Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount Published: July 17, 2014 doi: 10.3791/51604
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Summary

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Abstract

De zebravis embryo wordt nu vaak gebruikt voor basis-en biomedisch onderzoek naar de genetische controle van ontwikkelingsprocessen te onderzoeken en te modelleren aangeboren afwijkingen. Tijdens de eerste dag van het leven, de zebravis embryo doorloopt vele ontwikkelingsstadia waaronder bemesting, decollete, gastrulatie, segmentatie, en de organogenese van structuren zoals de nieren, het hart en het centrale zenuwstelsel. De anatomie van een jonge zebravis embryo presenteert een aantal uitdagingen voor de visualisatie en analyse van de betrokken bij vele van deze evenementen weefsels omdat het embryo zich ontwikkelt in samenwerking met een ronde dooier massa. Zo nauwkeurige analyse en beeldvorming van experimentele fenotypes vaste embryonale specimens tussen tailbud en 20 somiet fase (10 en 19 uur na de bevruchting (HPF), respectievelijk), zoals gekleurd met hele mount in situ hybridisatie (WISH), het is vaak wenselijk om het embryo uit de dooier b VerwijderEn het plat op een glasplaatje positioneren. Echter, het uitvoeren van een platte berg procedure kan vervelend zijn. Daarom succesvol en efficiënt plat mount voorbereiding wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door de visuele demonstratie van de dissectie techniek, en ook geholpen door het gebruik van reagentia die helpen bij het optimaal weefsel handling. Hier bieden we onze wens protocol voor een of twee kleuren detectie van genexpressie in de zebravis embryo, en laten zien hoe de vlakke montage procedure kan worden uitgevoerd op dit voorbeeld van een gebrandschilderd vast exemplaar. Deze vlakke montage protocol is breed toepasbaar op de studie van vele embryonale structuren die ontstaan ​​tijdens de vroege ontwikkeling van de zebravis, en kan in combinatie met andere kleuringen uitgevoerd op vaste embryo monsters worden uitgevoerd.

Introduction

De zebravis, Danio rerio, is uitgegroeid tot een veel gebruikt organisme in de studie van de ontwikkelingsbiologie. Zebravis is een tropische, zoetwater gewervelde soorten die behoren tot de familie Cyprinidae. Zebravis werden oorspronkelijk gebruikt voor milieu-onderzoek om de kennis over de gevaren van potentiële water verontreinigende stoffen te krijgen, als ze waren makkelijk verkrijgbaar, goedkoop en gemakkelijk te onderhouden 1. In de afgelopen dertig jaar is de zebravis wordt erkend als een genetisch handelbaar gewervelde modelsysteem voor tal van redenen. Zebravis vertonen een hoge mate van anatomische en fysiologische conservering met hogere gewervelde dieren waaronder zoogdieren 2,3. Recente genoomsequentie annotatie is gebleken dat ongeveer 70% van de menselijke genen tenminste een zebravis tegenhanger 4. Zo hebben vele orthologe genen die een belangrijke rol spelen tijdens de ontwikkeling nier geïdentificeerd tussen deze soorten 5-7. Deze dramatic niveau van instandhouding met betrekking tot de cellulaire en moleculaire biologie heeft de onderzoekers in staat om modellen te maken voor een breed scala van menselijke ziekten in de zebravis 8, en de zebravis hebben een waardevol instrument om potentiële drug therapieën te identificeren met behulp van chemische genetische screens 9 geworden.

Bovendien is de zebravis model is alleen in staat om een ​​verscheidenheid van complexe ontwikkelingsprocessen en ziektetoestanden die worden gezien bij mensen herhalen, maar verscheidene andere kenmerken zijn oproep verhogen ook als modelorganisme voor embryologische studies. Zebravis zijn ovipaar en reproduceren via broadcast spawning, waarin onderzoekers biedt een eenvoudige toegang tot de embryo's uit het begin van de bevruchting 10. Andere voordelen zijn embryo grootte, transparantie, en een snelle, externe ontwikkeling 10. Daarnaast zebravis volwassenen bezitten een hoge vruchtbaarheid en produceren meestal relatief grote clutch maten die kan variëren tussen 200-500per week uiteindelijk waardoor onderzoekers high throughput experimenten, zoals fenotype gebaseerde chemische schermen met gemak 9.

Toch, ondanks de overvloed aan voordelen die worden tentoongesteld door de zebravis model, zijn er uitdagingen die betrekking hebben op de analyse en de communicatie van de experimentele resultaten verkregen uit de vroege ontwikkelingsstadia. In sommige gevallen kan de inherente anatomie van de zebravis embryo de visualisatie van zijn gegevens verhullen. Na de bevruchting, de eerste cel ondergaat meerdere decollete evenementen ontwikkeling vordert 11. Na gastrulatie, de embryonale as komt in de tailbud fase (10 HPF) zodanig dat het rond de dooier 11. Als verdere ontwikkeling vordert in de segmentatie periode zal de stam groeien in massa en ook verlengen door axiale verlenging zodat een staart met een gedeelte van de dooierzak zich uitstrekken vanuit de centrale dooier massa11. Tussen de tailbud en 20 somiet stadium (19 HPF), pogingen om specifieke ontwikkelingsstoornissen functies waarnemen na het gebruik van verschillende kleuringsprotocollen, zoals WISH, kan een uitdaging, zowel om te visualiseren en te fotograferen vanwege de geometrie van het embryo en de ondoorzichtigheid van de dooierzak. Een manier om deze problemen te elimineren is de dooier verwijderen en plat het embryo in een tweedimensionale monster dat op een meer eenvoudige wijze kunnen worden geanalyseerd.

Het volgende protocol-en video-middelen bieden een leidraad voor hoe je succesvol deyolk en vlakke monteer een embryo na fixatie en kleuring, met behulp van het voorbeeld van een of twee kleuren WISH kleuring. WISH is een veelgebruikte techniek die de detectie van specifieke nucleïnezuren in geconserveerde monsters mogelijk maakt en daarmee maakt de plaats (en) van genexpressie te detecteren in weefsels. WISH technieken zijn uitvoerig beschreven en kan worden uitgevoerd met verschillende kleuren substraten en grieporescent detectiesystemen 12-20. Hier bieden wij onze gewijzigde WISH protocol dat wordt gebruikt voor de zebravis embryo's tussen de tailbud en segmentatie stadia van ontwikkeling. Alternatieve WISH protocollen echter verenigbaar zijn met het platte hier beschreven mount procedure, zoals vermeld aan het begin van de onderstaande protocol. Daarnaast kunnen vlakke montage worden gebruikt in combinatie met een aantal bestaande visualisatietechnieken, zoals hele berg immunohistochemie of cellijn volgen labels, die niet in dit protocol beschreven. Al met al kan de techniek van platte montage beter in staat stellen superieure analyse en presentatie van de resultaten van proeven met de vroegste stadia van de embryonale ontwikkeling in de zebravis.

Protocol

De procedures voor het werken met de zebravis embryo's beschreven in dit protocol werd goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik aan de Universiteit van Notre Dame. Opmerking: De Delen 1-5 beschreven procedures werden gebruikt om de embryo beelden die hier in de representatieve resultaten te genereren. De in de delen 1-5 beschreven procedures kunnen worden vervangen zoals gewenst met alternatieve WISH procedures 12-16 of andere visualisatietechnieken zoals immunohistochemische labeling voor specifieke eiwitten met behulp van specifieke antilichamen. Bij het uitvoeren van platte mounts op WISH zebravis embryo's met de in de delen 1-5 beschreven protocol, de eerste embryo fixatie en laatste kleuring fixatie stappen zijn de belangrijkste manipulaties die de mogelijkheid om dooier korrels uit het monster te verwijderen voor vlakke montage beïnvloeden. De beste vlakke bevestiging resultaten worden verkregen wanneer de eerste fixatie wordt uitgevoerd met vers ontdooid ijskoude 4% paraformaldehyde (PFA) / 1x PBS en de vastlegging vande laatste wens kleuringsreactie met ijskoud 4% PFA/1x PBS (die niet hoeft te worden vers ontdooid), en het wordt aangeraden dat lezers aan om dit te overwegen bij het vervangen alternatieve kleuringen in combinatie met Parts 6-8.

1. Embryo Collection, Fixatie en opslag

  1. Bereid paring kooien door het plaatsen van volwassen zebravissen mannetje (s) en vrouwelijke (s) in kamers systeemwater zodat ze gescheiden door een verdeler nachts.
  2. Verwijder de tussenschotten tussen volwassenen en het verzamelen van de bevruchte eieren met een fijn gaas theezeefje binnen ~ 15-30 min van de paring aan koppelingen die gelijkwaardig zijn embryonale stadia hebben verzamelen.
  3. Draai de zeef ondersteboven en spoel het oppervlak met een fijne stroom E3 afgegeven uit een spuitfles om de embryo's te zetten in incubatie platen met ongeveer 25 ml E3 oplossing.
  4. Na het verzamelen van de klauwen, verdeel ze in diverse gerechten zoals dat ongeveer 50-60 embryo's worden gedurendein elk gerecht van 25 ml E3 oplossing. Opmerking: Overbevolking van embryo's kunnen leiden tot dramatische ontwikkeling asynchronie binnen de koppeling en de zorg moeten worden genomen om dit te voorkomen tijdig afhalen van de gewenste fase (n) in te schakelen.
  5. Incubeer de embryo's bij 28,5 ° C tot ontwikkelingsstoornissen evaluatie kan volgens de zebravis standaard enscenering serie 11.
  6. Gebruik een plastic overdracht pipet plaats voorzichtig het gewenste aantal embryo's in de geselecteerde tijdpunt tot de 20 somiet fase (19 HPF) in een platte bodem microcentrifugebuis. Opmerking: Wees voorzichtig bij het hanteren van jonge embryo's, als ze zijn kwetsbaar en kan gemakkelijk worden beschadigd door het breken of agressieve behandeling met pipetten. Alternatief kan glazen flacons worden voor fixatie en behandeling van embryo's. Voor alle volgende protocol wasbeurten kunststof pipetten kan worden gebruikt, met uitzondering van riboprobe toevoegen en verwijderen (stap 3,11, 3,14).
  7. Vervang de E3 met ijskoude 4% PFA/1x PBS, enbevestig de embryo's in de chorions in 4% PFA/1x PBS gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C overnacht. Nota van voorzichtigheid: PFA is giftig en PFA oplossingen moeten in een chemische kap behandeld worden tijdens het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen en een laboratoriumjas. Daarnaast moet PFA poeder met uitzonderlijke zorg worden behandeld bij het maken van de stockoplossing, zoals zelfs de gegranuleerde PFA kunnen de neiging om zich te verspreiden door middel van statische lading. Typisch PFA wordt bereid door de 1x PBS aan de kook om de PFA poeder op te lossen en vervolgens de oplossing wordt in porties bewaard bij -20 ° C. Als fijn sediment aanwezig zijn in de 4% PFA/1x PBS als de oplossing wordt afgekoeld, filter gesteriliseerd de gekoelde oplossing voor aliquoting voor vriesbewaarinstallatie door het door een 0,45 urn filter systeem. Alleen vers bereid of vers ontdooide PFA wordt gebruikt voor deze eerste (dwz primair) fixatie van het embryo.
  8. Verwijder de fix en was de embryo's tweemaal met 1x PBST, vervolgens worden overgedragen naareen incubatie schotel.
  9. Bekijk de embryo's onder een stereomicroscoop en gebruik twee paar fijne tang om de chorions rond de embryo's, zodanig dat een paar wordt gebruikt om voorzichtig gebruik maken van de embryo, terwijl het tweede paar wordt gebruikt voor het openen van de chorion scheuren te verwijderen.

2. Embryo permeabilisering

  1. Breng de dechorionated embryo's terug in de microcentrifugebuisje of glazen flesje en spoel tweemaal met 1x PBST om alle resterende chorion vuil te verwijderen.
  2. Verwijder de 1x PBST en was de embryo tweemaal met 100% methanol (MeOH).
  3. Plaats het embryo bij -20 ° C gedurende ten minste 20 minuten. Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C in MeOH gedurende een jaar of meer. Methanol maakt de chorions plakkerig, dus niet overgaan tot deze stap, tenzij de chorions zijn verwijderd.
  4. Hydrateren het embryo door het verwijderen van MeOH 100% en was bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk in 50% MeOH/1x PBST, 30% MeOH/1x PBST, daarna tweemaal met 1 x PBST. </ Li>
  5. Bereid een verse proteïnase K werkoplossing (5 ug / ml) door toevoeging van 25 pl vers ontdooide proteinase K voorraad (10 mg / ml) tot 50 ml 1X PBST.
  6. Verwijder de 1x PBST uit de embryo's, en vervang de proteinase K werkende oplossing en incubeer op basis van de embryonale fase: <= 5 somieten gedurende 1 minuut; 10-12 somieten gedurende 1,5 min; 15 somieten gedurende 2 minuten en 20 somieten gedurende 3 minuten.
  7. Verwijder de proteinase K werkende oplossing en was de embryo's tweemaal met 1x PBST.
  8. Verwijder de 1x PBST en vervang met ijskoude 4% PFA/1x PBS gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.

3. Riboprobe Synthesis, Prehybridisatie, hybridisatie en Probe verwijdering

  1. Monteer het antisense riboprobe in vitro transcriptie reactie bij kamertemperatuur in een 1,5 ml microcentrifugebuis, terwijl enzymen op ijs, door het combineren van een DNA-template met sequentie die overeenkomt met het gen van belang (hetzij 100-200 ng PCRproduct of 1,5 ug gelineariseerd plasmide DNA, bereid zoals beschreven 12,13), 2 ui digoxigenine of fluoresceïne gemerkte ribonucleotiden, 2 pi van de geschikte RNA polymerase (SP6, T3, T7 afhankelijk van de sequentie wordt opgenomen in het PCR-product of aanwezig op het plasmide DNA), 2 ui 10X transcriptie buffer, 0,5 pl RNase inhibitor, en brengen een totaal volume van 20 ul met moleculaire rang gedestilleerd water (DNase, RNase vrij). Opmerking: De 10x transcriptie buffer worden voorverwarmd door het plaatsen van de buis in een 37 ° C waterbad gedurende 10-20 minuten en daarna gevortext dat alle componenten in oplossing. Als er witte vlokken aanwezig zijn, incubeer de buis voor een ander 5-10 min en vortex opnieuw. Transcriptie reacties kunnen falen of slechte opbrengsten als de transcriptie buffer niet volledig opgelost en grondig gemengd.
  2. Meng de componenten en incubeer elke reactie bij 37 ° C gedurende 2 uur in een waterbad.
  3. Verwijder de reactie tuge (s) vanaf het waterbad en het DNA template in elk monster vernietigt door toevoeging van 5 pl 10X DNase I buffer, 2 ui DNase I enzym en 23 pi moleculaire rang gedestilleerd water om het totale volume op 50 ui te brengen, en incubeer elke buis bij 37 ° C gedurende 20 min in een waterbad.
  4. Voer een ethanolprecipitatie in elke microcentrifugebuis door toevoeging van 5 pl 3 M natriumacetaat, pH 5,2 en 110 pl ijskoude 100% ethanol, gevolgd door 1 ui glycogeen voorraad RNA pellet weergave in opeenvolgende stappen vergemakkelijken, en incubeer de buis bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur of overnacht.
  5. Centrifuge elke microcentrifugebuis op maximale snelheid 4 ° C gedurende 20 minuten, verwijder dan de 100% ethanol supernatant en te vervangen met 100 ul van 70% ijskoude ethanol.
  6. Centrifuge elke microcentrifugebuis bij 4 ° C gedurende 5 minuten, verwijder dan de 70% ethanol supernatant en de lucht droog de pellet gedurende 5 minuten, en ten slotte 100 ul van moculair kwaliteit gedestilleerd water aan de pellet opnieuw in suspensie en kwantificeren van de riboprobe voorraad concentratie met behulp van een NanoDrop spectrofotometer. Opmerking: Als de pellet in oplossing gegaan, moet de riboprobe voorraad worden bewaard op ijs en bewaard bij -20 ° C.
  7. Om de vaste embryo's voor het prehybridisatie proces voor te bereiden, verwijder de 4% PFA/1x PBS van elk monster en was de embryo's tweemaal met 1x PBST.
  8. Transfer tussen 25-40 embryo's in 1x PBST in elke afzonderlijke vlakke bodem microcentrifugebuisje. Opmerking: Overbevolking van embryo's zal later leiden tot ongelijke kleuring, en de zorg moeten worden genomen om de steekproefgrootte te beperken in elke buis tot ongeveer 40 embryo's.
  9. Vervang 1x PBST in elke buis met 500-1000 ui HYB +.
  10. Plaats de buis (buizen) van embryo's in een oven op 70 ° C en incubeer ze op deze temperatuur gedurende 4 uur prehybridisatie te voeren.
  11. Bereid de riboprobe / HYB +-oplossing door het toevoegen van 100-500 ng riboprobe (digoxygenine en / of tlein-gemerkte) 500 gl vers HYB + en incubeer deze oplossing bij 70 ° C gedurende ten minste 20 min voor stap 3.11 te voorverwarmen. Opmerking: meerdere genen transcripten, met enkele en / of dubbele colorimetrische kenmerken, elk riboprobes die met deze genen moeten worden gecombineerd tot een riboprobe / HYB + cocktail.
  12. Verwijder de prehybridisatie HYB + van elke buis van embryo's en vervang met voldoende riboprobe / HYB + om de embryo's te dekken. Opmerking: Typisch, 200-250 pi riboprobe / HYB + nodig is om embryo's in een vlakke bodem microcentrifugebuisje dekken. Riboprobe / HYB + toevoegen en verwijderen wordt meestal uitgevoerd met behulp van een pipet en barrière tips om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen.
  13. Incubeer de embryo's bij 70 ° C gedurende de nacht met ribroprobe / HYB +.
  14. Bereid de volgende set van wassen oplossingen en pre-warm ze 's nachts bij 70 ° C: 50% formamide/2x SSCT, 2x SSCT en 0.2x SSCT. Opmerking: Het is handig om voor te bereiden 50 ml al.iquots van elke wasoplossing, omdat de overmaat kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur en vervolgens opgewarmd voor toekomstig gebruik.
  15. Verwijder de riboprobe / HYB + met een pipet en barrière tips en bewaar bij -20 ° C. Opmerking: Typisch elke riboprobe / HYB + mengsel meerdere malen (bijv. 3 of meer) worden gebruikt, zonder vermindering van het signaal. Terwijl hergebruikt riboprobe / HYB + wordt geassocieerd met een lagere achtergrond, maar houd in gedachten dat hergebruikt riboprobe mengsels kunnen worden onderworpen aan degradatie.
  16. Was de embryo tweemaal met 50% formamide/2x SSCT gedurende 30 minuten bij 70 ° C.
  17. Was de embryo eenmaal met 2x SSCT gedurende 15 minuten bij 70 ° C.
  18. Was de embryo tweemaal met 0,2 X SSCT gedurende 30 minuten bij 70 ° C.
  19. Verwijder de 0.2x SSCT en was de embryo tweemaal met MABT bij kamertemperatuur.

4. Anti-digoxygenine antilichaam incubatie en detectie

  1. Bereid verse blok-oplossing.
  2. Verwijder de MABT en vervang met blok oplossingtie.
  3. Incubeer de embryo blok oplossing gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Opmerking: Langere blok incubatie zorgen voor optimale resultaten met jonge zebravis embryo stadia (<15 somieten). Om de langdurige procedure blok nachts gaat u als blok incubatie gedurende 8-12 uur bij kamertemperatuur of een combinatie van kamertemperatuur plus (tot ~ 8 uur) een volgende 4 ° C incuberen.
  4. Bereid de anti-digoxygenine antilichaam oplossing door het maken van een 5000-voudige verdunning in vers blok oplossing (bv 1 ui per 5 ml van het blok).
  5. Verwijder het blok en voeg het antilichaam / block-oplossing.
  6. Bedek het monster in folie en incubeer overnacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  7. Verwijder de anti-digoxygenin/block en was de embryo's ten minste 10 maal met MABT. Opmerking: Breng de embryo's tot 12-well gerechten voor de MABT wasbeurten. Dit verhoogt de snelheid waarmee het embryo kan worden gewassen, wat handig is bij het verwerken van grote hoeveelheden monster, eennd maakt het gemakkelijk om de voortgang van de kleuringsreactie (stap 4.11) onder een stereomicroscoop bewaken. Let op: Bij deze stap embryo's kunnen worden 'super-gewassen' door incubatie ze 's nachts in MABT bij 4 ° C worden gebracht met stap 4.8, dat is een nuttige behandeling voor sondes die neiging om een ​​hoge achtergrond of vlekken die langdurige monitoring tijdens de eisen geven werken dag.
  8. Bereid de pre-vlekken buffer en de gewenste kleuring oplossing (paars of rood substraat).
  9. Verwijder de MABT en was het embryo in de pre-kleuring buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  10. Verwijder de pre-kleuring buffer en voeg de kleuroplossing.
  11. De voortgang van de kamertemperatuur kleuringsreactie elke 15-30 min door het controleren van het uiterlijk van de embryo's onder een stereomicroscoop. Opmerking: De snelheid van de kleuring reactie kan vertraagd worden door het overbrengen van de monsters 4 ° C, indien het noodzakelijk is meer tijd voor de uitvoering van de vlek. Eenmaal gekoeld tot 4° C, maar de reactie kan worden versneld door verwarming tot kamertemperatuur.
  12. Wanneer de kleuringsreactie is voltooid, verwijdert de vlekken oplossing en te vervangen door 1x PBST.
  13. Twee keer wassen met 1x PBST gedurende 5 minuten. Opmerking: Indien niet detecteren andere genen met een ander substraat, bevestig de monsters in ijskoud 4% PFA/1x PBS gedurende ten minste 20 minuten, en ga verder met stap 6.1. Anders gaat u naar stap 5.1.

5. Anti-fluoresceïne antilichaam incubatie en detectie

  1. Verwijder de 1x PBST en was de embryo tweemaal met 0,1 M glycine, pH 2,2 gedurende 15 min elk bij kamertemperatuur. Opmerking: De tijd voor de glycine wassen is essentieel om de eerste kleuring reactie volledig uitschakelen.
  2. Verwijder de 0,1 M glycine en was de embryo tweemaal met MABT gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  3. Bereid de anti-fluoresceïne antilichaam oplossing door het maken van een 5000-voudige verdunning in vers blok oplossing (bv 1 ui per 5 ml van het blok).
  4. Verwijder de MABT en voeg het antilichaam / block-oplossing. Volg stap 4,6-4,13 tot het opsporen van de fluoresceïne-gelabelde ribroprobe voeren. Opmerking: Als de uiteindelijke kleuring reactie is voltooid, is het essentieel dat de laatste fixatie van het monster wordt uitgevoerd in ijskoud 4% PFA/1X PBS. Fixatie met warmere PFA oplossingen veelal in verband gebracht met kleverige dooier die moeilijk tijdens dissectie en deyolking voor de platte berg procedure te verwijderen van het embryo.

6. Embryo Dissection en Initial Deyolking van de Embryo

  1. Selecteer een vaste, gekleurd embryo voor vlakke montage.
  2. Gebruik een transfer pipet om de geselecteerde embryo monster in een plastic of glazen petrischaal met 1x PBST plaatsen.
  3. Zet de schaal onder een stereomicroscoop, en rol het embryo met behulp van een paar fijne tang of lash gereedschap zodat een zijaanzicht wordt verkregen en de kop en staart uiteinden worden gevisualiseerd.
  4. Gebruik een paar fijne tang om een ​​incisie in th makene dooier op een positie midden tussen de kop en de staart van de embryo, en ondertussen moet een tweede paar fijne tang om het embryo te houden teneinde middelen verschaft aan de dooier incisie. Opmerking: Als alternatief maken twee grote insnijdingen in de dooier, een dicht bij het hoofd en de andere dicht bij de staart van het embryo.
  5. Gebruik fijn pincet en / of een zweep hulpmiddel om schep de dooier van de dooier cel holte.
  6. Spoel de embryo zachtjes met 1x PBST om verdwaalde dooier te verwijderen.

7. Fijn Deyolking van de Embryo

  1. Breng de embryo op een vlakke glazen dia met 1-2 druppels 1x PBST.
  2. Gebruik een zweep gereedschap en fijne tang om voorzichtig te positioneren het embryo met de ventrale (dooier) kant naar boven op het glaasje.
  3. Sleep het embryo naar de rand van de 1x PBST oplossing met behulp van de zweep gereedschap zodat het embryo blijft in een vlakke positie tegen het glaasje.
  4. Schraap het ventrale oppervlak van de embryo zachtjes met de zweep teol om de dooier korrels verwijderen zonder scheuren het embryo. Tegelijkertijd te gebruiken een paar fijne tang om het embryo te verankeren terwijl schrapen met de zweep tool. Opmerking: Het verwijderen van de dooier korrels kunnen repetitieve schrapen voor 5-10 min is.
  5. Als de PBST oplossing wordt volgestopt met teveel eigeel of begint te verdampen, voeg 1-2 verse druppels 1x PBST aan de dia met behulp van een plastic of glazen pipet overdracht en sleep het embryo naar het gebied met de schone oplossing voor verdere dooier korrel verwijdering.
  6. Wanneer de dooier naar tevredenheid is verwijderd, gebruik dan een transferpipet zachtjes bewegen de embryo terug in een plastic of glazen petrischaal met 1x PBST voor een laatste spoeling om verdwaalde dooier korrels te verwijderen.
  7. Breng de deyolked embryo met behulp van een plastic of glazen pipet overdracht in een plastic of glazen petrischaal met 100% glycerol.
  8. Incubeer de embryo in 100% glycerol voor ~ 5 min naar het embryo acclimatiseren.

8. Montage op een glasplaatje

  1. Breng de deyolked embryo om een ​​schoon glasplaatje in 1-2 druppels van 100% glycerol.
  2. Plaats de embryo met de ventrale (dooier) kant naar het glaasje.
  3. Met behulp van een zweep gereedschap, sleept het embryo naar de rand van de druppel glycerol zodat het embryo blijft in een vlakke positie tegen het glaasje. Als de embryonale as gebogen is, gebruik dan de fijne tang om voorzichtig maken zeer kleine incisies in de resterende dooier celmembraan om de spanning te verlichten, zodat het embryo plat kan worden geplaatst op de dia met een rechte as.
  4. Plaats kleine graszoden van boetseerklei op de vier hoeken van een 18 x 18 mm glazen dekglaasje. Opmerking: Als alternatief kunnen kleine druppels vacuüm vet 15 worden vervangen voor het modelleren van klei.
  5. Plaats de glazen dekglaasje langzaam aan het embryo, vissen het dekglaasje om de vorming van luchtbellen in het glycerol rond het monster te minimaliseren.
  6. Een extra druppel 100% glycerolaan de zijde van de glazen dekglaasje om de ruimte tussen het dekglaasje en het glaasje vullen.
  7. Druk langzaam en voorzichtig op de vier hoeken van het dekglaasje stevig positioneren het embryo tussen het glas en elimineren drijven. Opmerking: Zorg ervoor dat de embryo niet te verpletteren.
  8. Als het embryo niet wordt gepositioneerd als gewenst, gebruik maken van fijne tang om het dekglaasje te verwijderen. Gebruik de zweep tool om het embryo en / of fijne tang om extra incisies te maken, zodat het embryo kan worden verplaatst herpositioneren. Herhaal de stappen 8,4-8,7.
  9. Observeren en / of afbeelding het model met behulp van een stereo-of een samengestelde microscoop.
  10. Bewaar de vlakke montage voorbereiding plat met een dia houder karton in het donker bij 4 ° C gedurende enkele weken of tijdelijk bij kamertemperatuur. Opmerking: De WISH vlek zal geleidelijk vervagen na verloop van tijd, in het bijzonder rode ondergrond reacties, en kan niet in glycerol bewaard voor onbepaalde tijd. Paarse vlekken ook vervagen gemakkelijker indien bewaard in glycerol in vergelijking metPFA (zie stap 8.11). Interessant, is bekendgemaakt dat montage embryo Permount plaats glycerol onbepaalde opslag kan inschakelen bij kamertemperatuur 15.
  11. Voor de lange termijn opslag van paars gekleurd substraat monsters, verwijder de glazen dekglaasje en spoel het embryo twee keer gespoeld in 1x PBST, vervolgens transfer naar een microcentrifugebuis met 4% PFA/1x PBS voor langdurige opslag. Opmerking: Als alternatief kunnen embryo's in 1x PBST worden verwerkt voor aanvullende analyses, zoals DNA-isolatie voor genotypering.

Representative Results

De vlakke montage protocol procedure omvat transformatie van de zebravis embryo van zijn normale anatomie, waarbij het ​​lichaam as rond een centraal dooier bal, in een tweedimensionale opstelling (figuur 1A). Whole mount beeldvorming van de jonge zebravisembryo wordt beperkt door de aard van hoe de embryonale as wordt gewikkeld rond de dooier. Dientengevolge, zijdelings of dorsale uitzicht ganse berg gekleurd embryo exemplaren slechts een gedeelte van de as of obscure bepaalde weefsels (Figuur 1B) vastleggen. Ter vergelijking, deyolking en afvlakking van het embryo kan de volledige embryonale as worden gevisualiseerd in een keer (figuur 1B). Deze beperkingen worden aangetoond door behandeling van een WISH gekleurde embryo dat werd gelabeld met antisense riboprobes voor irx3b detecteren (paars), waarbij een subset van de renale voorlopers gelegen naast somieten 7 tot 13 ​​tekens en MYOD1 (rood) die de labelssomieten (Figuur 1B). Het gebied van irx3b + renale voorlopers verduisterd in het geheel mount zijaanzicht omdat irx3b transcripten overvloedig in het centrale zenuwstelsel, waardoor de renale gebied praktisch onmogelijk te visualiseren met de laterale camerahoek; voorts het gebied van irx3b + renale voorlopers slechts gedeeltelijk zichtbaar als het embryo wordt geroteerd in een dorsale camerabeeld omdat het veld rond de dooier (Figuur 1B). Echter, een dorsaal aanzicht van hetzelfde embryo volgende vlakke montage maakt het gehele gebied van irx3b + renale voorlopers op eenvoudige wijze ten opzichte van de somieten langs de stam en andere embryonale structuren (figuur 1B) te analyseren. Aldus kan uitgebreid ruimtelijke domeinen idealiter gedocumenteerd met deze methode.

Een aantal belangrijke stappen zijn betrokken bij de succesvolle uitvoering van de platte berg procedure. Om dit techniqu uitvoerene, moet de dooier bal worden losgemaakt van de embryo (Figuur 2A), die kan worden gedaan met fijne instrumenten zoals een paar fijne tang terwijl het embryo wordt gevisualiseerd met behulp van een stereomicroscoop. Na de ruwe verwijdering van de dooier bal, is een fijne zweep hulpmiddel gebruikt om weg te schrapen dooier korrels die zijn gebleven gehecht aan het embryo (Figuur 2B). De verwijdering van de resterende dooier korrels helpt om visualisatie van de embryonale weefsels te vergemakkelijken. Tenslotte wordt de deyolked embryo gemanipuleerd om het stabiel positioneren op een glasplaatje (figuur 2C), die observatie en steun documentatie van het monster met beeldbewerkingssoftware en een camera aan de microscoop mogelijk maakt. De zweep tools zijn zelfgemaakte apparaten die kunnen worden geconstrueerd door het aanbrengen van een geschikte zweep een pipet met behulp van superlijm, die op een handvat indien gewenst (Figuur 3A, Materials tabel) kan worden gemonteerd. Verschillende zweep monsters kunnen worden aangeschaft om te producerenlash gereedschappen met iets andere eigenschappen in termen van lengte en taper (Figuur 3B), die elke gebruiker andere voorkeuren voor een keer ze beginnen te experimenteren met de platte berg procedure kan hebben. Voorbeelden van lash monsters omvatten in de natuur werpen menselijke wimpers, natuurlijk schuur dier stug haar of bakkebaarden, en tenslotte synthetische variëteiten van in de handel verkrijgbare wimpers gevonden in de detailhandel cosmetische afdelingen.

De lokale omgeving en met het monster (s) geplaatst op een glasplaatje (Figuur 4A) kan worden afgebeeld voor hoge-resolutie analyse. Een combinatie van probes werden gebruikt om de ontwikkeling van renale voorlopers die aanleiding geven tot de nier in het wildtype embryo in vroege ontwikkelingsstadia met tweekleurige WISH label, en vlakke montage bereidingen werden uitgevoerd op de monsters (Figuur 4B, 4C bekijken ). Tijdens de vroege stadia somite worden renale voorlopers afgebakend in een U-vormig patroon door eeir uitdrukking van pax2a transcripten (paars) rondom de paraxiale mesoderm die tegelijkertijd uitdrukt delta C (DLC) (rood) (linker kolom, figuur 4B) 6,7. In vergelijking, toen dlc transcripten werden gedetecteerd met een paarse substraat en werden gemerkt in combinatie met de achterhersenen marker krox20 (rood), een rostrale subdomein van de renale voorlopers werd gevisualiseerd dat dlc (rechterkant Figuur 4B) tot expressie, zoals eerder opgemerkt 6,7. Flat mount preparaten kunnen eveneens worden gebruikt voor latere stadia somitogenesis bestuderen. Bij de 14 somiet podium, analyseerden we de expressie van renale merkers pax2a, slc4a4 en slc12a3 (paars), samen met smyhc1 (rood), die de somieten (figuur 4C) markeert. Deze combinaties mogelijk de toewijzing van de gehele nier voorlopercellen domein pax2a, terwijl onthullen dat een subset van cellen in een rostrale subdomein exprEssed slc4a4a en werden gekenmerkt door een niet-overlappende caudale subdomein van renale voorouders die slc12a3 uitgedrukt.

Twee kleuren WISH en de vlakke montage voorbereiding zijn ook waardevol voor de studie van cellulaire domeinen tijdens de organogenese in zebravis met genetische mutaties of andere verstoringen van het milieu blootstelling aan kleine moleculen 6,7 (figuur 5). De zebravis nls en lib mutanten haven mutaties in aldehyde dehydrogenase 1A2 (aldh1a2, voorheen raldh2), die een enzym vereist voor de biosynthese van retinoïnezuur (RA) codeert. RA is essentieel voor de goede ontwikkeling van vele renale celtypen waaronder de vorming van podocyte cellen die bijdragen aan het bloedfilter van de embryonale nier, bekend als de glomerulus 6,7 maken. WISH werd uitgevoerd om de podocyte voorouders met wt1a label gelijktijdig met afbakening van thij ontwikkelt somieten met smyhc1 en achterhersenen met krox20 in wildtype embryo, nls mutant embryo, lib mutant embryo's en embryo's behandeld met een enzym ALDH chemische remmer, DEAB (figuur 5). Embryo's met deficiënte expressie aldh1a2 toonde verminderde wt1a expressie vergeleken met wildtype embryo's, terwijl DEAB behandelde embryo's vertoonden een afschaffing van wt1a transcripten (figuur 5, rechter kolom). Tezamen deze representatieve resultaten tonen hoe de platte mount techniek kan worden gebruikt voor het analyseren en documenteren anatomische verschillen nauwkeurig in het vroege embryo en dus waardevolle ontwikkelingsstudies uitgevoerd.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht van de flat mount voorbereidingrantsoen voor zebravis embryo's. A) De procedure van vlakke montage maakt het mogelijk gelijktijdig weergave van weefsels langs de embryonale as omdat de centrale dooier massa wordt verwijderd en het embryo stabiel geplaatst op een vlakke ondergrond. B) afbeeldingen van een hele berg WISH lood embryo in laterale en dorsale uitzicht, en dan na een vlakke mount preparaat werd uitgevoerd. Het embryo werd gekleurd met antisense probes naar gentranscripten coderen irx3b (paars) en MYOD1 (rood) op te sporen.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische voorstelling van de platte berg procedure voor zebravis embryo's. A) Het embryo wordt eerst grove deyolked om de meerderheid van de dooier massa te verwijderen, dan (B) het ventrale oppervlak is fijn deyolked om de resterende dooier korrels te verwijderen, enNa wassen van de embryo (C) gemonteerd dorsale zijde naar boven op een glasplaatje voor visuele analyse en / of fotografische beeldvorming.

Figuur 3
Figuur 3. Foto's van bijvoorbeeld lash instrumenten in vergelijking met fijne pincet. A) Homemade lash gereedschappen werden afgebeeld naast een standaard paar fijne tang, gepositioneerd naast een metrische liniaal om een referentie. B) Vergrote weergave van lash instrumenten naast de fijne tang te voorzien, met de millimeter verwijzing voorzien langs de bovenkant van het uitzicht . Twee verschillende lash tools worden getoond, met het sterretje (*) wordt gebruikt om de zweep verkregen uit markeren een natuurlijk werpen menselijke wimper en dubbele asterisk (**) gebruikt om een ​​zweep die werd verkregen uit een natuurlijk schuur katachtige snorhaar en geknipt te markeren maak een enigszins stomp uiteinde. In elk case, de zweep werd schroefdraad door de pipet tip en aangebracht met een aantal lagen van superlijm geleidelijk tot een sterke afdichting te stabiliseren / verankeren de zweep om de pipet bevestigd aan een behandeling apparaat.

Figuur 4
Figuur 4. Karakterisering van de ontwikkelingsdoelen veranderingen in de voorlopercellen veld nier in het wild type zebravis embryo. A) Schuif schematische aanduiding van de omgeving in beeld gebracht voor analyse in (B, C). B) Wild-type embryo's in de 1, 3, en 5 somiet stadium werden gekleurd door twee kleuren WISH om de samenstelling van de renale voorlopercellen veld dat geeft beoordelen aanleiding tot de embryonale nier of pronephros. (Linkerkolom) Afschriften codeert voor de transcriptiefactor pax2a (gekleurd in paars) markeren verschillende bevolkingsgroepen in het embryo, met inbegrip van de renale progenitor veld dat naar voren komt uit de intermediaire mesoderm. Transcripten die coderen voor de Notch ligand dlc markeren de somieten die vorm van de paraxiale mesoderm (gekleurd in het rood). (Rechterkolom) Wanneer de expressie van dlc transcripten (gekleurd in paars) en de achterhersenen rhombomere marker krox20 (gekleurd in het rood) in dezelfde embryo's worden onderzocht, kan dlc expressie worden waargenomen in een rostrale subdomein van de renale voorouders gelegen naast somieten 1-5, die werd verduisterd tijdens co-kleuring van dlc met pax2a. C) Wild-type embryo's in de 14 somiet podium waren twee-of driepersoons-gekleurd met een combinatie van een nier-marker (paars), de somiet marker smyhc1 (rood) , en de achterhersenen rhombomere marker krox20 (ook rood). (Bovenpaneel) In deze fase pax2a transcripten blijven de renale voorlopers bakenen. (Midden, Neder-panelen) Binnen de renale stamvader grondgebied, een rostral subdomein is gemarkeerddoor slc4a4 en transcripties die slc12a3 coderen merk een caudale subdomein.

Figuur 5
Figuur 5. Het gebruik van platte gemonteerd voorbereidingen om de fenotypes veroorzaakt door genetische mutaties of chemische genetische verstoringen die retinoinezuur biosynthese moduleren karakteriseren. De wens expressie patroon op de 15 somiet stadium van wt1a (paars) en smyhc1/krox20 (rood) vergeleken tussen wilde soorten en embryo's met tekortkomingen in retinoïnezuur (RA) productie als gevolg van defecten in aldehyde dehydrogenase 1a2 (NLS en lib mutaties) of chemische inhibitie van retinaldehyde dehydrogenase activiteit met diethylaminobenzaldehyde (DEAB). De vermindering van RA productie lib iets ernstiger dan nls, zoalsdat lib embryo uitdrukken iets verlaagd kleuring van wt1a transcripten dan vergelijkbare wijze geënsceneerd NLS mutant embryo's, terwijl DEAB behandeling van wilde soorten wordt geassocieerd met volledige intrekking van wt1a expressie.

Discussion

Zebravis hebben bewezen een zeer waardevolle modelorganisme in de hele onderzoeksgemeenschap in de afgelopen jaren. Zebravis vertonen een aanzienlijke mate van instandhouding van genetisch materiaal met dat van hogere gewervelde dieren, en de voordelen met betrekking tot hun anatomie, fokken, en de levenscyclus maakt deze soort zeer vatbaar voor experimentele analyses. Bovendien heeft de vooruitgang van moleculaire technieken voor de zebravis verder bevorderd het gebruik van dit model organisme wetenschappelijk onderzoek. Zo hebben een grote verscheidenheid van transgene zebravis lijnen gegenereerd ziekteprogressie bestuderen en vele fundamentele vragen die de mechanismen van de ontwikkeling, waaronder de organogenese grondslag liggen beantwoorden.

Dientengevolge, gebaseerd op de dynamische gebruik van zebravis zowel ziekte en ontwikkelingsonderzoek cel labeling methoden en kwantificering signaal zijn een belangrijk aspect van data analyses. Terwijl de methoden die fluorescerende een diensttibodies kan worden gebruikt om eiwitexpressie te detecteren in transgene zebravis, onderzoekers normaliter afhankelijk standaardprocedures zoals WISH 12-16 de spatiotemporele localisatie van gentranscripten in een vaste, niet-transgene zebravis monster onderzocht. In feite, WISH is een van de meest gebruikte technieken in de biologie 16, en is een essentieel instrument gebruikt om het fenotype van genetische mutaties en genetische storingen chemische kenmerken. Toch wordt WISH geassocieerd met een aantal potentiële valkuilen en uitdagingen. Om de specificiteit van het antisense ribroprobe bevestiging kan sense riboprobes worden gebruikt als een controle om de specificiteit van antisense riboprobe kleurpatronen te beoordelen. Terwijl hoofdstuk 4 en 5 worden gepresenteerd in de volgorde van etikettering en detectie van een-digoxygenine gelabelde probe gevolgd door fluoresceïne-gelabelde probe, kan deze volgorde worden omgedraaid. Meestal worden zwakkere signalen (genen met een lagere expressie niveaus) best gedetecteerd met-digoxygenine gelabelde probes en deze vlekontwikkeld voor het eerst met een paarse substraat, gevolgd door opsporing en kleuring van de sterker signaal (overvloediger uitgedrukt gen) met de rode ondergrond. Indien twee kleuren reacties zullen worden uitgevoerd, wordt aanbevolen dat verschillende combinaties van labels en substraten getest volgens de procedure die het meest geschikt is voor het verzamelen en analyseren van gegevens vinden. Daarnaast is de tijd voorzien voor het blokkeren, antilichaam incubatie en wassen die in hoofdstukken 4-5 zijn toegesneden op embryo's die jonger zijn dan 24 uur na de bevruchting; lange intervallen van dezelfde stappen met oudere embryo's kunnen leiden tot zoutophoping op het monster. Uitgebreide tips voor het oplossen van standaard zebravis embryo WISH zijn al gedocumenteerd in de literatuur 12-16. Ongetwijfeld het meest voorkomende dilemma is hoog achtergrond. Wij raden het verhogen van het aantal MABT wasbeurten in stap 4.7 tot 15-20 wast als dat nodig is, maar in onze ervaring de toevoeging van de overnight MABT 'super-wash'geeft uitstekende resultaten bij gebruik in combinatie met 10 of meer korte MABT wast pas verder met stap 4.8. Een ander voorbeeld dilemma slecht probe infiltratie, die kan optreden bij langdurige riboprobes. Scheren de riboprobe volgende stap 3.6 door alkalische hydrolyse kan dit tegengaan. In onze ervaring met jonge monsters, wordt sonde scheren meestal niet nodig. Echter, men moet in gedachten houden dat parameters als dit kan ook een rol spelen in de uitkomst van een WISH experiment te houden, en wij stellen voor onderzoek van deze handige instructies voor probleemoplossing reeds gepubliceerd in de gemeenschap als nodig is om de experimentele parameters voor WISH verfijnen in uw eigen onderzoek 12.

Naast de traditionele WISH technieken 12-16, is er een voortdurende opkomst van de vooruitgang in WISH methoden en alternatieve protocollen die zijn geformuleerd geweest. Deze omvatten nieuwe manieren signaaldetectie, bijvoorbeeld door het gebruik van fluorescentie 17-19, met methoden die de lokalisatie van microRNA 20 mogelijk. Toch, ondanks de vele verbeteringen die zijn aangebracht in de huidige cel etiketteringsmodaliteiten, de doeltreffendheid van deze procedures worden genegeerd indien de vlek (s) niet gemakkelijk kan worden gevisualiseerd in het monster plaats op een gewenst tijdstip. Deze beperking is problematisch voor onderzoekers vooral als het gaat om de vroege embryonale stadia van zebravis ontogenie, die mogelijk kan leiden tot hiaten in onze kennis van de verschillende ontwikkelingsprocessen die zich voordoen in deze tijden. Tijdens de normale ontwikkeling van de zebravis, zal de dooierzak geleidelijk afnemen in grootte als het embryo leeftijden 11. Daarom bij deze latere ontwikkelingsstadia (> 24 uur na de bevruchting), WISH kleuring is vrij eenvoudig te analyseren, omdat het embryo is groter in vergelijking met de aangrenzende dooierzak. Dit is echter niet het geval uit de staart knopstadium vroeg somitogenesis (wanneer de embryonalemassa rondom de dooier) wanneer de opake dooierzak soms obscure de visualisatie van de vlek. Bijgevolg is de wijze van vlakke montage werd ontwikkeld om te helpen verlichten de beeldvorming en gegevensanalyse problemen bij de karakterisering van vroege zebravis embryo monsters (schematisch in figuur 1 en figuur 2), en is algemeen gebruikt sinds de systematische fenotypering van genetische mutaties geïsoleerde van de eerste grootschalige genetische screens 21.

Sinds de komst van de vlakke montage techniek, heeft de analyse van de vroege ontwikkelingsstadia aanzienlijk verbeterd. Zodra de dooier wordt verwijderd uit het embryo, kan de embryo plat op een glasplaatje in de gewenste richting voor beeldvorming. Deze tweedimensionale positie stelt het bekijken van het gehele embryo tegelijk, waarbij de noodzaak om het monster te draaien elimineert. Talrijke weefsels bevinden zich in grote gebieden van de embryo, zoalsde voorlopers dat bloed en nieren vormen. Verder moet men om verschillende ontwikkelende weefsels vergelijken tegelijk. Vlakke montage kan de onderzoeker om gelijktijdig te bekijken het hele domein van zulke celgroepen, en kan dus sterk hulp kwantificeringen zoals een gebied meting voor een weefsel of cel-tellingen. Deze techniek heeft uiteindelijk geholpen leiden tot vele ontdekkingen met betrekking tot een aantal belangrijke ontwikkelingsstoornissen mechanismen die ten grondslag liggen hematopoiesis, neurogenese en organogenese. Dus, eenmaal onder de knie, de toepassingen voor dit eenvoudige techniek voor onderzoekers zijn vrij aanzienlijk.

Bijvoorbeeld, in een studie die lijn keuze tijdens hematopoiese, vlak zet bereidingen van zebravis embryo's op de 14 en 18 somiet stadium (ss) werden gebruikt om de veranderingen die het expressiepatroon van de PU.1 zinkvinger transcriptiefactor tussen illustreren wild-type en GATA1 morfolinogroep geïnjecteerde embryo's 22.Deze werkwijze staat de detectie van een uitgebreide PU.1 domein aan 18 ss geven dat GATA1 is waarschijnlijk de expressie van PU.1 in de tussenliggende celmassa (ICM) rond dit tijdstip. Aanvullend vast gemonteerde embryo's gekleurd voor verschillende erythroid genen waaronder gtpbp1 en epsin toonde een verlies in de expressie van deze genen in VLT mutanten die GATA1 waren - / -. Verdere analyses toonden geen verandering in de expressie van genen erythoid zoals biklf en testhymin waarvan bekend was dat onafhankelijk van gata activiteit. Daarom, in combinatie met hun andere experimentele resultaten werd aangetoond dat GATA1 essentieel bij het ​​reguleren van de differentiatie van cellen in de myelo-erytroïde afstammingslijn. In een studie van neurale ontwikkeling, werden plat mounts gebruikt om Crestin expressie onderzoeken in mont blanc (mob m610) mutanten in een studiehet onderzoeken van de rol van de Mont Blanc en tfap2a gen-functie 23. Op 10 en 20 ss, werd Crestin uitdrukking volledig ingetrokken in het hoofd en werd afgenomen in de kofferbak regio mob m610 mutanten in vergelijking met de normale wild-type expressie, uiteindelijk helpen deze groep aan te sluiten op het belang van de mont blanc en tfap2a regelgeving tijdens neurale vorming. Bovendien, in termen van organogenese, platte stroken hebben de ontdekking van de aanwezigheid van verschillende domeinen in de vroege renale progenitorcellen gebied tijdens de ontwikkeling van de zebravis embryonale nier, bekend als pronephros ingeschakeld. De zebravis embryo biedt een geconserveerd en toch anatomisch eenvoudig systeem om te bestuderen hoe de nier voorouders aanleiding geven tot het nefron functionele eenheden die de pronephros bestaan, een proces dat bekend staat als nefrogenese 6,7 (figuur 4). Flat mount analyse is nuttig document domeinen van re geweestNAL voorouders en om het resultaat van veranderingen in RA signalering ontleden tijdens pronephros patroonvorming van 6,7 (figuur 5), die eerder onbekend was. Tezamen bieden deze voorbeelden blijkt dat er inderdaad veel brede toepassingen voor deze flat monteren protocol in de studie van de diverse processen die optreden tijdens normale ontwikkeling en zieke staten.

Conceptueel, deze flat mount proces is redelijk eenvoudig in het algemeen. Echter, de manipulaties en de mate van finesse nodig is om deze methode onder de knie heel uitdagend om meester te zijn in de afwezigheid van visuele demonstratie. Daarom werd dit protocol opgesteld om onderzoekers, met name degenen die nieuw zijn de zebravis als model, met de mogelijkheid om beter te begrijpen hoe deze techniek uit te voeren en deel ons advies op de reagentia dat weefsel behandeling kunnen optimaliseren schakelen. Wij hopen dat dit protocol uiteindelijk zal toestaan ​​dat anderen in de gemeenschap om de meest ideale monstercondities verfijnen om u besed voor premium imaging, data-analyse, en de communicatie van hun resultaten in publicaties. Uiteindelijk moet deze onderzoekers toelaten om de anatomische belemmeringen van de zebravis tijdens vroege embryogenese te overwinnen, waarbij het voorleggen van experimentele resultaten verduisteren en lossen die door het gebruik van deze eenvoudige maar belangrijke techniek.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd mede ondersteund door financiering te RAW uit elk van de volgende: NIH subsidies K01 DK083512, DP2 OD008470 en R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar toekenning van een subsidie ​​# 5-FY12-75; opstarten fondsen van de University of Notre Dame College of Science and Department of Biological Sciences. We zouden vooral willen Elizabeth en Michael Gallagher bedanken, samen met het hele Gallagher Familie, die een gulle gift meegedeeld aan de Universiteit van Notre Dame te bevorderen stamcelonderzoek. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript. Wij danken de medewerkers van de afdeling Biologische Wetenschappen voor hun steun, en het Centrum voor Onderzoek zebravis in Notre Dame voor hun uitstekende inzet in de zorg en het welzijn van onze zebravis kolonie. Tot slot danken wij de leden van onze research lab voor hun opmerkingen, discussies en inzichten over dit werk, zoalsevenals Goudsbloem (Maripooka) en Zinnia Wingert voor het verstrekken van nature werpen katachtige snorharen aan de meest uitstekende lash gereedschappen voor ons onderzoek te maken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 X E3 250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.
1 X E3 Dilute 50 X E3 in distilled water.
Mesh tea strainer English Tea Store SKU #ASTR_KEN, MPN#1705
Embryo incubation dish Falcon 35-1005
Transfer pipette Samco 202, 204
Flat bottom microcentrifuge tube VWR 87003-300; 87003-298
Glass vial Wheaton 225012
1x PBST 0.1% Tween-20 detergent in 1x PBS, made by diluting 10x PBS in distilled water.
Tween-20 stock American Bioanalytical AB02038
10x PBS American Bioanalytical AB11072
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 19210
4% PFA/1X PBS Dissolve 4% PFA (w/v) in 1x PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 °C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.
Filter sterilization unit Corning 430516 1 L filter system, 0.45 μm CA
MeOH Sigma 34860-4L
Proteinase K Roche 03-115-879-001 Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/ml) and store aliquots at -20 °C.
HYB+ 50% formamide, 5x SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/ml yeast torula RNA, 50 μg/μl heparin
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents Roche 11175025910; 11685619910 Refer to manufacturer instructions.
SP6 RNA polymerase Roche 11487671001
T7 RNA polymerase Roche 10881775001
T3 RNA polymerase Roche 11031171001
RNase 1 inhibitor Roche 3335399001
DNase 1 inhibitor, 10x DNase 1 buffer Roche 4716728001
Glycogen Roche 10901393001
Ethanol (EtOH) Sigma E7023 Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 °C.
Molecular grade distilled water Mediatech 25-055-CM
Waterbath Thermo 51221073 Model 2831
Nanodrop Thermo ND-2000c
Formamide American Bioanalytical AB00600 Store at -20 °C.
20x SSC American Bioanalytical AB13156
MAB 2 L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 ml of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.
MABT MAB + 0.1% (v/v) Tween-20
Block solution We make in 50 ml fresh aliquots: 10 ml of BSA (from 10% lab stock), 5 ml of FCS (from stock), and 35 ml of MABT. Save unused block at 4 °C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 °C–if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).
FCS (fetal calf serum) stock Invitrogen 16140089 Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 °C.
BSA (bovine serum albumin) stock American Bioanalytical AB00448 Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 °C. Store undissolved BSA flakes at 4 °C.
Anti-digoxigenin antibody Roche 11-093-274-910 Store at 4 °C.
Anti-fluorescein antibody Roche 11-426-338-910 Store at 4 °C.
12-well staining dish BD-Falcon 35-3225
Pre-staining buffer 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.
Staining solution-purple For every 10 ml needed: add 45 μl of NBT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
Staining solution-red For every 10 ml needed: add 31.5 μl of INT and 35 μl of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).
NBT stock Sigma N6876 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 70% DMF, 30% water.
INT stock Sigma I8377 Stored at -20 °C; powder diluted 55 mg/ml in 70% DMF, 35% water.
BCIP stock Sigma B8503 Stored at -20 °C; powder diluted 50 mg/ml in 100% DMF.
DMF (dimethylformaldehyde) American Bioanalytical AB00450
Glycine Sigma G8898 0.1 M glycine, pH 2.2
Small plastic Petri dish Corning 430589, 430588
Glycerol Sigma G7893
Fine forceps Roboz RS-1050 Dumont Tweezers Pattern #55
Lash tool Constructed by affixing a suitable lash to a pipette tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipette tip). The pipette tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g., Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.
Glass slide Thermo-Fisher 4445 White Frost
Glass coverslip Thermo-Fisher 12-540A 18 x 18 mm
Modeling clay Hasbro Playdoh Other craft modeling clay products can be substituted.
Slide holder Thermo-Fisher 12-587-10 Cardboard tray to store slides flat.
Stereomicroscope Nikon SMZ645, SMZ1000
Compound microscope Nikon 80i, 90i

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Laale, H. W. The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review. J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).
  2. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).
  4. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  5. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  6. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet 3. , (1922).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  9. Tamplin, O. J., et al. Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies. WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).
  10. Westerfield, M. The Zebrafish Book. 3rd ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
  11. Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).
  13. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).
  14. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).
  15. Moens, C. Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting. CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).
  16. Machluf, Y., Levkowitz, G. Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).
  17. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. 25 (25), (2009).
  18. Lauter, G., et al. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).
  19. Lauter, G., et al. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).
  20. Lagendijk, A. K., et al. Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues. Biol Open. 1, 566-569 (2012).
  21. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  22. Galloway, J. L., et al. Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos. Dev Cell. 8, 109-116 (2005).
  23. Barrallo-Gimeno, A., et al. Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function. Development. 131, 1463-1477 (2003).

Tags

Developmental Biology dieren gewervelde dieren vissen zebravis groei en ontwikkeling morfogenese de embryonale en foetale ontwikkeling organogenese natuurwetenschappen embryo ganse berg platte berg deyolking imaging
Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N.,… More

Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604, doi:10.3791/51604 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter