i 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, og deretter to ganger med 1 x PBST. </ Li>
- Tilbered en frisk proteinase K arbeidsløsning (5 ug / ml) ved tilsetning av 25 pl av ferskt tint proteinase K lager (10 mg / ml) til 50 ml av 1 x PBST.
- Fjern 1x PBST fra embryoer, deretter erstatte med proteinase K arbeidsløsning og inkuber basert på fosterstadiet: <= 5 somites for en min; 10-12 somites for 1,5 min; 15 somites for 2 min, og 20 somites for 3 min.
- Ta av proteinase K arbeidsløsning og vask embryoene to ganger med 1x PBST.
- Fjern 1x PBST og erstatte med iskald 4% PFA/1x PBS i minst 20 min ved romtemperatur.
Tre. Riboprobe Synthesis, Prehybridization, Hybridisering, og Probe fjerning
- Monter antisens riboprobe in vitro transkripsjon reaksjonen ved romtemperatur i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, samtidig som enzymer på is, ved å kombinere et DNA-templat inneholdende sekvensen som tilsvarer genet av interesse (enten 100-200 ng av PCRProduktet eller 1,5 ug linearisert plasmid-DNA, fremstilt som beskrevet 12,13), 2 pl av digoxygenin eller fluoriscerende merkede ribonukleotider, 2 ul av den passende RNA-polymerase (SP6, T3, T7, avhengig av hvilken sekvens er innlemmet i PCR-produktet, eller til stede på DNA-plasmid), 2 ul av 10 x transkripsjonsbuffer, 0,5 ul RNase inhibitor og føre til et totalt volum på 20 ul med molekylær klasse destillert vann (DNase, RNase-fri). Merk: 10x transkripsjonsbuffer bør være forvarmet ved å plassere røret i et 37 ° C vannbad i 10 til 20 minutter, vortex-blandet og etterpå for å sikre at alle komponenter er i løsning. Hvis hvite flak er til stede, inkuber i røret for ytterligere 5-10 minutter og vortex nytt. Transkripsjons reaksjoner kan mislykkes eller har dårlig avkastning hvis transkripsjon buffer ikke er helt oppløst og godt blandet.
- Bland bestanddelene og inkuber hver reaksjon ved 37 ° C i 2 timer i et vannbad.
- Fjern reaksjonen tuvære (e) fra vannbad, og ødelegge DNA-templat i hver prøve ved å tilsette 5 ul av 10 x DNase I-buffer, 2 pl av DNase I-enzymet, og 23 pl av molekylær klasse destillert vann for å bringe det totale volumet til 50 ul, og deretter inkuberes hvert rør ved 37 ° C i 20 minutter i et vannbad.
- Utføre en etanolutfelling i hvert mikrosentrifugerør ved tilsetning av 5 ul av 3 M natriumacetat, pH 5,2 og 110 pl iskald 100% etanol, fulgt av 1 pl glykogen lager for å lette RNA pelleten visualisering i etterfølgende trinn, og deretter inkuber rør ved -20 ° C i minst 1 time eller over natten.
- Sentrifuger hver mikrosentrifugerør ved maksimal hastighet 4 ° C i 20 min, og deretter fjerne 100% etanol supernatant og erstatt med 100 ul av 70% iskald etanol.
- Sentrifuger hver mikrosentrifuge tube ved 4 ° C i 5 minutter, deretter fjerne 70% etanol supernatant og lufttørker pellet for 5 min, så til slutt legge til 100 mL av molecular klasse destillert vann til resuspender pelleten og kvantifisere riboprobe lager konsentrasjonen ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer. Merk: Når pelleten har gått i oppløsning, bør riboprobe lager holdes på is og lagret ved -20 ° C.
- For å forberede de faste embryoer for prehybridization prosessen, fjerne fire% PFA/1x PBS fra hver prøve og vaske embryoene to ganger med 1x PBST.
- Overfør mellom 25-40 embryoer i 1x PBST inn i hver enkelt flat bunn mikrosentrifuge tube. Merk: Overbefolkning av befruktede egg vil føre til ujevn flekker senere, og forsiktighet bør tas for å begrense størrelsen på utvalget i hvert rør til ca 40 embryoer.
- Sett på 1x PBST i hvert rør med 500-1000 mL av HYB +.
- Plasser røret (r) av embryo i en ovn innstilt på 70 ° C, og inkubere dem ved denne temperatur i 4 timer for å utføre prehybridization.
- Forbered riboprobe / HYB + løsning ved å legge 100-500 ng av riboprobe (digoxygenin og / eller fluorescerendeein-merket) til 500 ul av frisk HYB + og deretter inkubere denne oppløsning ved 70 ° C i minst 20 min før trinn 3,11 til prewarm den. Merk: For å påvise flere gentranskriptene, ved hjelp av enkelt-og / eller dobbelt kolorimetriske merking, hvor hver av de riboprobes som svarer til disse genene må bli kombinert inn i en riboprobe / HYB + cocktail.
- Fjern prehybridization HYB + fra hver tube av embryoer og erstatte med tilstrekkelig riboprobe / HYB + å dekke embryoer. Merk: Vanligvis er nødvendig for å dekke embryoer i en flat bunn mikrosentrifuge tube 200-250 mL av riboprobe / HYB +. Riboprobe / HYB + tillegg og fjerning er vanligvis utføres ved hjelp av en pipette og barriere tips for å hindre krysskontaminering mellom prøvene.
- Inkuber embryoene ved 70 ° C over natten med ribroprobe / HYB +.
- Forbered følgende sett av vaskeløsninger og pre-varme dem over natten ved 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT, og 0.2x SSCT. Merk: Det er praktisk å forberede 50 ml aliquots av hver vaske-løsning, fordi det overskytende kan lagres ved romtemperatur, og deretter varmes opp for senere bruk.
- Fjern riboprobe / HYB + Bruk en pipette og barriere tips og oppbevar ved -20 ° C. Merk: Vanligvis hver riboprobe / HYB + blandingen kan brukes flere ganger (for eksempel tre eller flere) uten reduksjon av signal. Mens gjenbrukt riboprobe / HYB + er assosiert med lavere bakgrunn, men husk at gjenbrukt riboprobe blandinger kan være gjenstand for degradering.
- Vask embryoene to ganger med 50% formamide/2x SSCT for 30 minutter ved 70 ° C.
- Vask de embryoer en gang med 2 x SSCT i 15 min ved 70 ° C.
- Vask embryoene to ganger med 0,2 x SSCT i 30 min ved 70 ° C.
- Fjern 0.2x SSCT og vaske embryoene to ganger med MABT ved romtemperatur.
4. Anti-digoxygenin Antistoff Inkubasjon og Detection
- Forbered frisk blokk løsning.
- Fjern MABT og erstatte med blokk løsningsjon.
- Inkuber embryoene i blokk-løsning for 2-4 timer ved romtemperatur. Merk: Lengre blokk inkubasjoner gi optimale resultater med små sebrafisk embryo stadier (<15 somites). For å gjøre den omstendelige blokk er utført, gjør blokken inkubasjon i 8-12 timer ved romtemperatur, eller en kombinasjon av romtemperatur plus (opp til ~ 8 timer) en etterfølgende 4 ° C inkubasjon over natten.
- Forbered anti-digoxygenin antistoff løsning ved å gjøre en 5000 fold fortynning i frisk blokk løsning (f.eks, en mL per 5 ml av blokk).
- Fjern blokken og tilsett antistoff / blokk løsning.
- Dekk til prøven i folie og inkuber over natten ved 4 ° C eller i 4 timer ved romtemperatur.
- Fjern anti-digoxygenin/block og vaske embryoene minst 10 ganger med MABT. Merk: Overfør embryoene til 12-brønns retter for MABT vasker. Dette øker hastigheten som embryoene kan vaskes, noe som er nyttig ved behandling av store prøvemengder, ennd gjør det enkelt å overvåke fremdriften av fargningsreaksjon (Step 4.11) under et stereomikroskop. Merk: På dette trinnet embryoer kan være "super-vasket 'ved å inkubere dem over natten i MABT ved 4 ° C før du går videre til trinn 4.8, som er en nyttig behandling for sonder som har en tendens til å gi høy bakgrunn eller flekker som krever langvarig overvåking under jobbe dag.
- Klargjør pre-farging buffer og den ønskede farging løsning (lilla eller rødt substrat).
- Fjern MABT og vaske embryoene i pre-farging buffer i 5 min ved romtemperatur.
- Fjern det pre-farging buffer og tilsett fargingsoppløsning.
- Overvåke fremdriften av romtemperaturen fargningsreaksjon hver 15-30 min ved å sjekke utseendet av embryoene under et stereomikroskop. Merk: Frekvensen av fargingsreaksjonen kan bli bremset ned ved å overføre prøvene til 4 ° C, dersom det er nødvendig for å gi mer tid for fullføring av flekken. Når kjølt til 4° C, men reaksjonen kan bli akselerert ved oppvarming til romtemperatur.
- Når farging reaksjonen er fullført, fjerner du flekker løsning og erstatte med 1x PBST.
- Vask to ganger med 1x PBST for 5 min. Merk: Hvis ikke oppdage andre gener med et annet underlag, så fastsette prøvene i iskald 4% PFA/1x PBS i minst 20 min, og gå videre til trinn 6.1. Ellers går du videre til trinn 5.1.
5. Anti-fluorescein Antistoff Inkubasjon og Detection
- Fjern 1x PBST og vaske embryoene to ganger med 0,1 M glycin, pH 2.2 i 15 minutter hver ved romtemperatur. Merk: Tid for glycin-vaskinger er nødvendig for å fullstendig deaktivere den første fargingsreaksjonen.
- Fjern 0,1 M glycin og vaske embryoene to ganger med MABT i 5 min ved romtemperatur.
- Klargjør anti-fluorescein-antistoffet løsning ved å lage en 5000 gangers fortynning i frisk blokk-løsning (f. eks, 1 ul pr 5 ml av blokk).
- Fjern MABT og legge antistoffet / blokk løsning. Følg trinn 04.06 til 04.13 for å utføre påvisning av fluoresceinmerket ribroprobe. Merk: Når den endelige farvereaksjon er fullført, er det viktig at den siste fiksering av prøven utføres i iskald 4% PFA/1X PBS. Festes med varmere PFA-løsninger har en tendens til å bli assosiert med klebrig eggeplomme som er vanskelig å fjerne fra embryo under disseksjon og deyolking for flat mount prosedyren.
6. Embryo Dissection og Initial Deyolking av Embryo
- Velg en fast, farget embryo for flat montering.
- Bruk en overføringspipetten å plassere den valgte embryo prøven i en plast eller glass petriskål inneholder 1x PBST.
- Sett fatet under et stereomikroskop, og rull embryoet ved hjelp av et par av fin pinsett eller vippe verktøyet, slik at et sideriss oppnås og den fremre og bakre ender er visualisert.
- Bruk ett par fine tang å gjøre et snitt i the plomme ved en posisjon som ligger sentralt mellom hodet og halen av embryoet, og i mellomtiden å bruke et andre par av fine pinsetter for å holde embryoet for således å tilveie utnytte for eggeplomme innsnitt. Merk: Du kan også lage to store snitt i eggeplomme, ett tett inntil hodet og den andre nær halen av embryo.
- Bruk fin pinsett og / eller en snert verktøy til å skyfle ut plommen fra plomme celle hulrom.
- Skyll embryoet forsiktig med 1x PBST å fjerne bortkommen eggeplomme.
7. Fin Deyolking av Embryo
- Overfør embryo til en flat glass lysbilde med 1-2 dråper 1x PBST.
- Bruk en vippe verktøy og fin pinsett til forsiktig plassere embryo med ventral (eggeplomme) siden opp på glass-slide.
- Dra embryo til kanten av 1x PBST løsning ved hjelp vippe verktøyet slik at embryoet er fortsatt i en flat posisjon mot glasset lysbilde.
- Skrap det ventral overflaten av embryoet varsomt med snert tilol for å fjerne eggeplomme granulater uten ripping embryo. Samtidig bruke et par fine tang å forankre embryoet mens skraping med pisken verktøyet. Merk: Fjerning av plomme granulater kan kreve repeterende skraping for 5-10 min.
- Hvis PBST løsningen blir rotete med overflødig plomme eller begynner å fordampe, legg 1-2 friske dråper 1x PBST til raset ved hjelp av en plast eller glass overføring pipette, og dra deretter embryo til området med ren løsning for videre plomme granule fjerning.
- Når eggeplomme er tilfredsstillende fjernet, bruker en overførings pipette til forsiktig bevege embryoet tilbake inn i en plast-eller glasspetriskål inneholdende 1 x PBST for en sluttskylling for å fjerne spredt plomme granulat.
- Overfør deyolked embryoet ved hjelp av en plast-eller glassoverførings pipette inn i en plast-eller glasspetriskål inneholdende 100% glyserol.
- Inkuber embryo i 100% glyserol for ~ 5 min å akklimatisere embryoet.
8. Montering på en glass-slide
- Overfør deyolked embryo til et rent glass lysbilde i 1-2 dråper 100% glyserol.
- Plasser embryo med ventral (eggeplomme) mot glass-slide.
- Ved hjelp av en snert verktøyet til å dra embryo til kanten av glyserol dråpe slik at embryoet er fortsatt i en flat posisjon mot glasset lysbilde. Hvis den embryonale akse er buet, bruke fin pinsett til forsiktig foreta meget små snitt i det gjenværende plomme cellemembranen for å avlaste spenninger, slik at fosteret kan plasseres flatt på lysbildet med en rett akse.
- Plasser små divots av modelleire på de fire hjørnene av en 18 x 18 mm glass dekkglass. Merk: Som et alternativ, kan små dråper av vakuumfett 15 være substituert for modellering leire.
- Plasser glass dekkglass sakte på embryo, fiske dekkglass for å unngå luftluftbobler i glyserol rundt prøven.
- Til en ytterligere nedgang i 100% glyceroltil siden av glass dekkglass for å fylle rommet mellom dekkglass og objektglass.
- Trykk sakte og forsiktig ned på de fire hjørnene av dekkglass til fast stilling embryoet mellom glasset og eliminere drivende. Merk: Vær forsiktig med å knuse embryo.
- Hvis fosteret ikke er plassert som ønsket, bruker fin pinsett til å fjerne dekkglass. Bruk vippe verktøy for å reposisjonere embryo og / eller fin pinsett for å foreta ytterligere snitt slik at embryoet kan omplasseres. Gjenta trinn 08.04 til 08.07.
- Observere og / eller bilde prøven ved hjelp av enten et stereo-eller sammensatte mikroskop.
- Oppbevar flat monterings preparatet flat med en pappglassholder i mørke ved 4 ° C i flere uker eller midlertidig ved romtemperatur. Merk: WISH flekken vil forsvinne gradvis over tid, spesielt røde underlaget reaksjoner, og kan ikke bli bevart i glyserol på ubestemt tid. Lilla flekker også falme lettere hvis de oppbevares i glyserol i forhold tilPFA (se trinn 8.11). Interessant nok har det blitt publisert som montering embryoene i permount snarere enn glyserol kan aktivere ubestemt lagring ved romtemperatur 15.
- For langtidslagring av lilla substrat farget prøvene, fjerne glass dekkglass og skyll embryoet skylles to ganger i 1x PBST, deretter overføre til en mikrosentrifuge tube med 4% PFA/1x PBS for langtidslagring. Merk: Alternativt kan embryoer i 1x PBST bli behandlet for ytterligere analyser, for eksempel DNA-isolering for genotyping.
Representative Results
Den flate monterings protokoll prosedyren involverer transformasjon av sebrafisk embryo fra sin normale anatomi, der kroppen aksen er viklet rundt et sentralt plassert plomme erte inn i en to-dimensjonal preparat (figur 1A). Hele monterings avbildning av den unge sebrafisk embryo er begrenset av naturen av hvordan den embryonale akse er viklet rundt eggeplommen. Som et resultat av sideveis eller dorsale utsikt over hele montere farget embryo prøver som bare kan ta en del av aksen eller skjule visse vev (figur 1B). Til sammenligning deyolking og utflating av embryoet muliggjør hele embryonale akse for å bli visualisert på en gang (figur 1B). Disse begrensningene er demonstrert ved å undersøke en WISH farget embryo som var merket med antisens riboprobes å oppdage irx3b (lilla), som markerer en undergruppe av de nyrestamfedre som ligger i tilknytning til somites 7 til 13, og myod1 (rød) som etikettersomites (Figur 1b). Feltet av irx3b + renale stamceller er skjult i hele montere sideriss fordi irx3b transkripter er rikelig i sentralnerve-systemet, noe som gjør den renale feltet praktisk talt umulig å visualisere med den laterale kameravinkel; videre, er innen irx3b + renale progenitorer bare delvis synlig når embryoet blir rotert i en dorsal kamerabilde fordi feltet er pakket rundt plomme (figur 1B). Imidlertid muliggjør den hele feltet av irx3b + renale progenitorer som skal analyseres på en enkel måte i forhold til de somites langs stammen og andre embryonale strukturer (figur 1 B) en dorsal visning av det samme embryo følgende flat montering. Således kan forseggjort romlige domener være ideelt dokumentert med denne metoden.
Flere store trinn er involvert i en vellykket gjennomføring av den flate mount prosedyren. For å utføre denne technique må plomme ballen legges først løsnes fra embryo korrekt (fig. 2A), som kan utføres med gode instrumenter slik som et par av fin pinsett mens embryoet blir visualisert ved hjelp av et stereomikroskop. Etter fjerning av det rå eggeplomme ball, er et fint lash verktøy benyttes til å skrape bort plomme granulater som har forblitt festet til embryoet (figur 2B). Fjerning av gjenværende plomme granulat bidrar til å lette visualiseringen av de embryoniske vev. Endelig er den deyolked embryo manipulert for å plassere den stabilt på en glass-slide (figur 2C), som muliggjør observasjon og hjelpemidler dokumentasjon av prøven ved hjelp av bildebehandling, og et kamera festet til mikroskopet. Snert verktøy er hjemmelagde enheter som kan konstrueres ved å sette et passende snert til en pipette spissen bruker superlim, som kan monteres på et håndtak hvis ønskelig (figur 3A, Materialer tabellen). Ulike snert prøver kan være anskaffet for å produserepiske verktøy med litt forskjellige egenskaper når det gjelder lengde og taper (Figur 3B), der hver bruker kan ha ulike strømningene for når de begynner å eksperimentere med flat mount prosedyren. Eksempler på lash prøvene omfatter naturligvis kaste menneskelige øyevipper, naturligvis felle dyret stritt hår eller værhår, og endelig syntetiske varianter av kommersielt tilgjengelige vippene funnet i detaljhandel kosmetiske avdelinger.
Området som omgir og inneholder prøven (e) som er plassert på en glass-slide (figur 4A) kan avbildes for høy oppløsning analyse. En kombinasjon av prober ble brukt til å merke utviklingsnyrestamfedre som gir opphav til nyrene hos villtype embryo på tidlige utviklingsstadier med to-farge WISH, og deretter flate montere forberedelser ble utført for å se prøvene (Figur 4B, 4C ). Under de tidlige somitt stadier, er nyre progenitors avgrenset i en U-formet mønster av their uttrykk for pax2a transkripsjoner (lilla) rundt paraksiale mesoderm som samtidig uttrykker delta C (DLC) (red) (venstre kolonne, figur 4B) 6,7. Til sammenligning, når dlc-transkripter ble detektert med en lilla substrat, og ble merket i kombinasjon med hindbrain markør krox20 (rød), ble en rostral subdomene av renale progenitorer visualisert som uttrykker dlc (høyre kolonne, figur 4B), som nevnt tidligere 6,7. Flat Mount preparater kan brukes på samme måte for å studere senere somitogenesen etapper. På 14 somitt scenen, analyserte vi uttrykk for nyre markører pax2a, slc4a4, og slc12a3 (lilla) sammen med smyhc1 (rød), som markerer de somites (Figur 4C). Disse kombinasjonene muliggjøre kartlegging av hele renal progenitor domene med pax2a, mens avsløre at et undersett av celler i en rostral underdomene uttressed slc4a4a og ble preget av en ikke-overlappende haleunderdomene av nyrestamfedre som uttrykte slc12a3.
To-farge WISH og den flate montere forberedelse er også verdifull for studier av cellulære domener under organogenesen i sebrafisk med genetiske mutasjoner eller andre forstyrrelser fra miljøeksponering til små molekyler 6,7 (figur 5). Sebrafisk NLS og lib mutanter havn mutasjoner i aldehyd dehydrogenase 1A2 (aldh1a2, tidligere kjent som raldh2), som koder for et enzym som er nødvendig for biosyntesen av retinsyre (RA). RA er en forutsetning for en god utvikling av mange nyrecelletyper, inkludert dannelsen av podocyte celler som bidrar til å gjøre blodet filter av den embryoniske nyre, kjent som glomerulus 6,7. WISH ble utført for å merke podocyte progenitors med wt1a samtidig med avgrensning av than utvikler somites med smyhc1 og hindbrain med krox20 i villtype embryoer, NLS mutant embryoer, lib mutante embryoer og fostre behandlet med en ALDH enzym kjemisk hemmer, DEAB (figur 5). Embryoer med mangel aldh1a2 uttrykk viste redusert wt1a uttrykk i forhold til villtype embryo, mens DEAB-behandlede embryoer viste en oppheving av wt1a transkripsjoner (Figur 5, høyre kolonne). Samlet utgjør disse representative resultater viser hvordan den flate braketten teknikken kan brukes til å analysere og dokumentere anatomiske forskjeller med presisjon i tidlig embryo, og således iverksettes for verdifulle utviklingsstudier.
Figur 1. Oversikt over den flate montere forberedelserasjon for sebrafisk embryo. A) Fremgangsmåten ifølge flat montering muliggjør den samtidige visning av vev langs den embryonale akse, fordi den sentrale plommemassen er fjernet og embryoet stabilt plassert på en flat overflate. B) av en hel mount WISH farget embryo i side-og rygg synspunkter, og deretter ble gjennomført etter en flat monterings preparat. Embryoet var farget med antisens prober å oppdage gentranskriptene koder irx3b (lilla) og myod1 (rød).
Figur 2. Skjematisk av flat mount prosedyren for sebrafisk embryo. A) Fosteret er først grovt deyolked å fjerne mesteparten av plommemassen, deretter (B) ventral overflaten er fint deyolked å fjerne gjenværende plomme granulat, ogetter vask embryo er (C) montert med ryggsiden opp på en glass-slide for visuell analyse-og / eller fotografiske avbildning.
Figur 3. Fotografier av eksempel snert verktøy i forhold til fin pinsett. A) Hjemmelagde snert verktøy ble fotografert sammen med en standard par fine tang, plassert ved siden av en metrisk linjal for å gi en referanse. B) Forstørret visning av lash verktøy ved siden av de fine tang, med millimeter referanse gitt langs toppen av den oppfatning . To forskjellige snert verktøyene er vist, med stjerne (*) som brukes for å markere lash hentet fra en naturlig skur menneskelig øyevipper, og dobbel stjerne (**) som brukes til å markere en snert som ble hentet fra en naturlig skur feline værhår og trimmet til foreta en noe stump ende. I hver caSE, pisken ble tredd gjennom pipettespissen og festet med flere strøk med superlim for å gradvis skape en sterk forsegling å stabilisere / forankre pisken til pipetten festet til en enhet håndtering.
Figur 4. Karakterisering av de utviklingsmessige endringer i nyre stamfar feltet i villtype sebrafisk embryo. A) Skyv skjematisk angir området avbildes for analyse i (B, C). B) villtype embryoer på 1, 3 og 5 somitt fasen ble farget med to farger WISH for å vurdere sammensetningen av renal progenitor feltet som gir stige til den embryoniske nyre, eller pronephros. (Venstre kolonne) transkripsjoner som koder for transkripsjonsfaktor pax2a (farget i lilla) merke flere populasjoner i embryo, inkludert renal progenitor felt som framgår av den mellomliggende mesoderm. Transkripsjoner som koder for Notch ligand dlc markere somites som danner fra paraksiale mesoderm (farget i rødt). (Høyre kolonne) Når uttrykket av dlc transkripsjoner (farget i lilla) og hindbrain rhombomere markør krox20 (farget i rødt) er undersøkt i de samme embryoer, kan dlc uttrykk observeres i en rostral underdomene av de nyrestamfedre som ligger i tilknytning til somites 1-5, som var utydeliggjøres ved samtidig farging av dlc med pax2a. C) vill type embryoer på 14 somitt scenen var dobbel eller trippel-farget med en kombinasjon av en nyre markør (lilla), den somitt markør smyhc1 (rød) , og hindbrain rhombomere markør krox20 (også rød). (Toppanel) På dette stadiet, pax2a transkripsjoner fortsette å avgrense nyrestamfedre. (Middle, Nedre paneler) Innenfor nyre stamfar territorium, er en rostral underdomene merketetter slc4a4 og karakterutskrifter som koder slc12a3 markere et haleunderdomene.
Figur 5. Bruken av flate montert forberedelser for å karakterisere fenotyper forårsaket av genetiske mutasjoner eller kjemiske genetiske forstyrrelser som modulerer retinsyre biosyntesen. Den WISH uttrykk mønster på 15 somitt stadium av wt1a (lilla) og smyhc1/krox20 (rød) ble sammenlignet mellom vill typer og embryoer med mangler i retinsyre (RA) produksjon på grunn av mangler i aldehyd dehydrogenase 1A2 (NLS og lib mutasjoner) eller kjemisk hemming av retinaldehyde dehydrogenase aktivitet med diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Reduksjonen av RA produksjon i lib er litt mer sterk enn NLS, f.eksat lib embryoer uttrykke noe redusert farging av wt1a transkripsjoner enn tilsvar iscenesatt NLS mutant embryo, mens DEAB behandling av ville typer er assosiert med fullstendig oppheving av wt1a uttrykk.
Discussion
Sebrafisk har vist seg å være en svært verdifull modellorganisme i forskningsmiljø i løpet av de siste årene. Sebrafisk oppviser en vesentlig grad av genetisk konservering med den av høyere virveldyr, og fordeler knyttet til deres anatomi, avl, og livssyklus foreta denne arten meget mottagelig for eksperimentelle analyser. Videre har fremme av molekylære teknikker som gjelder for sebrafisk videre fremmet bruken av denne modellorganisme i vitenskapelig forskning. For eksempel har et stort utvalg av transgene sebrafisk linjer blitt generert for å studere sykdomsutvikling og for å svare på mange grunnleggende spørsmål som ligger bak de viktigste mekanismene for utvikling inkludert organogenesen.
Følgelig, basert på den dynamiske bruk av sebrafisk både sykdom og utviklingsforskning, cellemerking metoder og mengdesignalet er en viktig del av data-analyser. Mens metoder som ansetter fluorescerende entibodies kan brukes for å påvise protein ekspresjon i transgene sebrafisk, forskere typisk avhengige av standard prosedyrer som WISH 12-16 for å undersøke den tid og rom lokalisering av gentranskriptene i en fast, ikke-transgene sebrafisk prøven. Faktisk er WISH en av de mest brukte metoder innen biologi 16, og er et viktig verktøy som brukes til å karakterisere fenotypen av genetiske mutasjoner og kjemiske genetiske forstyrrelser. Likevel er WISH forbundet med en rekke potensielle fallgruver og utfordringer. For å bekrefte spesifisiteten til antisense ribroprobe kan sense riboprobes bli brukt som en kontroll for å vurdere spesifisiteten av antisense riboprobe fargingsmønstre. Mens delene 4 og 5 er presentert i størrelsesorden merking og deteksjon av en digoxygenin-merkede probe, etterfulgt av fluorescein-merket probe, kan denne rekkefølgen reverseres. Vanligvis blir svakere signaler (gener med lavere uttrykk nivåer) oppdages best med digoxygenin-merket prober og denne flekkenutviklet først med en fiolett substrat, etterfulgt av deteksjon og farging av sterkere signal (mer rikelig uttrykt gen) ved hjelp av røde substratet. Imidlertid, hvis to-farge-reaksjoner skal utføres, er det anbefalt at forskjellige kombinasjoner av etiketter og substrater blir testet for å finne en fremgangsmåte som er mest egnet for datainnsamling og analyse. I tillegg, de gangene gitt for å blokkere, antistoff inkubasjon og vasking følger av § § 4-5 er skreddersydd for embryoer yngre enn 24 timers innlegg befruktning; lange intervaller på de samme trinnene med voksne embryo kan føre til salt akkumulering på prøven. Omfattende tips for feilsøking standard sebrafisk embryo WISH har allerede blitt dokumentert i litteraturen 12-16. Uten tvil den mest vanlige dilemma er høy bakgrunn. Vi anbefaler å øke antall MABT vasker i Step 4,7 til 15-20 vasker hvis det er nødvendig, selv om det i vår erfaring tillegg av natten MABT 'super-wash'gir fremragende resultater når det brukes sammen med 10 eller flere korte MABT vasker før du fortsetter til trinn 4.8. Et annet eksempel dilemma er dårlig sonde infiltrasjon, noe som kan forekomme med lange riboprobes. Shearing den riboprobe følgende trinn 3.6 gjennom alkalisk hydrolyse kan motvirke dette. I vår erfaring med små prøver, er sonde klipping vanligvis ikke nødvendig. Imidlertid bør man huske på at parametere som dette kan være medvirkende faktorer i utfallet av en WISH eksperiment, og vi foreslår undersøkelse av disse nyttige feilsøkingsinstruksjonene allerede er offentlig tilgjengelige i samfunnet som nødvendig for å avgrense de eksperimentelle parametre for WISH i din egen forskning 12.
I tillegg til tradisjonelle WISH teknikker 12-16, har det vært en kontinuerlig veksten av fremskritt i WISH metoder og alternative protokoller som er formulert. Disse omfatter nye måter for signaldeteksjon, for eksempel ved bruk av elektronisk fCence 17-19, til metoder som gjør det mulig lokalisering av microRNAs 20. Likevel, til tross for de mange forbedringer som er gjort til gjeldende celle merking metoder, er effektiviteten av disse prosedyrene opphevet hvis flekken (e) ikke kan være lett visualiseres i utvalget av interesse på et ønsket tidspunkt. Denne begrensningen er problematisk for forskere, spesielt når det gjelder de tidlige embryonale stadier av sebrafisk ontogeni, noe som potensielt kan føre til hull i vår forståelse av ulike utviklingsprosesser som oppstår på disse tider. Under normal sebrafisk utvikling, vil plommesekken gradvis avta i størrelse som de embryo alderen 11. Derfor, på disse senere utviklingsstadier (> 24 timer etter befruktning), er WISH flekker ganske grei å analysere fordi fosteret er større i forhold til dens tilstøtende plommesekken. Dette er imidlertid ikke tilfelle fra halen knopp scenen til tidlig somitogenesen (når den embryonalemassen er plassert rundt eggeplomme), hvor det opake plommesekken kan noen ganger tilsløre visualisering av flekken. Følgelig ble fremgangsmåten i flat montering utviklet for å lindre de bilde-og dataanalyse problemer forbundet med karakterisering av sebrafisk tidlige embryo prøver (skjematiserte i figur 1 og figur 2), og har vært mye brukt, siden den systema phenotyping av genetiske mutasjoner isolerte fra de første storskala genetiske skjermer 21.
Siden advent av flat montering teknikk, har analysen av tidlige utviklingsstadier blitt betydelig forbedret. Når eggeplomme fjernet fra embryo, er det mulig å legge embryoet flatt på en glass-slide i den ønskede orientering for avbildning. Denne to-dimensjonal posisjon muliggjør visning av hele embryo på en gang, noe som eliminerer behovet for å rotere prøven. Tallrike vev befinner seg i vide områder av embryoet, som f.eksforløpere som danner blod og nyre. Videre kan man trenger for å sammenligne flere forskjellige utviklings vev på én gang. Flat montering gjør det mulig for forskeren å samtidig se hele domenet av slike cellegrupper, og dermed i stor grad kan hjelpe quantifications eksempel retningsmåling for et vev eller celletall. Denne teknikken har til slutt hjulpet føre til mange oppdagelser vedrørende en rekke viktige utviklings mekanismene bak hematopoiesen, neurogenesis, og organogenesen. Dermed, når mestret, programmer for denne enkle teknikken for forskerne er ganske betydelig.
For eksempel, i en studie undersøke avstamning valg under hematopoiesis, flat montere preparater av sebrafisk embryo på 14 og 18 somitt stadier (SS) ble brukt til å illustrere de endringene som skjedde i uttrykket mønster av pu.1 sink finger transkripsjonsfaktor mellom villtype og gata1 morpholino injisert embryoer 22.Denne metode muliggjorde påvisning av et ekspandert pu.1 domene ved 18 ss, noe som indikerer at gata1 er sannsynligvis å regulere ekspresjonen av pu.1 i den mellomliggende celle-masse (ICM) rundt dette tidspunkt. Ekstra flat montert embryoer farget for ulike erythroide gener inkludert gtpbp1 og epsin demonstrert et tap i uttrykket av disse genene i VLT mutanter som var gata1 - / -. Videre analyser viste ingen endring i uttrykket av erythoid gener som biklf og testhymin som var kjent for å være uavhengig av gata aktivitet. Derfor, i forbindelse med sitt andre eksperimentelle resultater, ble det avslørt at gata1 er viktig i regulering av differensiering av celler i myelo-erythroid avstamning. I en studie av neural crest utvikling, ble flate mounts brukes til å undersøke crestin uttrykk i mont blanc (mob M610) mutanter i en studieundersøke rollene til Mont Blanc og tfap2a gen-funksjon 23. På 10 og 20 ss, ble crestin uttrykk helt avskaffet i hodet og ble redusert i bagasjerommet regionen mob M610 mutanter i forhold til den normale vill-type uttrykk, slutt å hjelpe denne gruppen til å konkludere om betydningen av Mont Blanc og tfap2a regulering under neural crest formasjon. I tillegg, i form av organogenesen, har flate mounts aktivert oppdagelsen av tilstedeværelsen av forskjellige domener i tidlig nyre stamfar feltet under utviklingen av sebrafisk embryonale nyre, kjent som pronephros. Sebrafisk embryo gir en konservert og likevel anatomisk grei system for å studere hvordan nyrestamfedre gi opphav til nevronet funksjonelle enheter som utgjør de pronephros, en prosess som kalles nephrogenesis 6,7 (figur 4). Flat montere analysen har vært nyttig for dokument domener av renale stamceller og å dissekere utfallet av endringer i RA signale under pronephros mønstring 6,7 (figur 5), som tidligere var ukjent. Samlet utgjør disse eksemplene tyder på at det er faktisk mange brede programmer for denne flate montere protokollen i studiet av ulike prosesser som oppstår under normal utvikling og syke tilstander.
Konseptuelt er denne flate mount prosedyren ganske enkel samlet. Imidlertid kan de manipulasjoner og grad av finesse som kreves for å mestre denne metoden være ganske utfordrende å mestre i fravær av visuell demonstrasjon. Derfor ble denne protokollen utarbeidet for å muliggjøre forskere, spesielt de som er nye til sebrafisk-modellen, med mulighet til å bedre forstå hvordan du utfører denne teknikken og dele våre råd på reagenser som kan optimalisere vev håndtering. Vi håper at denne protokollen til slutt vil tillate andre i samfunnet til å avgrense de mest ideelle prøve forhold til å være used for premium bildebehandling, dataanalyse, og formidling av sine resultater i publikasjoner. Ideelt sett skal dette at forskere til å overvinne de anatomiske hindringer i zebrafisk embryogenese under tidlig, noe som kan formørke fremstilling av eksperimentelle resultater, og løse disse ved hjelp av denne enkle, men signifikant teknikk.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av midler til RAW fra hver av følgende: NIH tilskudd K01 DK083512, DP2 OD008470, og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tilskudd prisen # 5-FY12-75; starte opp midler fra University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. Vi ønsker spesielt å takke Elizabeth og Michael Gallagher, sammen med hele Gallagher Family, som formidles en sjenerøs gave til Universitetet i Notre Dame for å fremme stamcelleforskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker staber av Department of Biological Sciences for deres støtte, og Center for sebrafisk Forskning ved Notre Dame for sin enestående engasjement i omsorg og velferd for våre sebrafisk koloni. Til slutt, vi takker medlemmene av vår forskningslaboratorium for sine kommentarer, diskusjoner og innsikt om dette arbeidet, somvel som Marigold (Maripooka) og Zinnia Wingert for å gi naturlig kaste feline værhår for å gjøre mest fremragende snert verktøy for vår forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
- Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
- Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
- Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
- Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
- Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
- Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).
