Summary
Zebrafisk embryo er en fremragende model for udviklingsmæssige biologi forskning. Under embryogenese, zebrafisk udvikler sig med en æggeblomme masse, som præsenterer tre-dimensionelle udfordringer for prøve observation og analyse. Denne protokol beskriver, hvordan man opretter todimensionale flade mount præparater af hele mount in situ (ønske) farvet zebrafisk embryo prøver.
Abstract
Zebrafisk embryo er nu almindeligt anvendt til grundlæggende og biomedicinsk forskning for at undersøge den genetiske styring af udviklingsprocesser og at modellere medfødte misdannelser. Under den første dag i livet, zebrafisk embryo skrider frem gennem mange udviklingsstadier, herunder gødskning, spaltning, gastrulation, segmentering og organogenese af strukturer såsom nyrer, hjerte, og det centrale nervesystem. Anatomi af en ung zebrafisk foster præsenterer flere udfordringer for visualisering og analyse af de involverede i mange af disse begivenheder væv, fordi fosteret udvikler sig i forbindelse med en rund æggeblomme masse. Således til nøjagtig analyse og billeddannelse af eksperimentelle fænotyper i faste embryonale prøver mellem tailbud og 20 somite etape (10 og 19 timer efter befrugtning (HPF), henholdsvis), som dem farvet ved anvendelse af hele mount in situ-hybridisering (WISH), er det ofte er ønskeligt at fjerne det embryon blommen balle og for at placere den fladt på et objektglas. Dog kan udføre en flad mount procedure være trættende. Derfor er vellykket og effektiv flad mount forberedelse lettes i høj grad gennem den visuelle demonstration af dissektion teknik, og også hjulpet ved anvendelse af reagenser, der bistår i optimal væv håndtering. Her giver vi vores ønske protokol for en eller to-farvet påvisning af genekspression i zebrafisk embryo, og vise, hvordan den flade montering procedure kan udføres på dette eksempel på en farvede faste eksemplar. Denne flad montering protokol er bredt anvendelig til studiet af mange embryonale strukturer, der opstår i den tidlige zebrafisk udvikling, og kan gennemføres i samarbejde med andre farvningsmetoder udføres på embryo prøver fast.
Introduction
Zebrafisk, Danio rerio, er blevet en udbredt organisme i studiet af udviklingsmæssige biologi. Zebrafisk er en tropisk, arter ferskvand hvirveldyr, der tilhører familien Cyprinidae. Zebrafisk blev oprindeligt brugt til miljøforskning for at få oplysninger om de farer af potentielle forurenende stoffer i vandet, som de var let opnåelige, billig og nem at vedligeholde 1. I de sidste tredive år har zebrafisk blevet anerkendt som en genetisk medgørlig hvirveldyr model system til et væld af årsager. Zebrafisk viser et højt niveau af anatomiske og fysiologiske bevaring med højere hvirveldyr, herunder pattedyr 2,3. Nylig genomsekvens annotation har vist, at cirka 70% af humane gener har mindst én zebrafisk modstykke 4. For eksempel har mange ortologe gener, som spiller en vigtig rolle under nyre udvikling blevet identificeret mellem disse arter 5-7. Denne dramatic bevaringsgrad med hensyn til cellulær og molekylær biologi har gjort det muligt for forskerne at skabe modeller for en bred vifte af menneskelige sygdomme i zebrafisk 8 og zebrafisk er blevet et værdifuldt redskab til at identificere potentielle lægemiddelbehandlinger bruge kemiske genetiske skærme 9.
Desuden er ikke kun i stand til at rekapitulere en bred vifte af komplekse udviklingsprocesser og sygdomstilstande, der ses hos mennesker, men flere andre attributter også øge sin appel som en model organisme til embryologiske studier zebrafisk model. Zebrafisk er oviparous og reproducere gennem broadcast gydning, som giver forskere med nem adgang til de embryoner fra starten af gødskning 10. Andre fordele omfatter embryo størrelse, gennemsigtighed og hurtig, ekstern udvikling 10. Derudover zebrafisk voksne besidder høj frugtbarhed og producerer typisk relativt store kobling størrelser, der kan variere mellem 200-500pr uge, i sidste ende gør det muligt for forskere at udføre højt throughput eksperimenter, såsom fænotype baseret kemiske skærme, med lethed 9.
Alligevel, på trods af de mange fordele, der er udstillet af zebrafisk model, der er udfordringer, der vedrører analyse og kommunikation af de eksperimentelle resultater fra tidlige udviklingsstadier. I nogle tilfælde kan den iboende anatomi zebrafisk embryo tilsløre visualisering af en data. Efter befrugtningen, den første celle undergår flere spaltningshændelser som udviklingen skrider 11. Efter gastrulation, dukker den embryonale akse i tailbud etape (10 HPF), således at det er viklet rundt om blommen 11. Som efterfølgende udvikling skrider frem gennem segmentering periode, vil stammen vokse i masse og også forlænge ved aksial forlængelse, således at en hale sammen med en del af blommesækken selv strækker sig ud fra den centrale æggeblomme masse11.. Mellem tailbud og 20 somite etape (19 HPF), der forsøger at observere specifikke udviklingsmæssige funktioner efter udnyttelsen af forskellige farvningsprotokoller, såsom ønsker, kan være en udfordring både at visualisere og fotografere på grund af geometrien af embryoet og uigennemsigtighed blommesækken. En måde at eliminere disse udfordringer er at fjerne blommen og derefter flade embryonet ind i en to-dimensionel prøve, der kan analyseres på en mere enkel måde.
Følgende protokol og video ressourcer giver en guide til, hvordan man med succes deyolk og flad montere et foster efter fiksering og farvning, i eksemplet med en eller to-farvet WISH farvning. Ønske er en udbredt teknik, der muliggør påvisning af specifikke nukleinsyrer i bevarede eksemplarer, og dermed giver mulighed for site (s) af genekspression at blive opdaget inden for væv. WISH-teknikker er blevet grundigt beskrevet, og kan udføres med forskellige farve-substrater samt influenzaorescent detektionssystemer 12-20. Her giver vi vores ændrede WISH protokol, der bruges til zebrafisk embryoner mellem tailbud og segmentering udviklingstrin. Alternative WISH protokoller, er imidlertid forenelige med den flade mount her beskrevne procedure, som nævnt i starten af protokollen nedenfor. Desuden kunne flad montering anvendes i forbindelse med ethvert antal eksisterende visualiseringsteknikker, såsom hele mount immunhistokemi eller celle afstamning sporingsetiketter, som ikke er beskrevet i denne protokol. Samlet set kan teknikken med flad montering bedre muliggøre overlegen analyse og præsentation af resultater fra forsøg med de tidligste stadier af fosterudviklingen i zebrafisk.
Protocol
Procedurerne for at arbejde med zebrafisk embryoner beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Notre Dame. Bemærk: De er beskrevet i del 1-5 procedurer blev anvendt til at generere embryo billeder leveret her i de repræsentative resultater. De er beskrevet i del 1-5 procedurer kunne erstattes som ønsket med alternative WISH procedurer 12-16 eller andre visualiseringsteknikker såsom immunhistokemisk mærkning af specifikke proteiner ved hjælp af specifikke antistoffer. Ved udførelsen af flade mounts på WISH zebrafisk embryoner med protokollen beskrevet i del 1-5, den første embryo fiksering og endelige farvning fikseringen trin er de store manipulationer, der påvirker evnen til at fjerne æggeblomme granulat fra prøven til flade montering. De bedste flad montering resultater opnås, når den indledende fiksering udføres med frisk optøet iskold 4% paraformaldehyd (PFA) / 1x PBS og fiksering afdet sidste ønske farvning reaktion med iskold 4% PFA/1x PBS (som ikke behøver at være frisk optøet), og det tilrådes, at læserne til at overveje dette, når erstatte af alternative farvningsmetoder i kombination med del 6-8.
1.. Embryonindsamlingsteam, fiksering og opbevaring
- Forbered parring bure ved at placere voksne zebrafisk mandlige (r) og kvindelige (r) i kamre systemets vand, så de er adskilt af en skillevæg natten over.
- Fjern skillevægge mellem voksne og indsamle de befrugtede æg med en fin trådnet tesi indenfor ~ 15-30 min for parring at samle koblinger, der har tilsvarende fosterstadiet.
- Vend sien på hovedet og skyl overfladen med en fin strøm af E3 dispenseres fra en sprøjteflaske til at overføre embryoner i inkubations skåle indeholdende cirka 25 ml E3 løsning.
- Efter indsamling kløerne, opdele dem i flere retter sådan at ca 50-60 embryoner inkuberesi hver skål af 25 ml E3 løsning. Bemærk: Overbelægning af embryoner kan føre til dramatiske udviklingsmæssige asynkron indenfor bør tages koblingen og forsigtighed for at undgå dette for at aktivere rettidig indsamling af den ønskede etape (r).
- Inkuber embryoner ved 28,5 ° C for at aktivere udviklingsmæssige vurdering efter zebrafisk standard iscenesættelse serie 11.
- Brug en plastik overførselspipetten til forsigtigt at placere det ønskede antal embryoner ved den valgte tidspunkterne, op til 20 somite etape (19 HPF), der i en flad bund mikrocentrifugerør. Bemærk: Pas på håndtering af unge fostre, da de er skrøbelige og kan nemt blive beskadiget ved at knuse eller aggressiv håndtering med overførselspipetter. Alternativt kan hætteglas anvendes til fiksering og behandling af embryoner. For alle efterfølgende protokol vasker plastik overførselspipetter kan udnyttes, med undtagelse af riboprobe tilføjelse og fjernelse (trin 3.11, 3.14).
- Udskift E3 med iskold 4% PFA/1x PBS, ogfastsætte embryoner i deres chorions i 4% PFA/1x PBS i 4 timer ved stuetemperatur eller ved 4 ° C natten over. Notat af forsigtighed: PFA er giftigt og PFA-løsninger skal håndteres på en kemisk hætte, mens iført egnede personlige værnemidler, herunder handsker og kittel. Desuden bør PFA pulver skal håndteres med ekstraordinære pleje, når de foretager stamopløsningen, som selv den granulerede PFA kan tendens til at sprede gennem statisk elektricitet. Typisk PFA fremstilles ved opvarmning af 1x PBS til en byld at opløse PFA pulver, og opløsningen opbevaredes i portioner ved -20 ° C. Hvis fine aflejringer er til stede i 4% PFA/1x PBS når opløsningen afkøles, filtreres sterilisere den afkølede opløsning, før der afmåles til fastfrysning opbevaring ved passage gennem et 0,45 um filter system. Kun frisklavet eller frisk optøet PFA bruges til denne første (dvs. primær) fiksering af embryoet.
- Fjern fix og vask embryoner to gange med 1x PBST, og derefter overføre tilen inkubation skålen.
- Se embryonerne under et stereomikroskop og bruge to par fine tænger til at fjerne chorions omgiver embryoer, således at et par anvendes til forsigtigt at udnytte foster, mens det andet par anvendes til at oprive chorion.
2.. Embryo Permeablization
- Overfør dechorionated embryoner tilbage i mikrocentrifugerør eller hætteglas, derefter skylles to gange med 1x PBST at fjerne eventuelle rester chorion snavs.
- Fjern 1x PBST og vaske embryoner to gange med 100% methanol (MeOH).
- Placer embryoner ved -20 ° C i mindst 20 minutter. Bemærk: Fostre kan opbevares ved -20 ° C i MeOH i et år eller mere. Methanol gør chorions klæbrig, derfor ikke gå videre til dette trin, medmindre chorions er blevet fjernet.
- Rehydrere embryoner ved at fjerne 100% MeOH og vask ved stuetemperatur i 5 min hver i 50% MeOH/1x PBST 30% MeOH/1x PBST, derefter to gange med 1x PBST. </ Li>
- Forbered en frisk proteinase K coboltarbejdsopløsning (5 ug / ml) ved tilsætning af 25 pi af frisk optøet proteinase K stamopløsning (10 mg / ml) til 50 ml 1x PBST.
- Fjern 1x PBST fra embryoner, derefter erstatte med proteinase K brugsopløsning og inkuber baseret på fosterstadiet: <= 5 somitter i 1 min; 10-12 somitter i 1,5 min; 15 somitter i 2 minutter og 20 somitter i 3 min.
- Fjern proteinase K brugsopløsning og vaske embryoerne to gange med 1x PBST.
- Fjern 1x PBST og erstatte med iskold 4% PFA/1x PBS i mindst 20 minutter ved stuetemperatur.
3.. Riboprobe Synthesis, Præhybridisering, hybridisering, og Probe Fjernelse
- Saml antisense riboprobe in vitro transcription reaktionen ved stuetemperatur i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, samtidig med at enzymer på is ved at kombinere en DNA-template indeholdende sekvens svarende til genet af interesse (enten 100-200 ng PCRprodukt eller 1,5 ug lineariseret DNA-plasmid, fremstillet som beskrevet 12,13), 2 pi digoxygenin eller fluoresceinmærket ribonucleotider, 2 pi af den passende RNA-polymerase (SP6, T3, T7, afhængigt af hvilken sekvens er inkorporeret i PCR-produktet eller til stede på DNA-plasmid), 2 pi 10x transkription puffer, 0,5 pi RNase inhibitor og bringe til et samlet volumen på 20 ul med molekylærbiologisk kvalitet destilleret vand (DNase, RNase gratis). Bemærk: 10x transskription buffer skal forvarmet ved at placere røret i et 37 ° C vandbad i 10-20 min, og omhvirvlet bagefter for at sikre, at alle komponenter er i opløsning. Hvis hvide flager er til stede, inkuberes røret for en anden 5-10 min og vortex igen. Transkriptionsreaktioner kan mislykkes eller har dårlige udbytter, hvis transskription bufferen ikke er helt opløst, og blandes grundigt.
- Bestanddelene blandes og inkuberes hver reaktion ved 37 ° C i 2 timer i et vandbad.
- Fjern reaktionsblandingen tuvære (r) fra vandbadet, og ødelægge DNA-templaten i hver prøve ved tilsætning af 5 pi 10x DNase I buffer, 2 pi DNase I enzym, og 23 pi af molekylærbiologisk kvalitet destilleret vand for at bringe det samlede rumfang til 50 pi, og inkubér derefter hvert rør ved 37 ° C i 20 min i et vandbad.
- Udfør en ethanoludfældning i hvert mikrocentrifugerør ved tilsætning af 5 pi af 3 M natriumacetat, pH 5,2 og 110 pi iskold 100% ethanol efterfulgt af 1 ml af glykogen lager for at lette RNA-pelleten visualisering i efterfølgende trin, og derefter inkuberes rør ved -20 ° C i mindst 1 time eller natten over.
- Centrifuger hvert mikrocentrifugerør ved maksimal hastighed 4 ° C i 20 min, og fjern derefter 100% ethanol supernatanten og erstatte med 100 ul 70% iskold ethanol.
- Centrifuger hvert mikrocentrifugerør ved 4 ° C i 5 min, og fjern derefter 70% ethanol supernatant og lufttørre pellet i 5 min, så endelig tilsættes 100 ul molecular kvalitet destilleret vand til pellet resuspenderes og kvantificere riboprobe lager koncentration ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer. Bemærk: Når pillen er gået i opløsning, bør riboprobe bestand holdes på is og opbevares ved -20 ° C.
- For at forberede de faste embryoner til præhybridiserings proces, fjerne de 4% PFA/1x PBS fra hver prøve og vaske embryoner to gange med 1x PBST.
- Overførsel mellem 25-40 embryoner i 1x PBST i hver enkelt flad bund mikrocentrifugerør. Bemærk: Overbelægning af embryoner vil føre til ujævn farvning senere, og der skal sørges for at begrænse antallet af stikprøver i hvert rør til cirka 40 fostre.
- Udskift 1x PBST i hvert rør med 500-1.000 pi HYB +.
- Placer røret (r) af embryoner i en ovn indstillet til 70 ° C og inkubere dem ved denne temperatur i 4 timer for at udføre præhybridisering.
- Forbered riboprobe / HYB + ved tilsætning af 100-500 ng riboprobe (digoxygenin og / eller fluorescerein-mærket) til 500 pi frisk HYB + og inkubér derefter denne opløsning ved 70 ° C i mindst 20 min før trin 3.11 til opvarmning af det. Bemærk: For at opdage flere gentranskripter, ved hjælp af enkelt-og / eller dobbelt kolorimetrisk mærkning, hver af riboprober svarer til disse gener skal kombineres til én riboprobe / HYB + cocktail.
- Fjern præhybridiserings HYB + fra hvert rør af embryoner og erstatte med tilstrækkelig riboprobe / HYB + til dækning af embryoner. Bemærk: Typisk er nødvendigt for at dække embryoner i en flad bund mikrocentrifugerør 200-250 ul riboprobe / HYB +. Riboprobe / HYB + tilføjelse og fjernelse udføres typisk ved hjælp af en pipette og barriere tips til at undgå krydskontaminering mellem prøverne.
- Inkuber embryoner ved 70 ° C natten over med ribroprobe / HYB +.
- Forbered følgende sæt af vaskeopløsninger og præ-varme dem natten over ved 70 ° C: 50% formamid/2X SSCT, 2x SSCT, og 0,2 x SSCT. Bemærk: Det er praktisk at forberede 50 ml aliquots hver vask løsning, da den overskydende kan opbevares ved stuetemperatur og derefter genopvarmet til fremtidig brug.
- Fjern riboprobe / HYB + med en pipette og barriere tips og opbevares ved -20 ° C. Bemærk: Typisk hver riboprobe / HYB + blanding kan bruges flere gange (f.eks, 3 eller mere) uden forringelse af signal. Mens genbruges riboprobe / HYB + er forbundet med lavere baggrund dog huske på, at genbruges riboprobe blandinger kan blive udsat for nedbrydning.
- Vask embryoner to gange med 50% formamid/2X SSCT i 30 minutter ved 70 ° C.
- Vask embryoner gang med 2x SSCT i 15 minutter ved 70 ° C.
- Vask embryoner to gange med 0,2 x SSCT i 30 minutter ved 70 ° C.
- Fjern 0,2 x SSCT og vaske embryoerne to gange med MABT ved stuetemperatur.
4.. Anti-digoxygenin Antibody Inkubation og Detection
- Fremstilles frisk blokopløsning.
- Fjern MABT og erstatte med blok løsningertion.
- Inkubér embryoner i blok løsning for 2-4 timer ved stuetemperatur. Bemærk: Længere blok inkubationer giver optimale resultater med unge zebrafisk embryoner faser (<15 somitter). For at gøre den langvarige blokprocedure udføre blokken inkubation i 8-12 timer ved stuetemperatur eller en kombination af stuetemperatur plus (op til ~ 8 timer) en efterfølgende 4 ° C inkubering natten over.
- Forbered anti-digoxygenin antistof løsning ved at lave en 5000 gange fortynding i frisk blok løsning (f.eks 1 pi per 5 ml blok).
- Fjern blokken og tilsæt antistof / blokopløsning.
- Dæk prøven i folie og inkuberes natten over ved 4 ° C eller i 4 timer ved stuetemperatur.
- Fjern anti-digoxygenin/block og vaske embryoner mindst 10 gange med MABT. Bemærk: Overfør embryoner til 12-brønds skåle for MABT vaske. Dette øger den hastighed, hvormed de embryoner kan vaskes, hvilket er nyttigt ved behandling af store prøvemængder, ennd gør det nemt at overvåge udviklingen af farvningen reaktion (trin 4.11) under et stereomikroskop. Bemærk: I dette trin embryoner kan 'super-vasket "ved at inkubere dem natten over i MABT ved 4 ° C, før du fortsætter til trin 4,8, hvilket er en nyttig behandling for sonder, der har tendens til at give høj baggrund eller pletter, der kræver langvarig overvågning under arbejde dag.
- Klargør præ-farvning puffer og den ønskede farveopløsning (lilla eller rød substrat).
- Fjern MABT og vaske embryoner i præ-farvning puffer i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern pre-farvningsbuffer og tilføj farvningsopløsningen.
- Overvåge udviklingen af rumtemperaturen farvningsreaktionen hver 15-30 min ved at kontrollere udseendet af embryonerne under et stereomikroskop. Bemærk: Hastigheden af farvningen reaktion kan bremses ved at overføre prøver til 4 ° C, hvis det er nødvendigt at give mere tid til færdiggørelsen af pletten. Når nedkøles til 4° C, men reaktionen kan ikke fremskyndes ved opvarmning til stuetemperatur.
- Når farvningen reaktionen er færdig, skal du fjerne farvningsopløsningen og erstatte med 1x PBST.
- Vask to gange med 1x PBST i 5 min. Bemærk: Hvis der ikke identificeret andre gener med en anden substrat, derefter lave prøverne i iskold 4% PFA/1x PBS i mindst 20 minutter, og fortsæt til trin 6.1. Ellers skal du fortsætte til trin 5.1.
5.. Anti-fluorescein antistof Inkubation og Detection
- Fjern 1x PBST og vaske embryoner to gange med 0,1 M glycin, pH 2,2 i 15 minutter hver ved stuetemperatur. Bemærk: Den tid for glycin vasker er afgørende for helt at deaktivere den første farvning reaktion.
- Fjern 0,1 M glycin og vaske embryoner to gange med MABT i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Forbered anti-fluorescein antistof løsning ved at lave en 5000 gange fortynding i frisk blok løsning (f.eks 1 pi per 5 ml blok).
- Fjern MABT og tilsæt antistof / blokopløsning. Følg trin 4,6-4,13 at udføre detektion af fluorescein-mærket ribroprobe. Bemærk: Når den endelige farvning reaktionen er fuldført, er det vigtigt, at den sidste fiksering af prøven sker i iskold 4% PFA/1X PBS. Fiksering med varmere PFA-løsninger har tendens til at være forbundet med klæbrig æggeblomme, der er vanskeligt at fjerne fra foster under dissektion og deyolking for den flade mount procedure.
6.. Embryo Dissektion og Initial Deyolking af Embryo
- Vælg en fast, farves foster for flad montering.
- Brug en overførselspipetten at placere det valgte embryo prøven i en plast eller glas petriskål indeholdende 1x PBST.
- Placer fadet under et stereomikroskop, og rul foster ved hjælp af et par fine tang eller øjenvippe værktøj, således at en lateral udsigt er opnået, og de hoved og hale ender visualiseres.
- Brug et par fine tænger til at foretage et snit i the blommen ved en position placeret centralt mellem hovedet og halen af embryonet, og i mellemtiden at bruge et andet par fine tænger til at holde embryo for således at tilvejebringe løftestang for blommen indsnit. Bemærkning: Alternativt gøre to store snit i blommen, en tæt på hovedet og den anden tæt på halen af embryoet.
- Brug fine tænger og / eller en øjenvippe redskab til at øse ud af blommen fra blommesækken celle hulrum.
- Skyl foster forsigtigt med 1x PBST at fjerne omstrejfende æggeblomme.
7.. Fin Deyolking af embryo
- Overfør embryonet til en flad glasplade med 1-2 dråber 1x PBST.
- Brug en øjenvippe værktøj og fin pincet til forsigtigt at placere foster med den ventrale (blomme) opad på objektglas.
- Træk embryonet til kanten af 1x PBST løsning ved hjælp af pisken værktøj, så kimen forbliver i en flad position mod objektglas.
- Skrab den ventrale overflade af embryoet forsigtigt at bruge pisken tilol med henblik på at fjerne de æggeblomme granulat uden at rive embryoet. Samtidig bruger et par fine pincet til at forankre embryo mens skrabning med vipperne værktøj. Bemærk: Fjernelse af blommen granulat kan kræve gentagne skrabning i 5-10 min.
- Hvis PBST opløsningen bliver rodet med overskydende æggeblomme eller begynder at fordampe, tilsæt 1-2 friske dråber af 1x PBST til diaset ved hjælp af en plast eller glas overførselspipette og derefter trække embryoet til området med den rene løsning til yderligere æggeblomme granulat fjernelse.
- Når blommen er tilfredsstillende fjernet, overfører pipette forsigtigt flytte embryo tilbage i en plast eller glas petriskål indeholdende 1x PBST for en afsluttende skylning for at fjerne omstrejfende æggeblomme granulat.
- Overfør deyolked foster ved hjælp af en plast eller glas overførselspipetten ind i en plast eller glas petriskål indeholdende 100% glycerol.
- Inkuber embryo i 100% glycerol for ~ 5 min at akklimatisere embryoet.
8.. Montering på et objektglas
- Overfør deyolked foster til et rent objektglas i 1-2 dråber 100% glycerol.
- Placer foster med den ventrale (blomme) side mod objektglasset.
- Ved hjælp af en øjenvippe værktøj trække embryonet til kanten af glycerol dråbe, så kimen forbliver i en flad position mod objektglas. Hvis embryonale akse er buet, skal du bruge de fine pincet til forsigtigt at gøre meget små snit i den resterende æggeblomme cellemembranen til at lindre spændinger, så kimen kan placeres fladt på diaset med en lige akse.
- Placer små divots af modellervoks på de fire hjørner af et 18 x 18 mm dækglas. Bemærk: Som et alternativ, kan små dråber af vakuum fedt 15 erstattes modellervoks.
- Placer dækglas langsomt på embryonet, lystfiskeri dækglasset for at minimere dannelsen af luftbobler i glycerol omkring prøven.
- Tilføj en ekstra dråbe 100% glyceroltil den side af dækglas at fylde rummet mellem dækglasset og objektglasset.
- Tryk ned langsomt og forsigtigt på de fire hjørner af dækglasset til fast placere foster mellem glasset og fjerne drifting. Bemærk: Pas på ikke at knuse embryoet.
- Hvis fosteret ikke er placeret som ønsket, anvende fin pincet til at fjerne dækglasset. Brug pisken værktøj til at flytte embryoner og / eller fin pincet til at foretage yderligere snit, så kimen kan flyttes. Gentag trin 8,4-8,7.
- Observere og / eller billede prøven ved hjælp af enten et stereo-eller sammensat mikroskop.
- Opbevar den flade mount forberedelse flad med en pap diasholder i mørke ved 4 ° C i flere uger eller midlertidigt ved stuetemperatur. Bemærk: Den WISH pletten falmer gradvist over tid, især røde substratreaktioner, og kan ikke være konserveret i glycerol på ubestemt tid. Lilla pletter også falme lettere hvis de opbevares i glycerol i forhold tilPFA (se trin 8.11). Interessant er det blevet offentliggjort, at montering embryoner i Permount snarere end glycerol kan aktivere ubestemt opbevaring ved stuetemperatur 15.
- Til langtidsopbevaring af lilla substrat farvede prøver, skal du fjerne dækglas og skyl embryo skylles to gange i 1x PBST, derefter overføre til et mikrocentrifugerør med 4% PFA/1x PBS for langtidsopbevaring. Bemærk: Alternativt kan embryoner 1x PBST behandles til yderligere analyser, såsom DNA isolation til genotypebestemmelse.
Representative Results
Den flade montering protokol procedure indebærer transformation af zebrafisk embryo fra sin normale anatomi, hvor kroppen akse er viklet omkring en centralt placeret æggeblomme bolden ind i en to-dimensionel præparat (fig. 1A). Whole mount billeddannelse af unge zebrafisk embryo er begrænset af karakteren af, hvordan den embryonale akse er viklet rundt om blommen. Som et resultat, laterale eller dorsale over hele mount farvede embryo prøver kan kun optage en del af aksen eller skjule særlige væv (figur 1B). Til sammenligning deyolking og udfladning af embryonet giver hele embryonale akse, der skal visualiseres på én gang (figur 1B). Disse begrænsninger er påvist ved at undersøge en WISH farves foster, blev mærket med antisense riboprober at detektere irx3b (lilla), hvilket er en delmængde af de renale stamceller placeret ved siden somitter 7 til 13, og MYOD1 (rød), som mærker densomitter (Figur 1b). Feltet af irx3b + renale stamceller er skjult i hele mount sidebillede fordi irx3b transkripter er rigelige i det centrale nervesystem, hvilket gør den renale område praktisk taget umuligt at visualisere med den laterale kamera vinkel; yderligere, inden for irx3b + renale stamceller er kun delvis synligt, når embryoet drejes i en dorsal kamera visning, fordi området er viklet rundt om blommen (figur 1B). Men en dorsal af den samme embryo efter flad montering gør det muligt at hele feltet af irx3b + renale stamceller, der skal analyseres på en enkel måde i forhold til de somitter langs stammen og andre embryonale strukturer (figur 1B). Således kan komplicerede rumlige domæner være ideelt dokumenteres med denne metode.
Flere vigtige skridt er involveret i en vellykket gennemførelse af den flade mount procedure. For at udføre denne technique skal blommen bold først adskilles fra embryonet korrekt (figur 2A), hvilket kan gøres med fine instrumenter såsom et par fine tænger, mens fosteret er visualiseret under anvendelse af et stereomikroskop. Efter den rå fjernelse af blommen bold en bøde øjenvippe værktøj bruges til at skrabe væk æggeblomme granulat, der er forblevet knyttet til embryo (figur 2B). Afskaffe de resterende æggeblomme granulat hjælper til at lette visualisering af embryonale væv. Endelig deyolked embryo manipuleret til at placere den stabilt på et objektglas (figur 2C), hvilket muliggør observation og hjælpemidler dokumentation af prøven ved anvendelse af imaging software og et kamera knyttet til mikroskopet. Lash værktøjer er hjemmelavede enheder, der kan konstrueres ved at anbringe en passende øjenvippe til en pipettespids hjælp superlim, som kan monteres på et håndtag, hvis det ønskes (figur 3A, Materials tabel). Forskellige lash prøver kan fremskaffes til at producereøjenvippe værktøjer med lidt forskellige karakteristika med hensyn til længde og taper (figur 3B), som hver bruger kan have forskellige forkærlighed for, når de begynder at eksperimentere med den flade mount procedure. Eksempler på lash prøver omfatter naturligt kaste menneskelige øjenvipper, naturligvis kaste dyr strittende hår eller knurhår, og endelig syntetiske sorter af kommercielt tilgængelige vipper findes i detailhandlen kosmetiske afdelinger.
Det lokale område omkring og indeholdende prøve (r) placeret på et objektglas (figur 4A) kan afbildes med høj opløsning analyse. En kombination af prober blev anvendt til at mærke udviklingslandene nyre stamfædre, der giver anledning til nyren i vildtype embryo i de tidlige udviklingsstadier med tofarvede WISH, og derefter fladt montere forberedelser blev udført for at se prøverne (figur 4B, 4C ). I de tidlige somite stadier, er renal stamfædre afgrænset i en U-formet mønster af their udtryk for pax2a udskrifter (lilla) omgiver paraksiale mesoderm der samtidig udtrykker delta K (DLC) (rød) (venstre kolonne, figur 4B) 6,7. Til sammenligning, når DLC-transkripter blev detekteret med en lilla substratet og blev mærket i kombination med baghjerne markør krox20 (rød), en rostralt underdomæne af de renale stamceller blev visualiseret som udtrykker DLC (højre kolonne, figur 4B), som tidligere bemærket 6,7. Flade mount præparater kan anvendes på lignende måde til at studere senere somitogenesis faser. På 14 somite fase analyserede vi ekspressionen af renale markører pax2a, slc4a4 og slc12a3 (lilla) sammen med smyhc1 (rød), som markerer somitter (figur 4C). Disse kombinationer gør det muligt at kortlægge hele renal progenitor domæne med pax2a, mens afsløre, at en delmængde af celler i en rostralt underdomæne udtrykdede slc4a4a og var kendetegnet ved en ikke-overlappende kaudal underdomæne af nyre stamfædre, der udtrykte slc12a3.
Tofarvet WISH og den flade montere forberedelse er også værdifulde for studiet af cellulære domæner under organogenese i zebrafisk med genetiske mutationer eller andre forstyrrelser fra den miljømæssige udsættelse for små molekyler 6,7 (figur 5). De zebrafisk nls og lib mutanter harbor mutationer i aldehyddehydrogenase 1a2 (aldh1a2, tidligere kendt som raldh2), som koder for et enzym, der kræves for biosyntesen af retinsyre (RA). RA er afgørende for en korrekt udvikling af mange nyre celletyper, herunder dannelsen af podocyte celler, der bidrager til at få blodet til filteret i embryonale nyre, kendt som glomerulus 6,7. Ønske blev udført for at mærke de podocyte stamfædre med wt1a samtidig med afgrænsning af than udvikler somitter med smyhc1 og baghjerne med krox20 i vildtype embryoner, NLS mutant embryoner, lib mutant embryoner og embryoner, der behandles med et ALDH enzym kemisk inhibitor, DEAB (figur 5). Fostre med mangelfuld aldh1a2 udtryk viste reduceret wt1a udtryk sammenlignet med vildtype embryoner, mens DEAB-behandlede embryoer viste en ophævelse af wt1a udskrifter (figur 5, højre spalte). Tilsammen disse repræsentative resultater demonstrerer, hvordan den flade mount teknik kan bruges til at analysere og dokumentere anatomiske forskelle med præcision i det tidlige foster, og dermed gennemføres for værdifulde udviklingsmæssige studier.
Figur 1.. Oversigt over den flade mount forberation for zebrafisk embryoner. A) den procedure for flad montering muliggør samtidig visning af væv langs embryonale akse, fordi den centrale æggeblomme massen er fjernet, og embryoet stabilt placeret på en flad overflade. B) billeder af en hel mount ØNSKE farvede foster i laterale og dorsale udsigt, og derefter efter en flad mount præparat blev gennemført. Fosteret blev farvet med antisense-prober til påvisning af gentranskripter koder irx3b (lilla) og MYOD1 (rød).
Figur 2.. Skematisk af flade mount procedure for zebrafisk embryoner. A) embryo først groft deyolked at fjerne størstedelen af blommen masse, derefter (B) den ventrale overflade fint deyolked at fjerne de resterende æggeblomme granulat, ogefter vask fosteret er (C) monteret dorsalsiden op på en glasplade for visuel analyse og / eller fotografisk billeddannelse.
Figur 3.. Fotografier af fx lash værktøjer i forhold til fine tænger. A) Hjemmelavet lash værktøjer blev afbildet sammen med en standard par fine tænger, placeret støder op til en metrisk lineal til at give en henvisning. B) Forstørret visning af lash redskaber ved siden af de fine pincet, med millimeter reference, langs toppen af visningen . To forskellige lash værktøjer er vist med stjerne (*), der anvendes til at markere vipperne opnået fra et naturligt kaste menneskelig øjenvipper, og dobbelt stjerne (**) anvendes til at markere en øjenvippe, der er indhentet fra en naturligt kaste feline knurhår og trimmet til gøre en noget stump ende. I hver caSE, pisken blev ført gennem pipettespids og forsynet med flere lag superlim til gradvist at skabe en stærk tætning for at stabilisere / forankre vipperne til pipetten knyttet til en håndtering enhed.
Fig. 4. Karakterisering af udviklingsmæssige ændringer i den renale stamfader feltet i vildtype zebrafisk foster. A) Skub skematisk angiver det område afbildes til analyse i (B, C). B) Vildtype embryoner på 1, 3 og 5 somite fase, blev farvet ved tofarvede WISH at vurdere sammensætningen af den renale progenitor felt, der giver stige til embryonale nyrer eller pronephros. (Venstre kolonne) Udskrifter, der koder for transskription faktor pax2a (farvet i lilla) markere flere befolkningsgrupper i embryo, herunder nyre-progenitor felt, der kommer fra den mellemliggende mesoderm. Udskrifter, der koder for Notch ligand DLC markere de somitter der danner fra paraksiale mesoderm (farvet i rødt). (Højre kolonne) Når udtryk for DLC udskrifter (farvet i lilla) og baghjerne rhombomere markør krox20 (farvet i rødt) undersøges i de samme embryoner kan observeres DLC udtryk i en rostral underdomæne af de renale stamfædre placeret ved siden somitter 1-5, der blev tildækket under samtidig farvning af DLC med pax2a. C) Vildtypemus embryoner på 14 somite fase var dobbelt eller tredobbelt farves med en kombination af en nyremarkør (lilla), den somit markør smyhc1 (rød) og baghjerne rhombomere markør krox20 (også rød). (Top panel) På dette stadium, pax2a udskrifter fortsætte med at afgrænse de renale stamceller. (Middle, Lavere paneler) Inden renal stamfader område, er en rostral subdomæne markeretved slc4a4 og udskrifter, der koder slc12a3 markere en kaudal underdomæne.
Figur 5.. Brugen af flade monterede forberedelserne til at karakterisere de fænotyper forårsaget af genetiske mutationer eller kemiske genetiske forstyrrelser, der modulerer retinsyre biosyntese. Ønsket udtryk mønster på 15 somite etape af wt1a (lilla) og smyhc1/krox20 (rød) blev sammenlignet mellem vilde typer og embryoner med mangler i retinsyre (RA) produktion på grund af defekter i aldehyddehydrogenase 1A2 (NLS og lib mutationer) eller kemisk hæmning af retinaldehyde dehydrogenase aktivitet med diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Reduktionen af RA produktion lib er lidt mere alvorlig end NLS, f.eksat lib embryoner udtrykker lidt reduceret farvning af wt1a udskrifter end tilsvarende iscenesat nls mutant embryoner, mens DEAB behandling af vilde typer er forbundet med fuldstændig ophævelse af wt1a udtryk.
Discussion
Zebrafisk har vist sig at være en særdeles værdifuld model organisme i hele forskningsverdenen i de senere år. Zebrafisk udviser en betydelig grad af genetisk bevarelse med den, højere hvirveldyr, og fordele vedrørende deres anatomi, avl, og livscyklus gør denne art meget modtagelig for eksperimentelle analyser. Desuden har fremme af molekylære teknikker, der gælder for zebrafisk fremmes yderligere anvendelse af denne model organisme i videnskabelig forskning. For eksempel har et stort udvalg af transgene zebrafisk linjer blevet genereret til at studere sygdomsudvikling og besvare mange fundamentale spørgsmål, der ligger til grund for de centrale mekanismer udvikling, herunder organogenesen.
Derfor baseres på den dynamiske brug af zebrafisk i både sygdommen og udviklingsstadiet forskning, cellemærkning metoder og signal kvantificering er et afgørende aspekt af dataanalyser. Mens metoder, som anvender lysstofrør entibodies kan anvendes til påvisning af protein-ekspression i transgen zebrafisk forskere typisk afhængige af standardprocedurer som WISH 12-16 at undersøge Spatiotemporal lokalisering af gentranskription i en fast, ikke-transgen zebrafisk prøve. I virkeligheden ønsker er en af de mest udbredte teknikker i biologi 16, og er et vigtigt redskab til at karakterisere fænotype af genetiske mutationer og kemiske genetiske forstyrrelser. Ikke desto mindre er ønske er forbundet med en række potentielle faldgruber og udfordringer. For at bekræfte specificiteten af antisense ribroprobe kan sense riboprober bruges som en kontrol for at vurdere specificitet antisense riboprobe farvningsmønstre. Mens § § 4 og 5 er vist i rækkefølge mærkning og detektion af en digoxygenin-mærket probe efterfulgt af fluorescein-mærket probe, kan denne ordre vendes. Typisk er svagere signaler (gener med lavere ekspressionsniveauer) bedst påvises med digoxygenin-mærkede prober og denne pletudvikles først med en lilla underlag, efterfulgt af påvisning og farvning af stærkere signal (mere rigeligt udtrykt gen) ved hjælp af den røde underlag. Hvis tofarvede reaktioner vil blive udført, anbefales det dog, at forskellige kombinationer af etiketter og substrater er testet for at finde den fremgangsmåde, der er mest velegnet til indsamling og analyse af data. Desuden er opgivet til at blokere, antistof-inkubation og vask forudsat i § § 4-5 er skræddersyet til embryoner yngre end 24 timer efter befrugtning; lange mellemrum i disse samme trin med ældre fostre kan føre til salt ophobning på prøven. Omfattende tips til fejlfinding standard zebrafisk embryo WISH er allerede blevet dokumenteret i litteraturen 12-16. Formentlig det mest almindeligt dilemma er høj baggrund. Vi anbefaler, at øge antallet af MABT vasker i trin 4.7 til 15-20 vasker hvis nødvendigt, selvom vores erfaring tilføjelsen af natten MABT 'super-vask'giver enestående resultater, når de anvendes i forbindelse med 10 eller flere korte MABT vasker, før du fortsætter til trin 4.8. Et andet eksempel dilemma er dårlig sonde infiltration, der kan forekomme med langvarige riboprober. Klipning riboproben følgende trin 3.6 via alkalisk hydrolyse kan modvirke dette. I vores erfaring med unge prøver er sonde klipning ikke typisk kræves. Man bør imidlertid huske på, at parametre som dette kan være medvirkende faktorer i resultatet af et ønske eksperiment, og vi foreslår en undersøgelse af disse nyttige fejlfinding vejledning allerede offentligt tilgængelige i samfundet efter behov for at forfine de eksperimentelle parametre for WISH i din egen forskning 12.
Ud over de traditionelle WISH teknikker 12-16, har der været en løbende fremkomsten af fremskridt i WISH metoder og alternative protokoller, der er blevet formuleret. Heriblandt nye måder signaldetektering, såsom gennem anvendelse af fluorescerendecens 17-19, metoder, der muliggør lokalisering af microRNA 20.. Alligevel, på trods af de mange forbedringer, der er foretaget i de nuværende celle mærkningsfremgangsmåder er effektiviteten af disse procedurer negeret hvis pletten (r) ikke let kan visualiseres i prøven af interesse på et ønsket tidspunkt. Denne begrænsning er problematisk for forskere, især når den vedrører de tidlige embryonale stadier af zebrafisk ontogeni, som potentielt kan føre til huller i vores forståelse af forskellige udviklingsprocesser, der opstår på disse tidspunkter. Under normal zebrafisk udvikling vil blommesækken aftager i størrelse som foster aldre 11. Derfor ved disse senere udviklingsstadier (> 24 timer efter befrugtning) WISH farvningen er forholdsvis ligetil at analysere fordi fosteret er større i forhold til dens tilstødende blommesækken. Men dette er ikke tilfældet fra halen knopstadiet til tidlig somitogenesis (når embryonalemasse er placeret rundt om blommen) når det uigennemsigtige blommesækken kan undertiden sløre visualisering af pletten. Derfor blev metoden til flad montering udtænkt til at hjælpe med at lindre de billedbehandling og dataanalyse problemer forbundet med karakteriseringen af tidlige zebrafisk embryo prøver (skematiseret i figur 1 og figur 2), og har stort set været brugt siden systematisk fænotypning af genetiske mutationer isolerede fra de første storstilede genetiske skærme 21.
Siden fremkomsten af den flade montering teknik har analysen af tidlige udviklingsstadier blevet væsentligt forbedret. Når blommen er fjernet fra embryonet, er det muligt at lægge embryo fladt på en glasplade i den ønskede orientering til billeddannelse. Denne to-dimensionelle position muliggør visning af hele embryo på én gang, hvilket eliminerer behovet for at rotere prøven. Talrige væv er placeret i brede områder af embryonet, såsomforstadier, der danner blod og nyrer. Endvidere kan man nødt til at sammenligne flere forskellige udviklingslande væv på én gang. Flad montering gør det muligt for forskeren at samtidig at se hele domænet af sådanne cellegrupper, og kan således i høj grad støtte kvantificeringer såsom et måleområde for et væv eller celletallet. Denne teknik har i sidste ende hjulpet føre til mange opdagelser om en række vigtige udviklingsmæssige mekanismer bag hematopoiese, neurogenese og organogenesis. Således når mestrer, ansøgningerne om denne enkle teknik til forskere er ganske betydelige.
For eksempel i en undersøgelse afstamning valg under hematopoiese, flad montere præparater af zebrafisk embryoner på 14 og 18 somite stadier (ss) blev brugt til at illustrere de ændringer, der skete i udtrykket mønster af pu.1 zink finger transskription faktor mellem vildtype og gata1 morpholino injicerede embryoner 22.Denne metode gjorde det muligt for påvisning af en udvidet pu.1 domæne ved 18 ss, hvilket indikerer, at gata1 er mest sandsynligt regulerer ekspressionen af pu.1 i det mellemliggende cellemasse (ICM) omkring dette tidspunkt. Supplerende fast monteret embryoner farvet for forskellige erythroide gener, herunder gtpbp1 og epsin viste et tab i ekspressionen af disse gener i VLT mutanter, der var gata1 - / -. Yderligere analyser viste ingen ændring i ekspressionen af erythoid gener som biklf og testhymin, der blev kendt for at være uafhængig af gata aktivitet. Derfor, i forbindelse med deres andre eksperimentelle resultater blev det afsløret, at gata1 er vigtigt i reguleringen af differentieringen af celler i myelo-erythroid afstamning. I en undersøgelse af neural crest udvikling blev flade mounts bruges til at undersøge Crestin udtryk i Mont Blanc-(MOB M610) mutanter i en undersøgelseundersøge roller Mont Blanc og tfap2a genfunktion 23. Ved 10 og 20 ss blev Crestin udtryk helt ophævet i hovedet og faldt i bagagerummet region mob M610 mutanter i forhold til den normale vildtype-udtryk, i sidste ende hjælpe denne gruppe til at konkludere, om vigtigheden af Mont Blanc og tfap2a regulering under neuralkam formation. Derudover er der i form af organogenese har flade mounts aktiveret opdagelsen af tilstedeværelsen af distinkte domæner i begyndelsen renal progenitor område i udviklingen af zebrafisk embryonale nyre, kendt som pronephros. Zebrafisk embryo giver et bevaret og alligevel anatomisk ligetil system til at studere, hvordan nyre stamfædre giver anledning til nephron funktionelle enheder, der omfatter pronephros, en proces kendt som nephrogenesis 6,7 (Figur 4). Flad mount analyse har været nyttigt at dokumentere domæner af renale stamfædre og at dissekere resultatet af ændringer i RA signalering under pronephros mønstring 6,7 (figur 5), som tidligere var ukendt. Tilsammen disse eksempler viser, at der er faktisk mange brede ansøgninger til denne flade montere protokol i studiet af forskellige processer, der opstår under normal udvikling og syge tilstande.
Begrebsmæssigt denne flade mount procedure er forholdsvis enkel samlet. Manipulationer og graden af finesse, der kræves for at mestre denne metode, kan dog være ganske udfordrende at mestre i fravær af visuel demonstration. Derfor er denne protokol blev udarbejdet for at gøre det muligt for forskere, især de nye til zebrafisk model med mulighed for bedre at forstå, hvordan du udfører denne teknik, og dele vores råd på reagenserne, der kan optimere væv håndtering. Vi håber, at denne protokol i sidste ende vil give andre i samfundet til at forfine de mest ideelle prøve betingelser for at være used for premium billedbehandling, dataanalyse og kommunikation af deres resultater i publikationer. I sidste ende bør dette gøre det muligt for forskerne at overvinde de anatomiske hindringer i zebrafisk under tidlig embryogenese, der kan skjule præsentationen af eksperimentelle resultater, og løse disse gennem brug af denne enkle, men betydelige teknik.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af midler til RAW fra hver af følgende: NIH tilskud K01 DK083512, DP2 OD008470 og R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar tildeling af tilskud # 5-FY12-75; opstart midler fra University of Notre Dame College of Science og Biologisk Institut. Vi vil især gerne takke Elizabeth og Michael Gallagher, sammen med hele Gallagher Family, der bibringes en generøs gave til University of Notre Dame for at fremme stamcelleforskning. De finansieringskilderne havde nogen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet. Vi takker stabe af Biologisk Institut for deres støtte, og Center for zebrafisk Forskning på Notre Dame for deres enestående engagement i pleje og velfærd for vores zebrafisk koloni. Endelig vil vi takke medlemmerne af vores forskningslaboratorium for deres kommentarer, diskussioner og indsigter om dette arbejde, somsamt Marigold (Maripooka) og Zinnia Wingert for at give naturligt kaste feline whiskers til at gøre mest fremragende lash værktøjer til vores forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
| 1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water. | ||
| Mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
| Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Flat bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
| Glass vial | Wheaton | 225012 | |
| 1x PBST | 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water. | ||
| Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
| 10x PBS | American Bioanalytical | AB11072 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
| 4% PFA/1X PBS | Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks. | ||
| Filter sterilization unit | Corning | 430516 | 1 L filter system, 0.45 μm CA |
| MeOH | Sigma | 34860-4L | |
| Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C. |
| HYB+ | 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin | ||
| DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Refer to manufacturer instructions. |
| SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
| RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer | Roche | 4716728001 | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C. |
| Molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
| Waterbath | Thermo | 51221073 | Model 2831 |
| Nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Store at -20 °C. |
| 20x SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
| MAB | 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave. | ||
| MABT | MAB + 0.1% (v/v) Tween-20 | ||
| Block solution | We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use). | ||
| FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C. |
| BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C. |
| Anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Store at 4 °C. |
| Anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Store at 4 °C. |
| 12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
| Pre-staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days. | ||
| Staining solution-purple | For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| Staining solution-red | For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples). | ||
| NBT stock | Sigma | N6876 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water. |
| INT stock | Sigma | I8377 | Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water. |
| BCIP stock | Sigma | B8503 | Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF. |
| DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
| Glycine | Sigma | G8898 | 0.1 M glycine, pH 2.2 |
| Small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
| Glycerol | Sigma | G7893 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
| Lash tool | Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools. | ||
| Glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | White Frost |
| Glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
| Modeling clay | Hasbro | Playdoh | Other craft modeling clay products can be substituted. |
| Slide holder | Thermo-Fisher | 12-587-10 | Cardboard tray to store slides flat. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
| Compound microscope | Nikon | 80i, 90i |
References
- Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
- Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
- Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
- Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
- Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
- Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
- Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
- Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).
